Fin nål aspiration är en teknik, varvid celler erhålls från en lesion eller orgel med en tunn nål. Aspireras material smetas, färgas och undersöks under ett mikroskop för diagnos eller används för molekylär biologi, cytometri eller in vitro-analys. Det är billigt, enkelt, snabbt och orsakar minimalt trauma.
Fin nål aspiration (FNA) är ett rutinmässigt diagnostiskt förfarande som är avgörande för både medicinsk och veterinärpraxis. Den består av perkutan aspiration av celler och/eller mikroorganismer från påtaglig massa, organ eller effusioner (vätskeansamling i en kropp hålighet) med en tunn nål som liknar den vanliga nålen används för venösa punktering. Det material som samlas in av Fna är i allmänhet mycket cellulära, och den hämtade aspirera är sedan utsmetad, lufttorkad, våt-fast, färgade och observeras under ett mikroskop. I det kliniska sammanhanget är FNA ett viktigt diagnostiskt verktyg som fungerar som en guide till lämplig terapeutisk hantering. Eftersom det är enkelt, snabbt, minimalt invasiva och kräver begränsade investeringar i laboratorium och mänskliga resurser, är det i stor utsträckning används av veterinär utövare, främst i inhemska, men även i husdjur. I studier med djurmodeller, FNA har fördelen att det kan utföras upprepade gånger i samma djur, möjliggör longitudinella studier genom insamling av celler från tumörer och organ/vävnader under loppet av sjukdomen. Förutom rutinmässig mikroskopi kan även det hämtade materialet användas för immunocytokemi, elektronmikroskopi, biokemisk analys, flödescytometri, molekylärbiologi eller in vitro-analyser. Fna har använts för att identifiera den protozoska parasiten Trypanosoma rhodesiense i gonaderna av infekterade möss, vilket öppnar möjligheten för en framtida diagnos hos nötkreatur.
Fin nål aspiration (FNA) används ofta vid diagnos av cancer och icke-neoplastiska sjukdomar, både hos människor och husdjur. Tekniken har standardiserats under årens lopp och beskrivs i ett flertal läroböcker1,2.
Det består till stor del av den perkutan aspiration av påtaglig massa, organ eller effusioner med en tunn nål monterad på en tom spruta, med hjälp av det negativa trycket att dra celler eller vätska från massan1,3. Nålar är typiskt 22 till 25 G (mätare som motsvarar nålen innerdiameter), och användningen av en större bar nål (stor diameter, e.g., 21 G) är till hjälp för att öka cellularitet, även om detta kan producera överdriven blod förorening. Nål längd beror på djupet av massan men 1 eller 11/2 tum används ofta för ytliga massorna. Sprutor är typiskt 5 till 10 mL, med större sprutor uppnå högre vakuum, vilket i sin tur ökar aspirera avkastning. Icke-palpable djupt sittande massorna kan också aspireras, med längre nålar och under bild vägledning (ultraljud). Den hämtade aspirera kan sedan smetas, lufttorkas, våt-fixas, färgas och observeras under ett mikroskop för att uppnå en diagnos3 (figur 1).
Detta är en enkel, billig, smärtfri och minimalt invasiv teknik som främst används i preoperativ inställning för att uppnå en diagnos på påtaglig massa och även för organ, som lymfkörtlar, sköldkörtel, prostata eller till och med de externa manliga reproduktions strukturer 1. Förutom att vara ett diagnostiskt verktyg, kan denna teknik användas för insamling av celler för andra ändamål samt, nämligen cytogenetik, elektronmikroskopi (figur 1d), flödescytometrisk karaktärisering4,5 ,6,7, etablering av cellkulturer8. Ett vanligt exempel i klinisk praxis är spermie hämtning för in vitro fertilisering9.
Aspiration kan upprepas flera gånger i samma massa för att få flera smetar. Vid en heterogen lesion, t ex ett fast område och ett cystiskt utrymme, är det viktigt att cellerna är aspirade från varje region. Det material som samlas in av FNA är i allmänhet mycket cellulära, vilket i de flesta fall möjliggör diagnos av sjukdomar utan behov av en vävnad biopsi. Speciella fläckar, immunofluorescens. immunocytokemi (figur 1d), och molekylära tekniker kan också utföras i utstryk som erhålls genom Fna, t. ex., för identifiering av infektiösa agens när den inte kan identifieras med enbart morfologi10. En kort översikt över de allmänna tillämpningarna och av den utrustning och de förnödenheter som behövs för FNA sammanfattas i tabellerna 1 respektive 2.
Den första rapporten om användningen av nålen punktering för diagnostiska ändamål beskrivs i tidiga skrifter av arabisk medicin, men det är i början 20th Century att moderna nål aspiration tekniker genomfördes11. Särskilt, kanske den första rapporten som antyder användning av Fna för diagnos av infektionssjukdomar var en studie i 1904, där Grieg och grått rapporterade nål ambitioner lymfkörtlar från patienter med sömnsjuka avslöjade rörliga innebörder12 . Författarna rapporterade närvaron av innebörder i både tidiga och avancerade fall, och vid en högre densitet än den som ses i blodets fläckar, där dessa är ofta sällsynta händelser12.
Aktuell diagnos av trypanosomiasis hos nötkreatur förlitar sig på direkt observation av parasiter i blodet, lymfa eller i diagnostiska tekniker13,14,15. Vi har tidigare visat att i experimentella Trypanosoma infektioner i musen, Trypanosoma rhodesiense (T. rhodesiense) har en anmärkningsvärd tropism att fettvävnad16 och även till några av de externa manliga reproduktiva strukturer, nämligen bitestiklarna17. Parasiter ackumuleras i stroma av dessa vävnader i stort antal16.
Det protokoll som beskrivs nedan beskriver ett detaljerat steg-för-steg-tekniskt förfarande för Fna i levande möss, som syftar till att aspirera på innebörder som finns i de externa manliga reproduktions strukturerna (testiklarna, epididymis och epididymalt fett), följt av konventionell cytologi och immunofärgning för specifika parasit proteiner (VSG)16,17. Aspiration utfördes 6 dagar efter den infektion och säkerhetsrutiner som gäller är de som vanligen fastställts för rutinmässig hantering av försöksdjur. Ytterligare åtgärder krävs för djur som har immunbrist (klädd i en ång-steriliserad klänning, mask, hår Bonnet, sterila handskar, och säkerställa aseptisk teknik hela tiden) för att minska oavsiktlig exponering för opportunistiska patogener.
Fin nål aspiration (FNA) är en metod som ofta används för att diagnostisera sjukdom hos människor och husdjur. Tekniken har standardiserats under många år1,2, somanvänder sig av en liten bar nål för att aspirera celler eller vätska från en påtaglig massa eller orgel1,3. Aspirationen är sedan typiskt utsmetad på en glas rutschbana och färgas för mikroskopisk observation för att uppnå en diagnos, men tekniken kan också användas för att hämta celler för andra ändamål4,5,6, 7 , 8 , 9.
Förfarandet är snabbt (< 5 min per mus, för en erfaren forskare) och risken för komplikationer är minimal, liknande den risk som uppstår när genomgår enkel venös punktering. Av denna anledning, för FNA av påtaglig massa, anestesi krävs endast för känsliga anatomiska platser eller när en bra immobilisering av djuret och stabilisering av orgeln eller massan som aspireras är oerhört viktigt för optimala resultat. Detta är vanligt för små försöksdjur, som säker och effektiv återhållsamhet av en liten gnagare med en hand samtidigt som den bästa tillgång till området för aspiration med den andra handen, är svårt att uppnå utan anestesi. Kortsiktig anestesi är i de flesta fall tillräckligt, icke desto mindre nödvändigt, för ett bra FNA i musen. En bra immobilisering maximerar chanserna att få en aspirera som är representativ för de cellulära komponenterna i lesionen och minimerar också chanserna att externalizing spetsen av nålen medan negativt tryck appliceras.
Även om förfarandet i sig är mycket enkel, samordnad tillämpning och utsläpp av vakuum är de mest kritiska stegen. Efter insättning av nålen, är sprutkolven indragna för att uppnå ett kontrollerat vakuum (sug), och nålen kan endast avlägsnas från massan efter att ha släppt det negativa trycket genom att släppa kolven (figur 2); annars aspirera sugs in i fat av sprutan och är då mycket svårt att återhämta sig. Ett annat mycket viktigt steg är utarbetandet av högkvalitativa utstryk. Det finns olika metoder för att göra ett utstryk men oavsett metod bör smeten förberedas omedelbart efter det att materialet har placerats på glaset. Det biologiska materialet bör spridas ut försiktigt för att undvika cell-krossa artefakter. Användning av en täckslip som spridaren kan hjälpa till att förhindra dessa artefakter. Men tillämpningen av för mycket kraft samtidigt som smeta kommer att bryta täckslip. En god kvalitet smeta typiskt har de flesta av cellpopulationen distribueras som enskiktslager så att de lätt kan överföra ljus. Cellulärt material bör inte vara överdrivet instängd i blodpropp.
Målet med ett FNA är att samla in celler från en massa, vävnad eller orgel. Användningen av större hål nålar är till hjälp för att öka cellularitet, men kan associeras med överdriven blod förorening, medan provtagning med mindre nålar ger högre kvalitet, men mindre riklig material. I vårt fall, perkutan aspiration av externa manliga reproduktions strukturer hos möss experimentellt infekterade med T. rhodesiense, utfördes med 22-gauge nålar kopplade till en 5 ml spruta. Möss var sövda, testiklarna stabiliserades med en hand och punktering och aspiration guidade och utförs med andra handen. Vi hämtade många innebörder blandas med könsceller, spermatozoer, epitelceller och stromaceller, som var insmorda och immunostained för parasiternas yta proteiner (VSG) (figur 4).
Det finns alltid den potentiella provtagning fel i nasofarynxaspirat ger negativa resultat eftersom även om flera områden av en given lesion kan samplas flera gånger, detta är en blind ambition där vi inte visualisera nålspetsen och mål organ eller massa. Detta är ytterst relevant i en klinisk miljö, där en negativ FNA av en misstänkt lesion inte undanröja ytterligare utredningar, men det är inte så relevant i djurmodeller av sjukdom. Allmänna begränsningar omfattar således huvudsakligen falskt negativa resultat, och mindre frekvent positiva resultat (t. ex. från blod förorening), men den viktigaste begränsningen vid djurförsök är bristen på information om vävnads arkitektur17, som vi har med histopatologi, t. ex. spridningsmönster av parasiter, av immunceller, och cell-cell interaktions funktioner. Icke desto mindre, fördelar är att FNA är en icke-terminal förfarande som möjliggör upprepad provtagning i samma djur över tid och alltid möjliggör bättre bevarade cellulära morfologi (figur 5). Alternativ till FNA för skörd av värdceller, immunceller eller mikroorganismer från en mus alltid förlita sig på euthanizing musen för att samla in massa eller organ av intresse.
Till vår kännedom finns det bara ett fåtal rapporter om användningen av FNA i små försöksdjur, en från 1949 som motsvarar aspiration av benmärg med 22 G nål för att studera hematopoies18, och alla andra i kombination med flödescytometri till kvantifiera antingen tumör-associerade inflammatoriska celler eller endotelceller7,19,20. Vårt arbete visar att denna teknik kan utvidgas till diagnos och studier av infektions sjukdomsmodeller och kan kombinera cytologi med tekniker som immunocytokemi eller elektronmikroskopi. Två av de stora fördelarna med metoden i försöksdjur är: (1) detta förfarande är inte Terminal, dvs kan utföras i levande möss; och (2) på grund av dess milda svårighetsgrad det möjliggör seriella ambitioner i samma djur. Därför krävs färre möss för varje studie, och sambandet mellan progression av klinisk sjukdom och utvecklingen av cellulära och molekylära egenskaper hos en sjukdom och/eller mikroorganism kan enkelt utföras, vilket möjliggör longitudinella studier.
Kanske den första rapporten om användningen av Fna för att diagnostisera en infektionssjukdomar är en studie av Grieg och Gray i 1904 som rapporterar nål ambitioner lymfkörtlar från patienter med sömnsjuka, som avslöjade rörliga innebörder12. Om våra fynd i laboratoriemöss hitta översättning till nötkreatur, dvs, att om Trypanosoma lätt kan samplas av Fna från den externa manliga reproduktions strukturer, man kan förvänta sig att denna teknik kommer att vara till nytta för veterinärer för att diagnostisera djur trypanosomiasis i-gård, i boskap.
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt finansierades av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino Superior (MCTES) genom fundos do Orçamento de Estado (Ref.: ID/BIM/50005/2019). LMF är en utredare av Fundação para a Ciência e Tecnologia (IF/01050/2014) och laboratoriet finansieras av ERC (FatTryp, Ref. 771714). Publiceringen av detta arbete finansierades också UID/BIM/50005/2019 projekt finansierat av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino Superior (MCTES) genom fundos do Orçamento de Estado. Vi tackar Andreia Pinto från histologin och jämförande patologi laboratoriet för iMM för expert elektronmikroskopi bistånd, och Sandra Trindade, Tiago Rebelo och Henrique Machado (iMM) för att dela vävnader från infekterade möss.
Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL) | Bio 2 | 7418046 | Anesthesia reversal |
Cover slips (24 x 60 No.1) | VWR | 631-0664 | Smear making |
DAB | Dako | K3468 | Immunocytochemistry |
Entellan (500 mL) | VWR | 1.07961.0500 | Mounting media |
Envision Flex antibody diluent | Dako | 8006 | Immunocytochemistry |
EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit) | Dako | K4010 | Immunocytochemistry |
Envision Flex Wash Buffer | Dako | K8007 | Immunocytochemistry |
Giemsa stain | Atom Scientific Ltd | RRSPSS-A | Smear staining |
Glass slides (Superfrost Plus) | VWR | 631-9483 | Smear making |
Harris Haematoxylin | Bio-optica | 05-06004E | Immunocytochemistry |
Hydrogen Peroxidase solution | Sigma | H1009-500ML | Immunocytochemistry |
Hypodermic needles Microlance 3 (23G) | Henry Schein | 902-8001 | Aspiration technique |
Ketamin (IMALGENE 1000 – 10 mL) | Bio 2 | 7410928 | Anesthesia |
Medetomidine (DOMITOR 10 mL) | Bio 2 | 7418335 | Anesthesia |
Methanol | Merck | 1.06009.2511 | Smear fixative |
Pap pen | Merck | Z377821-1EA | Immunocytochemistry |
Protein Block Serum free | Dako | X0909 | Immunocytochemistry |
Syringes (5 mL, 10 mL) | Henry Schein | 900-3311, 900-3304 | Aspiration technique |