Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Ince Iğne aspirasyonu ile Ekstrasovasküler Trypanosoma parazitlerin tespiti

doi: 10.3791/59798 Published: August 7, 2019

Summary

İnce Iğne aspirasyonu bir tekniktir, bu sayede hücreler ince bir iğne kullanarak bir lezyonun veya organdan elde edilir. Aspirated malzeme bulaşmış, lekelenmiş ve tanı için bir mikroskop altında incelenmiştir veya moleküler biyoloji, sitometri veya in vitro analiz için kullanılır. Ucuz, basit, hızlı ve minimal travma neden olur.

Abstract

İnce Iğne aspirasyon (FNA) tıbbi ve veteriner uygulamaları için gerekli rutin bir tanı prosedürdür. Venöz delinme için kullanılan normal iğneye benzer ince bir iğne kullanarak, palpe kitleler, organlar veya efüzyon (Vücut boşluğunda sıvı birikimi) ile hücrelerin ve/veya mikroorganizmaların perkütan aspirasyonu oluşur. FNA tarafından toplanan malzeme genel olarak son derece hücresel, ve alınan aspirat sonra bulaşmış, hava kurutulmuş, ıslak-sabit, lekeli ve mikroskop altında gözlenen. Klinik bağlamda FNA, uygun terapötik yönetim için bir kılavuz olarak hizmet veren önemli bir tanı aracıdır. Çünkü, basit, hızlı, minimal invazif ve laboratuar ve insan kaynaklarına sınırlı yatırım gerektirir, bu yaygın veteriner uygulayıcıları tarafından, yerli çoğunlukla, aynı zamanda çiftlik hayvanlarda kullanılır. Hayvan modelleri kullanarak çalışmalarda, FNA aynı hayvan içinde tekrar tekrar yapılabilir avantajı vardır, tümör ve organlar/dokulardan hücre toplama yoluyla hastalığın seyri boyunca uzunlamasına çalışmalar sağlayan. Rutin mikroskopi ek olarak, alınan malzeme de immunsitokimya, elektron mikroskobu, biyokimyasal analiz, akış sitometri, moleküler biyoloji veya in vitro asder için kullanılabilir. Fna enfekte fareler gonadlar protozoon paraziti tripanosoma brucei tanımlamak için kullanılmıştır, sığır gelecekteki bir tanı için olasılığını açma.

Introduction

İnce Iğne aspirasyonu (FNA), hem insan hem de yerli hayvanlarda kanser ve neoplastik olmayan hastalıkların tanısında yaygın olarak kullanılmaktadır. Teknik yıl içinde standardize edilmiştir ve çok sayıda ders kitapları1,2açıklanmıştır.

Büyük ölçüde, boş bir şırınga üzerine takılı ince bir iğne ile palpe kitleler, organlar veya efüzyon perkütan aspirasyon oluşur, kütle1,3hücre veya sıvı geri çekmek için negatif basınç kullanarak. İğneler genellikle 22-25 G (iğne iç çapına karşılık gelen ölçer), ve daha büyük bir delik iğne kullanımı (büyük çap, örn., 21 G) Bu aşırı kan kontaminasyonu üretebilir rağmen, selülarite artırmak için yararlıdır. İğne uzunluğu kütle derinliğine bağlı olacaktır ama 1 veya 11/2 inç yaygın yüzeysel kitleler için kullanılır. Şırınga genellikle 5 ila 10 mL, daha büyük şırıngalar daha yüksek vakum elde ile, hangi sırayla aspirat verim artar. Uzun iğneler ve görüntü kılavuzluğu (ultrasonografi) altında, palpe edilmeyen derin kitleler de aspirasyonlu olabilir. Alınan aspirat daha sonra bulaşmış olabilir, hava kurutulmuş, ıslak-sabit, lekeli ve bir tanı elde etmek için mikroskop altında gözlenen3 (Şekil 1).

Bu basit, ucuz, ağrısız ve minimal invazif bir tekniktir, ağırlıklı olarak, preoperatif ortamda, lenf nodları, tiroid, prostat ve hatta dış erkek üreme yapıları gibi, palpe kitlelere ve aynı zamanda organlar üzerinde bir tanı elde etmek için kullanılır. 1. Tanı Aracı olmanın yanı sıra, bu teknik diğer amaçlarla hücreler toplanması için de kullanılabilir, yani sitogenetik, elektron mikroskobu (Şekil 1D), akış cytometrik karakterizasyonu4,5 ,6,7, hücre kültürlerinin kurulması8. Klinik uygulamada yaygın bir örnek, in vitro fertilizasyon için sperm alımı9.

Aspirasyon birden smear elde etmek için aynı kütlede birkaç kez tekrarlanabilir. Heterojen bir lezyon, örneğin bir katı alan ve kistik bir alan durumunda, hücrelerin her bölgeden aspirasyon olması önemlidir. FNA tarafından toplanan malzeme genel olarak yüksek hücresel, çoğu durumda bir doku biyopsisi gerek kalmadan hastalıkların tanısı için izin verir. Özel lekeler, immünofluorescence. immünositoz (Şekil 1D), ve moleküler TEKNIKLER de Fna ile elde edilen smear, örneğin, bulaşıcı ajanların tanımlanması için tek başına morfoloji tarafından tanınmaz yapılabilir10. Genel uygulamalar ve FNA için gereken ekipman ve sarf malzemelere kısa bir bakış sırasıyla Tablolar 1 ve 2' de özetlenmiştir.

Tanı amaçlı iğne delinmesi ile ilgili ilk rapor Arap tıbbının erken yazılarında açıklanmıştır, ancak 20. yüzyılın başlarında modern iğne aspirasyon teknikleri11' de uygulanmıştır. Özellikle, bulaşıcı hastalıkların tanısı için FNA kullanımını öneren ilk rapor 1904 bir çalışma oldu, nerede Grieg ve Gray uyku hastalığı olan hastalarda lenf nodlarının iğne arzları bildirildi motil tripanosomes ortaya12 . Yazarlar, hem erken hem de gelişmiş olgularda tripanosomların varlığını bildirdi ve kan smear, bu sıklıkla nadir olaylar12görülme daha yüksek bir yoğunlukta.

Sığır trypanosomiasis mevcut tanısı kan, lenf veya immünotanı teknikleri13,14,15parazitlerin doğrudan gözlem dayanır. Biz daha önce göstermiştir ki deneysel Trypanosoma enfeksiyonları fare, tripanosoma brucei (T. brucei) yağ dokusu16 ve ayrıca bazı dış erkek üreme yapıları için dikkat çekici bir tropizm vardır, Yani epididim17. Parazitler bu dokuların stroma büyük sayılar16birikir.

Aşağıda tasvir edilen protokol, dış erkek üreme yapılarında (testis, epididymis ve epididimal yağ) bulunan tripanosomların aspirasyonu amaçlı canlı farelerde Fna için ayrıntılı bir adım adım teknik prosedür açıklar, ardından spesifik parazit proteinleri için Konvansiyonel sitoloji ve immünostasyon (VSG)16,17. Aspirasyon, deneysel hayvanların rutin olarak işlenmesi için yaygın olarak kurulan enfeksiyon ve güvenlik prosedürlerinden 6 gün sonra yapılmıştır. Ek önlemler bağışıklık eksiklikleri olan hayvanlar için gereklidir (bir buhar sterilize elbise giyen, maske, saç kaputu, steril eldiven, ve her zaman aseptik tekniği sağlayarak) fırsatçı patojenlere kazara maruz kalma azaltmak için.

Protocol

Bu protokoldeki tüm hayvan deneyleri AB yönetmeliklerine göre yapılmıştır ve Instituto de Medicina moleküler (ımm) hayvan etiği Komitesi (AEC_2011_006_LF_TBrucei_IMM) tarafından onaylanmıştır. Imm 'nin hayvan tesisi, laboratuar hayvanlarının kullanımı için Portekiz yasalarına uygundur (hüküm-hukuk 113/2013) ve Avrupa Direktifi 2010/63/EU ve FELASA (Avrupa laboratuar hayvan Bilimi Dernekleri Federasyonu) yönergelerini takip eder ve Laboratuar hayvan refahı ile ilgili öneriler.

1. Mouse 'un dış erkek üreme organlarından parazitlerin aspirasyonu

Not: İnce iğne aspirasyonu (FNA), daha önce16' da açıklandığı gibi 2.000 parazitler Ile 200 μL serum intraperitoneal enjeksiyon yoluyla T. brucei ile enfekte, 6 ila 10 haftalık, vahşi tip erkek C57BL/6J fareler yapılmıştır.

  1. Dış erkek üreme organlarının FNA için, bir laminar akış kaput içinde fare yer, bir intraperitoneal enjeksiyon ile hayvan anestezitik 200 μL bir karışımı 75 mg/kg ketamin + 1 mg/kg salin içinde Medetomidine.
    1. Ayak tutam yöntemi ile anestezizasyon onaylayın. Bacağın geri çekilme refleksi yok olduğunda, fare dorsal reumbency içinde konumlandırın (Şekil 2a).
    2. Dikkatle testis palpe, boyut ve mesafe overyalan cilt değerlendirmek. İndeks ve orta parmak veya parmak ve başparmak arasında organ restrain. Hedef hareketsiz daha fazla kütle üzerinde sıkıca overyalan cilt Stretch. Yüzeyi alkol mendilleri ile temizleyin (Şekil 2a).
    3. Monte edilen 22 G iğne ve 5 mL şırıngayı tutun ve iğne ucunu her zaman geri kalan durumdaki pistonlu (Şekil 2B-C) ile hedefe takın.
    4. Şırınga pistonu 4 mL 'ye 5 mL işaretine 2-3 kez geri çekerek emiş uygulayın. Bir temsili örnek olasılığını artırmak ve epididymis gibi küçük yapıları hedefleme, düz bir çizgi ya da birkaç farklı teğinler boyunca organ içinde iğne yeniden yönlendirmek. Doku hasarını en aza indirmek için bu prosedürün nazik olduğundan emin olun (Şekil 2C-D).
    5. Emici bırakın ve sonra iğne geri. Bu şırınga varil içine Aspire emme yol açacaktır ve onun kurtarma (Şekil 2e) geri çekişli piston ile iğne yeniden çizmek etmeyin. İğne çekildikten sonra, delinme bölgesinde sterilize edilmiş bir gazlı bez süngeriyle basınç uygulayarak herhangi bir kanama kontrol.
    6. Şırınga iğne çıkarın, hava ile doldurun, iğne yeniden ve hafifçe bir slayt üzerine iğne içeriğini çıkarın. İğne ucunu çok yakın veya slaytta bile splattering (Şekil 2F) önlemek için yerleştirin.
    7. Çoğaltma örnekleme sağlamak için organ/hayvan başına en az bir ek aspirasyon gerçekleştirin.
    8. 200 μL 1 mg/kg atipamezol ve geri alma ve tam iyileşme kadar gözlemlemek için onların ev kafesi için hayvan iade bir Subkutan Enjeksiyon ile anestezi geri dönün.

2. aspirated malzemeden smear hazırlığı

Not: Prosedür boyunca eldiven kullanın ve iğneler ve şırıngalar güvenli bertaraf sağlamak.

  1. İki adım çekme yöntemi
    1. Baskın olmayan eli kullanarak aspirat damlası olan slaytı alın ve buzlu ucunu başparmak ve parmak parmağı arasında tutam (Şekil 3A).
    2. Baskın el ile ikinci bir temiz slayt, serpme slayt almak ve aspirate damla ile ilk slayt boyunca getirmek. Slaytın pürüzsüz temiz kenarını, sadece yaklaşık 30 ° ' lik bir açıyla (Şekil 3B) damla üstündeki numune kaydırağı üzerine yerleştirin.
    3. İnce bir film elde etmek için tek bir ışık, sürekli ve sabit hareket ile slaytı ileriye doğru kaydırın (Şekil 3c).
    4. Slaytta dinlenin ve malzemenin komple ve hızlı hava kurutulması için izin verin (şekil 3D). Isıtmayın. Slayttaki buzlu kenarı bir kalem ile etiketleyin.
      Not: Protokol bu adımda duraklatılabiliyor ve smear, lekelenmeye hazır olana kadar süresiz olarak depolanabilir.

3. smear boyama

Not: Prosedür boyunca eldiven kullanın ve adımları 3.1.4 ve 3.2.9 bir duman kaputu içinde gerçekleştirilir emin olun.

  1. Giemsa boyama Protokolü
    1. 5 dakika (Şekil 3E) için 100% metanol Içeren bir Coplin kavanozu içine slaytlar daldırarak hava kurutulmuş smear düzeltin.
    2. Slaytı% 20 Giemsa çözeltisi içeren bir Coplin kavanozuna aktarın (1/5 ila distile su içinde seyreltilmiş), 30 dakika veya% 10 Giemsa (Şekil 3F).
    3. Musluk suyu durulayın ve DAB için doku kağıdı kullanarak iyice kuru.
    4. Slaytı yatay olarak tutun ve sulu olmayan montaj ortamını smear üzerine bir damla uygulayın. Bir kapak-camın kenarını slayta yerleştirin, aşağı kaydırın ve herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için hafifçe bastırın.
  2. Fna smear içinde immünositokimya
    1. 10 dakika boyunca oda sıcaklığında% 100 metanol içinde hava kurutulmuş smear düzeltin.
    2. Her seferinde yeni 1x PBS kullanarak bu adımı 3 kez yineleyen 1x fosfat tampon (PBS) ile bir Coplin kavanozunda 5 dakika boyunca slaytı yıkayın.
    3. Slayt Coplin kavanozu çıkarın, smear dokunmadan aşırı tampon silin ve bir su itici kalem (malzeme tablosu) ile smear etrafında bir daire çizin.
    4. Slaytı yatay tutun ve her smear için seyreltilmiş primer antikor çözeltisi 150 μL uygulayın ve oda sıcaklığında 1 saat boyunca inküye yapın.
      Not: Burada kullanılan primer antikor olmayan bir saf tavşan Serum Anti-t. brucei VSG13 antijen (çapraz-birçok T. brucei vsgs ile reaktif, üretilen içinde-ev), 1x PBS içinde 1:50000 seyreltilmiş. İkincil antikor spesifik olmayan bağlamanın değerlendirilmesi için izin vermek için preimmün serum (malzeme tablosu) ile uygun primer antikor değiştirerek negatif kontroller gerçekleştirin.
    5. Her seferinde yeni 1x PBS kullanarak bu adımı 3 kez yineleyen 1x PBS ile bir Coplin kavanozunda 5 dakika boyunca slaytı yıkayın.
    6. Slaytı yatay olarak tutun ve her smear için ticari olarak kullanılabilen horserturpu Peroxidase/DAB görselleştirme sistemi 150 μL 'yi uygulayın. Oda sıcaklığında 30 dakika (malzeme tablosu) için inkübe.
    7. 1x PBS 'de 5 dakika boyunca 3 kat yıkayın.
    8. Harris hematoxylin içeren bir Coplin kavanozu içine slaytlar daldırarak counterstain. Musluk suyunda durulayın ve kağıt kullanarak iyice kurutun.
    9. Slaytı yatay olarak tutun ve sulu olmayan montaj ortamını smear üzerine bir damla uygulayın. Bir kapak-camın kenarını slayta yerleştirin, aşağı kaydırın ve herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarmak için hafifçe bastırın.

Representative Results

FNA, 5 mL şırıngaya bağlı 22 G iğne ve smear hazırlığı için cam kaydırakları (Şekil 1a-C) kullanarak T. brucei ile enfekte farelerin dış erkek üreme organlarında gerçekleştirildi. Yöntem basittir, ancak optimum sonuçlar kritik adımlara dayanır: genel anestezi yoluyla elde edilen fareyi mükemmel immobilizasyon ve tüm prosedür boyunca organların stabilizasyonu (Şekil 2a-B). Emiş 2-3 kez uygulandı ve iğne 1-2 kez yönlendirildi, küçük organlar ve dokuların temsili örnekleme için izin vermek için: epididim ve epididimal yağ. İğne dışa önce negatif basınç serbest bırakıldı. 2 smear (Şekil 3A-C) üretmek Için (yaklaşık 20 μl) lümen ve iğne göbeğinde bulunan aspirat kullanılmıştır. İğne emiş salınımı olmadan geri çekildiği durumlarda, malzeme şırıngaya emilir ve geri kazanılamaz. Süreç başarıyla iki kez tekrarlanan, her eşleştirilmiş organ için bir tane. Kuruduktan sonra, smear ıslak-sabit ve immünsitokimya tripanosi yüzey proteinleri yapılmıştır.

İyi bir kalite smear (Şekil 4A-C) iyi hücresel yoğunluğu ile hücrelerin bir tek tabakalı ile karakterize edildi, hangi ana hücreler korunan morfolojik özellikleri göstermek, kökeni ve göreceli kendi doku tanımlaması için izin birbirleriyle orantılıdır. Parazitler etkili bir şekilde immuno-lekelenmiş, tanımlanabilir ve konmasa (Figure 4B). Doğrudan gözlem ve tanı için Giemsa ile lekelenmiş, enfekte bir fare bir periton efüzyon Fna bir olgu da gösterilir (şekil 3D-F ve Şekil 4c).

Kötü ya da negatif FNA sonucu farklı nedenlerden dolayı olabilir: (1) çok az FNA malzeme slayt üzerine ifade edilir ve örnek altında temsili; (2) çok fazla FNA malzeme tek bir slayt üzerine ifade edilir, aşırı kalın smear yapma ve sitolojik değerlendirme bozar; (3) çok fazla kuvvet smear yaparken uygulanır, ve hücreler bozulur, çıplak çekirdekler ve DNA çizgileri bir sürü sonuçlanan (Crush artifakı); ya da (4) smear ve hücrelerin parçalama yapmadan, hücrelerin morfolojik özelliklerinin değerlendirilmesini sağlayan bir tabakalı katmanla sonuçlanan yeterli kuvvet uygulanmaz (Şekil 5).

Biz, histopatoloji ile FNA sitopatolojisi karşılaştırmak, yani, hücrelerin dokulara karşı analizi, yumruk hücresel morfoloji daha iyi korunmuş ve bağıl oranlar ve hücrelerin sayımı daha iyi değerlendirilebilir avantajı vardır (Şekil 6). Ayrıca, immünositokimya, genellikle formalin-sabit ve parafin-gömülü doku içinde gerçekleştirilen immünhistokimya daha kolay, daha hızlı ve optimize etmektir.

Hedef Uygulama Avantaj -ları Sınırlama
Palpe edilen kitle Rutin mikroskopi, tanı Basit, hızlı Doku mimarisi yok
Organ İmmünohistokimya Düşük maliyetli Kör aspirasyon (iğne tangentially hedef kaçırabilir; aspirasyon nekrotik, kistik veya hemorajik alanları hedef olabilir)
Efüzyon Akış sitometri Birden fazla sitelerden örnekleme
Sitogenetik İyi korunmuş hücresel morfoloji
Elektron Mikroskopisi Komplikasyonlar ücretsiz
PCR, diğer moleküler teknikler Yüksek teşhis doğruluğu
Biyokimyasal analizler Anestezi (immobilizasyon için)
In vitro asder, hücre kültürü Terminal dışı prosedür

Tablo 1: hedef, genel uygulamalar, avantajları ve ince iğne aspirasyon sınırlama.

(Yok) Bir aspirasyon iğne ve şırınga Archetype
Aspirasyon: İğne parçaları:
1. tek kullanımlık plastik şırıngalar (5 veya 10 mL) (Şekil 1B) Bevel. İğne mili ucu bir nokta oluşturmak için eğimli olduğunu, eğim eğimli olmak. Sadece eğimli iğneler perkütan arzlar için uygundur.
3. iğne 22-25-Gauge (çap); 0,75, 1,0, 1,5 inç uzunluğunda, standart eğimli iğne ucu kenarı (Şekil 1a) Şaft. Uzunluğu kütle derinliğine göre ayarlanabilir iğne boş tübüler kısmı. İğne göstergesi şaft iç çapı (küçük iğneler daha yüksek ölçer var), onun delik çapına karşılık gelir. Daha büyük delik iğneler kullanımı (az 22 G) Bu aşırı iatrojenik kan kontaminasyonu üretebilir rağmen, selüloz artırmak için yararlıdır.
1. anestezi (gerekirse). Ağrı Fna ile ilişkili bir venöz delinme benzer, ancak, iyi aspirasyon, özellikle küçük ölçekli hayvanların ve/veya küçük, dalgalanma lezyonları ve organları için önemli, konu iyi immobilizasyon gerektirir. İt 'e bağlı fareler ve fareler uygun bir şekilde pasif olarak kısıtlanmış ya da gerektiğinde, sakinleştirici veya hafif genel anestezi altında olmalıdır. Hub. Şırınga bağlı iğne plastik kısmı; emişli malzemenin görselleştirme için izin vermek için şeffaf olmalıdır. FNA sırasında elde edilen aspirat malzemesi iğne şaftında toplanmalı ve hub 'a girerken malzeme görülmeye çalışırken aspirasyon durdurulmalıdır.
FNA smear yapma ve yorumlama: Şırınga parçaları:
1. buzlu uç cam mikroskop slaytlar (Şekil 1C) Varil/silindir. Şırınga boş kısmı. Kistik lezyonlar veya efüzyon ile ilgili olmadıkça, varil için emişli malzeme genellikle kurtarılamaz. Fna sitolojisi için Ideal aspirat hacmi yaklaşık 5 μL, iğne mili ve hub kaplar ortalama Aspire hacmine karşılık gelen.
2. Romanowsky tipi lekeler (örn. Diff-Quik, Giemsa) Bahşiş. İğne Hub bağlı olduğu varil sonu.
3. mikroskop (parlak alan) Pistonlu. Bir ucunda düz bir disk veya dudak ve diğer ucunda bir kauçuk mühür olan şırınga hareketli kısmı. Varil içine uyuyor ve basınç hücreleri çizmek için sağlar, iğne içine sıvı. İyi negatif basınç oluşturan mükemmel mühürlü bir piston, iyi bir aspirat verimi elde etmek için zorunludur.

Tablo 2: ince iğne aspirasyonu için gerekli ekipman ve sarf malzemeleri.

Figure 1
Şekil 1 : İnce iğne aspirasyonu Için Araçlar ve sonuçlar. (A) Fna için iğne ideal çapı 22 G. (B) iyi bir Aspire verim elde etmek için ideal şırınga hacmi 5 ila 10 ml. (C) temiz, Kuru, toz kalem ve önceden kaplanmış (Eğer immünhistokimya için) ile yazmak için buzlu işaretleme alanı ile gres cam slayt ücretsiz. (D) Giemsa boyama (siyah ok ucu), VSG yüzey proteinleri (beyaz ok ucu) ve iletim elektron mikroskobu (blok ok) altında immunostained Ile gözlenen Tripokzomlar örneği. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2 : Farelerde dış erkek üreme organlarının (testis, epididymis ve epididimal yağ) ince iğne aspirasyonu (Fna) gösteren şemalar. (A) hayvan emniyete alındıktan sonra, önceden monte edilen aspirasyon aleti alınır. (B-C) İğne ucunu hedef organ içine takın. (D) şırınga pistonu 1 ml Ila 2 ml Mark 'a geri çekerek emiciyi tekrar tekrar 3-4 kez uygulayın. İğne ucu da, yeterli malzeme toplamak için emme uygularken hedef içinde ileri geri taşınabilir. (E) emici bırakın ve sadece sonra iğne geri. (F) iğneyi şırıngadan çıkarın ve (G) pistonlu geri çekin. (H) iğneyi yeniden takın. (I) malzemesi, pistonu şırıngadan hızlı bir şekilde iterek cam bir slayda uzaklaştırın. Splattering önlemek için, iğne ucu çok yakın veya hatta slayt üzerinde kaldığından emin olun. Aspirat damlası buzlu işaretleme alanının kenarından yaklaşık 1 cm kadar yerleştirilir. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3 : Smear hazırlama ve boyama. (A) slaytın bir ucunu (buzlu alan) başparmak ve parmak parmağı arasında tutun. (B) ikinci bir slaytın (Spreader) pürüzsüz temiz kenarını, malzeme damlasının hemen önünde numune kaydırağı üzerine yerleştirin. (C) ince bir film elde etmek için yayının orta hızda bir kez ileri doğru kaydırın. (D) slaytın kuru hava yapmasına izin verin ve slaytın buzlu kenarına bir kalem ile etiketleyin. (E) 5 dk. (F) için metanol ile komple kurutma düzelttikten sonra 30 dakika (veya 10 dk Için% 10 Giemsa) Için% 20 Giemsa çözeltisi ile leke. Hafifçe su ile durulayın, tamamen kuru, Ksilin içine daldırma, ve su çözünmez montaj maddesi ile monte. Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4 : Harici erkek üreme yapılarının Fna 'dan elde edilen smear mikrofotoğrafları ile enfekte fareler T. brucei. (A) iyi bir kalite doğrudan smear brüt görünüm: malzeme slayt üzerine yaklaşık 1 cm uzakta buzlu kenarı (siyah nokta) üzerine ifade edildi, bulaşmış ve 0,5 cm Kaydırmadan önce (paralel çizgiler) durdu. (B) parazitin yüzey proteinleri için immünositokimya (VSG), enfeksiyonun 6. gününde dış erkek üreme ORGANLARıNıN Fna 'dan elde edilen smear için yapılmıştır. Çok sayıda parazitler (ok ucu) fare germ hücreleri ile birlikte tespit edildi (oku). DAB, Harris hematoxylin ile karşı koymak. Orijinal büyütme: 40X (ölçek çubuğu = 50 μm). (C) Giemsa-enfeksiyonun gün 21 bir periton efüzyon Fna sonra elde smear boyama, çok sayıda parazitler gösterdi (ok ucu) ev sahibi (fare) hücreleri ile karışmış, bu durumda inflamatuar hücreler, makrofajlar (ok) ve lenfositler. Orijinal büyütme: 40X (ölçek çubuğu = 50 μm). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5 : KALITESIZ Fna smear. (A) kitle veya organ düşük hücresel smear, altında-temsilcisi. (B) çok kalın smear. (C) parçalanmış obje, kesilmiş hücreler, çıplak çekirdekler ve DNA çizgileri. (D) hücreler ve tabakalı katmanları toplamları. DAB, Harris hematoxylin ile karşı koymak. Orijinal büyütme: 20X (ölçek çubuğu = 100 μm). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6 : Epididimal sitoloji ve histolojinin fare ile enfekte olduğu T. brucei. (A) bir Fna smear ve (B) bir 4 μm parafin bölümüne karşılık gelen microfotoğraflar, aynı büyütme (20X Orijinal büyütme, ölçek çubuğu = 100 μm), hem parazitin yüzey proteinlerine (VSG) immünosteli. Smear, iyi korunmuş hücresel morfoloji ile çok sayıda parazit (ok ucu) gösterdi, orta sayıda germ hücresi ve birkaç spermatozoa (ok) ile harmanlıdır. Histolojik bölüm, epididimal boruların intra-luminal spermatozoa (ok) ile oluşan ve çok sayıda parazitin varlığının epidiysekal stroma (Arrowhead) genişletilmesi ile birlikte iyi korunmuş bir doku mimarisi gösterdi. DAB, Harris hematoxylin ile karşı koymak. Orijinal büyütme: 20X (ölçek çubuğu = 100 μm). Bu figürün daha büyük bir versiyonunu görmek Için lütfen tıklayınız.

Discussion

İnce Iğne aspirasyonu (FNA) insan ve yerli hayvanlarda hastalığı teşhis etmek için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Tekniği uzun yıllar üzerinde standardize edilmiştir1,2, hangi bir küçük-delik iğne kullanan hücreler veya sıvı bir palpe kütle veya organ1,3Aspire. Aspirat daha sonra genellikle bir cam kaydırağa bulaşmış ve bir tanı elde etmek için mikroskobik gözlem için lekelenmiş, ancak tekniği de diğer amaçlar için hücreleri almak için kullanılabilir4,5,6, 7 , 8 , 9' a kadar.

Prosedür hızlı (< 5 dakika fare başına, deneyimli bir araştırmacı için) ve komplikasyonlar riski minimal, basit venöz delinme geçiren kaynaklanan risk benzer. Bu nedenle, palpe edilmiş kitlelerin Fna için, anestezi sadece hassas anatomik yerlerde ya da hayvan ve istikrar organ veya kütle iyi bir immobilizasyon optimum sonuçlar için son derece önemlidir aspirasyon için gereklidir. Bu küçük laboratuar hayvanları için sık, bir elle küçük bir kemirgen güvenli ve etkili bir kısıtlama olarak diğer elle aspirasyon için bölgeye en iyi erişim sağlarken, anestezi olmadan elde etmek zordur. Kısa vadeli anestezi çoğu durumda yeterli, yine de gerekli, fare iyi bir FNA için. İyi bir immobilizasyon, lezyonun hücresel bileşenlerinin temsilcisi olan ve aynı zamanda negatif basınç uygulandığında iğne ucunu dışa olasılığını en aza indirir bir Aspire elde etme şansını maksimize eder.

Prosedürün kendisi çok basit olsa da, koordineli uygulama ve vakum serbest bırakılması en kritik adımlardan biridir. İğne yerleştirdikten sonra, şırınga piston kontrollü bir vakum (emme) elde etmek için geri çekiliyor, ve iğne sadece pistonun gitmesine izin vererek negatif basıncı bırakmadan sonra kütle kaldırılabilir (Şekil 2); Aksi takdirde aspirat şırınga varil içine emdi ve daha sonra kurtarmak için çok zordur. Bir diğer çok önemli adım yüksek kaliteli smear hazırlanması. Bir smear yapmak için çeşitli yöntemler vardır ama yöntemin ne olursa olsun, smear malzeme cam üzerine yerleştirildikten hemen sonra hazırlanmalıdır. Biyolojik malzeme hafifçe hücre ezmek eserler önlemek için yayılmalıdır. Bir lamel magazini olarak serpme bu eserler önlemeye yardımcı olabilir kullanın. Ancak, smear yaparken çok fazla kuvvet uygulaması coverslip kıracak. İyi bir kalite smear genellikle ışık iletebilir böylece tek tabakalı olarak dağıtılan hücre nüfusun çoğu vardır. Hücresel malzeme aşırı kan pıhtısı sıkışmış olmamalıdır.

Bir FNA amacı bir kitle, doku veya organ hücreleri toplamak için. Büyük delik iğneler kullanımı, selülarite artırmak için yararlıdır, ancak daha az bol malzeme, daha küçük iğneler ile örnekleme daha yüksek kalitede verirken, aşırı kan kontaminasyonu ile ilişkili olabilir. Bizim durumumuzda, T. bruceiile deneysel olarak enfekte farelerde dış erkek üreme yapıların perkütan aspirasyonu, 5 mL şırıngaya bağlı 22-Gauge iğneler ile yapılmıştır. Fareler anesteziydi, testis bir el ve delinme ve aspirasyon güdümlü ve diğer el ile gerçekleştirilen ile stabilize edildi. Mikrop hücreleriyle, spermatozoa, epitelyal hücreler ve stromal hücrelerle birlikte, parazitlerin yüzey proteinlerine (VSG) bulaşmış ve immunostik olan sayısız tripanosomları aldık (Şekil 4).

Belirli bir lezyonun birden fazla alanı birden çok kez örneklenmesine rağmen, negatif sonuçlar veren aspiratlar içinde her zaman potansiyel örnekleme hatası vardır, bu biz iğne ucu ve hedef organ veya kitle görselleştirmek yok kör bir aspirasyon olduğunu. Bu, şüpheli bir lezyonun olumsuzunun daha fazla soruşturmaya neden olmadığı bir klinik ortamda son derece ilgilidir, ancak hastalığın hayvan modellerinde o kadar alakalı değildir. Böylece, genel sınırlamalar esas olarak yanlış negatif sonuçlar ve daha az sıklıkta yanlış pozitif sonuçlar (örneğin, kan kontaminasyonu), ancak hayvan deneyinin ayarında en önemli sınırlama doku hakkında bilgi eksikliği içerir mimari17, gibi histopatoloji ile, örneğin parazitler dağıtım deseni, bağışıklık hücrelerinin, ve hücre-hücre etkileşimi özellikleri. Yine de, avantajları FNA bir olmayan-Terminal prosedürü aynı hayvan üzerinde tekrarlanan örnekleme için izin zaman ve her zaman daha iyi korunmuş hücresel morfoloji için izin verir (Şekil 5). Ev sahibi hücreler, bağışıklık hücreleri veya mikroorganizmaların bir fare her zaman hasat için FNA için alternatifler her zaman kitle veya ilgi organları toplamak için fare ötenize güveniyor.

Bizim bilginiz için, küçük laboratuar hayvanlarında FNA kullanımı ile ilgili sadece birkaç rapor vardır, biri 1949 hematopoez okumak için 22 G iğne ile kemik iliği aspirasyonuna karşılık gelen18, ve akış sitometri ile birlikte diğer tüm tümör ile ilişkili inflamatuar hücreleri veya endotel hücrelerini ölçmek7,19,20. Çalışmalarımız, bu tekniğin enfeksiyöz hastalık modellerinin tanısı ve incelenmesi için uzatılabilir ve sitolojinin immünositokimya veya elektron mikroskobu gibi tekniklerle birleştirilebilir olduğunu gösterir. Deneysel hayvanlarda yöntemin önemli avantajlarından ikisi şunlardır: (1) Bu prosedür Terminal değil, yani canlı farelerde gerçekleştirilebilir; ve (2) onun hafif şiddeti nedeniyle aynı hayvan seri arzları sağlar. Bu nedenle her çalışma için daha az fareler gereklidir ve klinik hastalığın ilerlemesi ile bir hastalığın ve/veya mikroorganizmanın hücresel ve moleküler özelliklerinin gelişmesi arasındaki korelasyon kolayca gerçekleştirilebilir, böylece uzunlamasına çalışmalar yapılabilir.

Belki de bir bulaşıcı hastalıklar teşhis için FNA kullanımı ile ilgili ilk rapor Grieg ve Gray tarafından 1904 bir çalışmada, uyku hastalığı olan hastalarda lenf nodlarının iğne arzları raporları, motil tripanosomes12ortaya. Eğer laboratuvar fareler bizim bulguları sığır, yani, Eğer Trypanosoma kolayca dış erkek üreme YAPıLARıNDAN Fna tarafından örneklenen olabilir, bir çeviri bulmak, bir bu tekniğin hayvan teşhis için veteriner veterinerler için yararlı olacağını bekleyebilirsiniz tripanosomiasis in-çiftlik, Hayvancılık.

Disclosures

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Acknowledgments

Bu proje Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino Superior (MCTES) tarafından Fundos do Orçamento de Estado (Ref.: ID/BıM/50005/2019) ile finanse edilmiştir. LMF, Fundação para a Ciência e Tecnologia (IF/01050/2014) araştırmacısı ve laboratuar ERC (FatTryp, ref. 771714) tarafından finanse edilmektedir. Bu çalışmanın yayınlanması aynı zamanda Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino Superior (MCTES) tarafından finanse edilen UID/BıM/50005/2019 projesi tarafından finanse edildi Fundos do Orçamento de Estado. Biz uzman elektron mikroskobu yardım için ımm Histoloji ve karşılaştırmalı patoloji laboratuvarı andreia Pinto teşekkür ve Sandra Trindade, Tiago Rebelo ve Henrique Machado (ımm) enfekte fareler doku paylaşımı için.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL) Bio 2 7418046 Anesthesia reversal
Cover slips (24 x 60 No.1) VWR 631-0664 Smear making
DAB Dako K3468 Immunocytochemistry
Entellan (500 mL) VWR 1.07961.0500 Mounting media
Envision Flex antibody diluent Dako 8006 Immunocytochemistry
EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit) Dako K4010 Immunocytochemistry
Envision Flex Wash Buffer Dako K8007 Immunocytochemistry
Giemsa stain Atom Scientific Ltd RRSPSS-A Smear staining
Glass slides (Superfrost Plus) VWR 631-9483 Smear making
Harris Haematoxylin Bio-optica 05-06004E Immunocytochemistry
Hydrogen Peroxidase solution Sigma H1009-500ML Immunocytochemistry
Hypodermic needles Microlance 3 (23 G) Henry Schein 902-8001 Aspiration technique
Ketamin (IMALGENE 1,000-10 mL) Bio 2 7410928 Anesthesia
Medetomidine (DOMITOR 10 mL) Bio 2 7418335 Anesthesia
Methanol Merck 1.06009.2511 Smear fixative
Pap pen Merck Z377821-1EA Immunocytochemistry
Protein Block Serum free Dako X0909 Immunocytochemistry
Syringes (5 mL, 10 mL) Henry Schein 900-3311, 900-3304 Aspiration technique

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leopold, G., Koss, M. R. M. Koss’ Diagnostic cytology and it’s histologic bases. Lippincott Williams and Wilkins. (2006).
  2. Raskin, R. E., Meyer, D. J. Canine and Feline Cytology: a Color Atlas and Interpretation Guide. Canine and Feline Cytology. (2016).
  3. Hopper, K. D., Abendroth, C. S., Sturtz, K. W., Matthews, Y. L., Shirk, S. J. Fine-needle aspiration biopsy for cytopathologic analysis: Utility of syringe handles, automated guns, and the nonsuction method. Radiology. 185, (3), 819-824 (1992).
  4. Saliba, A. E., et al. Microfluidic sorting and multimodal typing of cancer cells in self-assembled magnetic arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 107, (33), 14524-14529 (2010).
  5. Guzera, M., Cian, F., Leo, C., Winnicka, A., Archer, J. The use of flow cytometry for immunophenotyping lymphoproliferative disorders in cats: a retrospective study of 19 cases. Veterinary and Comparative Oncology. 14, 40-51 (2016).
  6. Young, N. A., Al-Saleem, T. I., Ehya, H., Smith, M. R. Utilization of fine-needle aspiration cytology and flow cytometry in the diagnosis and subclassification of primary and recurrent lymphoma. Cancer. 40, (4), 307-319 (1998).
  7. Carroll, C. S. E., Altin, J. G., Neeman, T., Fahrer, A. M. Repeated fine-needle aspiration of solid tumours in mice allows the identification of multiple infiltrating immune cell types. Journal of Immunological Methods. 425, 102-107 (2015).
  8. Araujo, R. W., Paiva, V., Gartner, F., Amendoeira, I., Martinez Oliveira, J., Schmitt, F. C. Fine needle aspiration as a tool to establish primary human breast cancer cultures in vitro. Acta Cytologica. 43, (6), 985-990 (1999).
  9. Craft, I., et al. Percutaneous epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection in the management of infertility due to obstructive azoospermia. Fertility and Sterility. 63, (5), 1038-1042 (1995).
  10. Powers, C. N. Diagnosis of infectious diseases: A cytopathologist’s perspective. Clinical Microbiology Reviews. 120, (3), 351-367 (1998).
  11. Diamantis, A., Magiorkinis, E., Koutselini, H. Fine-needle aspiration (FNA) biopsy: Historical aspects. Folia Histochemica et Cytobiologica. 47, (2), 191-197 (2009).
  12. Greig, E. D. W., Gray, A. C. H. Note on the lymphatic glands in sleeping sickness. British Medical Journal. 1, (2265), 1252 (1904).
  13. Robson, J., Ashkar, T. S. Trypanosomiasis in domestic livestock in the Lambwe Valley area and a field evaluation of various diagnostic techniques. Bulletin of the World Health Organization. 47, (6), 727-734 (1972).
  14. Disease, T. African Animal Trypanosomiasis. In Vitro. 1-15 (2009).
  15. Kennedy, P. G. E. Clinical features, diagnosis, and treatment of human African trypanosomiasis (sleeping sickness). Lancet Neurology. 12, (2), 186-194 (2012).
  16. Trindade, S., et al. Trypanosoma brucei parasites occupy and functionally adapt to the adipose tissue in mice. Cell Host and Microbe. 19, (6), 837-848 (2016).
  17. Carvalho, T., Trindade, S., Pimenta, S., Santos, A. B., Rijo-Ferreira, F., Figueiredo, L. M. Trypanosoma bruceitriggers a marked immune response in male reproductive organs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12, (8), 1-15 (2018).
  18. Sundberg, R. D., Hodgson, R. E. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, (5), 557-561 (2013).
  19. Sottnik, J. L., Guth, A. M., Mitchell, L. A., Dow, S. W. Minimally invasive assessment of tumor angiogenesis by fine needle aspiration and flow cytometry. Angiogenesis. 13, (3), 251-258 (2010).
  20. Betka, J., Hovorka, O., Boucek, J., Ulbrich, K., Etrych, T., Rihova, B. Fine needle aspiration biopsy proves increased T-lymphocyte proliferation in tumor and decreased metastatic infiltration after treatment with doxorubicin bound to PHPMA copolymer carrier. Journal of Drug Targeting. 21, (7), 648-661 (2013).
Ince Iğne aspirasyonu ile Ekstrasovasküler <em>Trypanosoma</em> parazitlerin tespiti
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carvalho, T., Santos, A. M., Figueiredo, L. M. Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration. J. Vis. Exp. (150), e59798, doi:10.3791/59798 (2019).More

Carvalho, T., Santos, A. M., Figueiredo, L. M. Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration. J. Vis. Exp. (150), e59798, doi:10.3791/59798 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter