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Immunology and Infection

Nachweis von extravaskulären Trypanosoma Parasiten durch Feine Nadelaspiration

doi: 10.3791/59798 Published: August 7, 2019

Summary

Fine Needle Aspiration ist eine Technik, bei der Zellen aus einer Läsion oder einem Organ mit einer dünnen Nadel gewonnen werden. Aspiriertes Material wird verschmiert, gebeizt und unter dem Mikroskop zur Diagnose untersucht oder für molekularbiologische, Zytometrie oder In-vitro-Analyse verwendet. Es ist billig, einfach, schnell und verursacht minimale Traumata.

Abstract

Fine Needle Aspiration (FNA) ist ein routinemäßiges diagnostisches Verfahren, das sowohl für medizinische als auch für Tierarztpraxen unerlässlich ist. Es besteht aus der perkutanen Aspiration von Zellen und/oder Mikroorganismen aus fühlbaren Massen, Organen oder Ergüssen (Flüssigkeitsansammlung in einer Körperhöhle) mit einer dünnen Nadel, ähnlich der regulären Nadel, die für die venöse Punktion verwendet wird. Das von FNA gesammelte Material ist im Allgemeinen hochzellulär, und das abgerufene Aspirat wird dann verschmiert, luftgetrocknet, nassfixiert, gebeizt und unter dem Mikroskop beobachtet. Im klinischen Kontext ist FNA ein wichtiges diagnostisches Instrument, das als Leitfaden für ein geeignetes therapeutisches Management dient. Da es einfach, schnell, minimal invasiv ist und begrenzte Investitionen in Labor und Humanressourcen erfordert, wird es von Tierärzten ausgiebig genutzt, vor allem in Heimen, aber auch in Nutztieren. In Studien mit Tiermodellen hat FNA den Vorteil, dass es wiederholt bei demselben Tier durchgeführt werden kann, was Längsschnittstudien durch die Entnahme von Zellen aus Tumoren und Organen/Geweben im Verlauf der Krankheit ermöglicht. Neben der Routinemikroskopie kann das entnommene Material auch für die Immunzytochemie, Elektronenmikroskopie, biochemische Analyse, Durchflusszytometrie, Molekularbiologie oder In-vitro-Assays verwendet werden. FNA wurde verwendet, um den Protozoenparasiten Trypanosoma brucei in den Gonaden infizierter Mäuse zu identifizieren, was die Möglichkeit für eine zukünftige Diagnose bei Rindern eröffnet.

Introduction

Fine Needle Aspiration (FNA) ist weit verbreitet in der Diagnose von Krebs und nicht-neoplastischen Krankheiten, sowohl bei menschlichen als auch bei Haustieren. Die Technik wurde im Laufe der Jahre standardisiert und ist in zahlreichen Lehrbüchern1,2beschrieben.

Es besteht weitgehend aus der perkutanen Aspiration von fühlbaren Massen, Organen oder Ergüssen mit einer dünnen Nadel, die auf eine leere Spritze montiert ist, wobei der Unterdruck verwendet wird, um Zellen oder Flüssigkeit aus der Masse1,3abzuziehen. Nadeln sind in der Regel 22 bis 25 G (Spur entsprechend dem Nadelinnendurchmesser), und die Verwendung einer größeren Bohrungnadel (großer Durchmesser, z.B. 21 G) ist hilfreich, um die Zelllichkeit zu erhöhen, obwohl dies zu einer übermäßigen Blutkontamination führen kann. Die Nadellänge hängt von der Tiefe der Masse ab, aber 1 oder 1 1/2 Zoll wird häufig für oberflächliche Massen verwendet. Spritzen sind in der Regel 5 bis 10 ml, mit größeren Spritzen erreichen höhere Vakuum, was wiederum erhöht die Saugleistung. Auch nicht greifbare tiefsitzende Massen können mit längeren Nadeln und unter Bildführung (Ultraschall) angesaugt werden. Das abgerufene Aspirat kann dann verschmiert, luftgetrocknet, nassfixiert, gebeizt und unter dem Mikroskop beobachtet werden, um eine Diagnose3 zu erhalten (Abbildung 1).

Dies ist eine einfache, kostengünstige, schmerzlose und minimal-invasive Technik, die hauptsächlich in der präoperativen Einstellung verwendet wird, um eine Diagnose auf fühlbaren Massen und auch für Organe, wie Lymphknoten, Schilddrüse, Prostata oder sogar die äußeren männlichen Fortpflanzungsstrukturen zu erreichen 1. Neben einem diagnostischen Werkzeug, kann diese Technik für die Sammlung von Zellen auch für andere Zwecke verwendet werden, nämlich Zytogenetik, Elektronenmikroskopie (Abbildung 1D), Durchfluss zytometrische Charakterisierung4,5 ,6,7, Etablierung von Zellkulturen8. Ein häufiges Beispiel in der klinischen Praxis ist die Spermienabrufung für die In-vitro-Fertilisation9.

Aspiration kann mehrmals in der gleichen Masse wiederholt werden, um mehrere Abstriche zu erhalten. Bei einer heterogenen Läsion, z.B. einem festen Bereich und einem zystischen Raum, ist es wichtig, dass Zellen aus jeder Region angesaugt werden. Das von der FNA gesammelte Material ist im Allgemeinen hochzellulär, was in den meisten Fällen die Diagnose von Krankheiten ohne die Notwendigkeit einer Gewebebiopsie ermöglicht. Spezielle Flecken, Immunfluoreszenz. Immunzytochemie (Abbildung 1D), und molekulare Techniken können auch in Abstrichen durchgeführt werden, die durch FNA erhalten werden, z. B. zur Identifizierung von Infektionserregern, wenn sie allein durch die Morphologie nicht erkennbar sind10. Ein kurzer Überblick über die allgemeinen Anwendungen sowie die für die FNA benötigten Ausrüstungen und Vorräte sind in den Tabellen 1 bzw. 2zusammengefasst.

Der erste Bericht über die Verwendung der Nadelpunktion für diagnostische Zwecke wird in frühen Schriften der arabischen Medizin beschrieben, aber es ist im frühen 20. Jahrhundert, dass moderne Nadelaspirationstechniken implementiert wurden11. Bemerkenswert ist, dass der erste Bericht, der die Verwendung von FNA für die Diagnose von Infektionskrankheiten nahelegt, eine Studie im Jahr 1904 war, in der Grieg und Gray von Nadelabsaugungen von Lymphknoten von Patienten mit Schlafkrankheit berichteten, die motile Trypanosomen zeigten12 . Die Autoren berichteten das Vorhandensein von Trypanosomen in frühen und fortgeschrittenen Fällen, und mit einer höheren Dichte als bei Blutabstrichen, wo dies oft seltene Ereignissesind 12.

Die aktuelle Diagnose der Trypanosomiasis bei Rindern beruht auf der direkten Beobachtung von Parasiten im Blut, lymph oder in immundiagnostischen Techniken13,14,15. Wir haben zuvor gezeigt, dass bei experimentellen Trypanosoma-Infektionen in der Maus, Trypanosoma brucei (T. brucei) hat einen bemerkenswerten Tropismus zu Fettgewebe16 und auch zu einigen der externen männlichen Fortpflanzungsstrukturen, nämlich epididymis17. Parasiten sammeln sich in den Stroma dieser Gewebe in großen Zahlen16.

Das unten dargestellte Protokoll beschreibt ein detailliertes technisches Verfahren für FNA bei lebenden Mäusen, das auf die Aspiration von Trypanosomen in den äußeren männlichen Fortpflanzungsstrukturen (Hodidymis, Epididymis und epididymales Fett) abzielt, gefolgt von konventionelle Zytologie und Immunostainierung für spezifische Parasitenproteine (VSG)16,17. Die Aspiration wurde 6 Tage nach der Infektion durchgeführt und die Sicherheitsverfahren, die gelten, sind diejenigen, die üblicherweise für den routinemäßigen Umgang mit Versuchstieren etabliert sind. Zusätzliche Maßnahmen sind für Tiere erforderlich, die Immunschwächen haben (tragen ein dampfsterilisiertes Kleid, Maske, Haarhaube, sterile Handschuhe und die Sicherstellung einer aseptischen Technik zu jeder Zeit), um die versehentliche Exposition gegenüber opportunistischen Krankheitserregern zu mildern.

Protocol

Alle Tierversuche in diesem Protokoll wurden gemäß den EU-Vorschriften durchgeführt und von der Tierethikkommission des Instituto de Medicina Molecular (iMM) genehmigt (AEC_2011_006_LF_TBrucei_IMM). Die Tieranlage von iMM entspricht dem portugiesischen Gesetz über die Verwendung von Labortieren (Dekret 113/2013) und folgt den Richtlinien der Europäischen Richtlinie 2010/63/EU und der RICHTLINIEN der FELASA (Federation of European Laboratory Animal Science Associations) und Empfehlungen zum Tierschutz im Labor.

1. Aspiration von Parasiten aus den äußeren männlichen Fortpflanzungsorganen der Maus

HINWEIS: Feine Nadelabsaugung (FNA) wurde bei wildtypigen männlichen C57BL/6J-Mäusen, 6 bis 10 Wochen alt, durchgeführt, die mit T. brucei durch intraperitoneale Injektion von 200 l Saline mit 2.000 Parasiten infiziert wurden, wie zuvorbeschrieben 16.

  1. Legen Sie die Maus für DIE FNA der äußeren männlichen Fortpflanzungsorgane in eine laminare Fließhaube, befeuchten Sie das Tier mit einer intraperitonealen Injektion von 200 l einer Mischung aus 75 mg/kg Ketamin + 1 mg/kg Medetomidin in Saline.
    1. Bestätigen Sie die Anästhesisierung mit der Toe Pinch-Methode. Wenn der Reflex des Zurückziehens des Beins fehlt, positionieren Sie die Maus in dorsaler Regung (Abbildung 2A).
    2. Die Hoden sorgfältig palepatieren und Größe und Entfernung von der darüber liegenden Haut bewerten. Beschränken Sie das Organ zwischen Zeige- und Mittelfinger oder zwischen Zeigefinger und Daumen. Dehnen Sie die darüber liegende Haut fest über die Masse, um das Ziel weiter zu immobilisieren. Reinigen Sie die Oberfläche mit Alkoholtüchern (Abbildung 2A).
    3. Halten Sie die montierte 22 G Nadel und 5 ml Spritze und legen Sie die Nadelspitze in das Ziel, immer mit dem Kolben im Restzustand (Abbildung2B-C).
    4. Tragen Sie die Absaugung auf, indem Sie den Spritzenkolben 2-3 Mal auf die 4 ml bis 5 ml-Markierung zurücknehmen. Leiten Sie die Nadel innerhalb des Organs entweder in einer geraden Linie oder entlang mehrerer verschiedener Tangenten um, um die Wahrscheinlichkeit einer repräsentativen Probe zu erhöhen und kleinere Strukturen wie die Epididymis anzusprechen. Stellen Sie sicher, dass dieses Verfahren schonend ist, um die Gewebeschäden zu minimieren (Abbildung 2C-D).
    5. Lassen Sie die Absaugung los und ziehen Sie dann die Nadel zurück. Zeichnen Sie die Nadel nicht mit dem eingefahrenen Kolben neu, da dies zum Absaugen des Aspirs in den Lauf der Spritze führt und seine Rückgewinnung behindert (Abbildung 2E). Nach dem Entzug der Nadel, kontrollieren Sie alle Blutungen durch Druck mit einem sterilisierten Gazeschwamm an der Punktionsstelle.
    6. Trennen Sie die Spritze von der Nadel, füllen Sie sie mit Luft, schließen Sie die Nadel wieder an und werfen Sie den Inhalt der Nadel vorsichtig auf einen Schlitten aus. Legen Sie die Spitze der Nadel sehr nah oder sogar auf die Rutsche, um Spritzen zu vermeiden (Abbildung 2F-I).
    7. Führen Sie mindestens eine zusätzliche Aspiration pro Organ/Tier durch, um eine Replizienprobe zu gewährleisten.
    8. Anästhesie mit einer subkutanen Injektion von 200 l von 1 mg/kg Atipamezol in der Saline wiederkehren und Tiere zur Genesung in ihren Hauskäfig zurückbringen und bis zur vollständigen Genesung beobachten.

2. Abstrichvorbereitung aus dem Aspirierten Material

HINWEIS: Verwenden Sie Handschuhe während des gesamten Verfahrens und sorgen Sie für eine sichere Entsorgung von Nadeln und Spritzen.

  1. Zwei-Schritte-Pull-Methode
    1. Nehmen Sie die Folie auf, die den Tropfen des Aspirats mit der nicht dominanten Hand hat, und kneifen Sie das gefrostete Ende zwischen Daumen und Zeigefinger (Abbildung 3A).
    2. Nehmen Sie eine zweite saubere Rutsche, die Streuerrutsche, mit der dominanten Hand und bringen Sie sie über die erste Rutsche mit dem Tropfen des Aspirats. Platzieren Sie die glatte reine Kante des Dias auf dem Probenschlitten direkt auf der Oberseite des Tropfens in einem Winkel von ca. 30° (Abbildung3B).
    3. Gleiten Sie die Rutsche nach vorne mit einer leichten, kontinuierlichen und stetigen Bewegung, um einen dünnen Film zu erhalten (Abbildung 3C).
    4. Ruhen Sie den Schlitten und ermöglichen Sie die vollständige und schnelle Lufttrocknung des Materials (Abbildung 3D). Nicht wärmefixieren. Beschriften Sie den mattierten Rand der Folie mit einem Bleistift.
      HINWEIS: Das Protokoll kann bei diesem Schritt angehalten werden und Abstriche können unbegrenzt gespeichert werden, bis sie zur Färbung bereit sind.

3. Färbung der Abstriche

HINWEIS: Verwenden Sie Während des gesamten Verfahrens Handschuhe und stellen Sie sicher, dass die Schritte 3.1.4 und 3.2.9 in einer Dunstabzugshaube ausgeführt werden.

  1. Giemsa-Färbeprotokoll
    1. Fix luftgetrocknete Abstriche, indem Sie die Dias in ein Coplin-Glas mit 100% Methanol für 5 min eintauchen (Abbildung 3E).
    2. Übertragen Sie das Dia in ein Coplin-Glas mit 20% Giemsa-Lösung (verdünnt auf 1/5 in destilliertem Wasser) für 30 min oder 10% Giemsa für 10 min (Abbildung3F).
    3. Abspülen Sie in Leitungswasser und trocknen Sie gründlich mit Tissue-Papier zu tumgießen.
    4. Halten Sie die Folie horizontal und tragen Sie einen Tropfen des nicht wässrigen Montagemediums auf den Abstrich auf. Legen Sie die Kante eines Deckglases auf die Rutsche, senken Sie sie und drücken Sie vorsichtig, um Luftblasen zu entfernen.
  2. Immunzytochemie bei FNA-Abstrichen
    1. Befestigen Sie luftgetrocknete Abstriche in 100% Methanol bei Raumtemperatur für 10 min.
    2. Waschen Sie die Rutsche für 5 min in einem Coplin-Glas mit 1x Phosphatpuffer (PBS), wiederholen Sie diesen Schritt 3 Mal mit frischen 1x PBS jedes Mal.
    3. Entfernen Sie die Folie aus Coplin Glas, wischen Überschüssigen Puffer, ohne den Abstrich zu berühren und zeichnen Sie einen Kreis um den Abstrich mit einem wasserabweisenden Stift (Tabelle der Materialien).
    4. Halten Sie die Folie horizontal und wenden Sie 150 l verdünnte Primärantikörperlösung auf jeden Abstrich an und brüten 1 h bei Raumtemperatur.
      HINWEIS: Primärer Antikörper, der hier verwendet wird, ist ein nicht gereinigtes Kaninchenserum anti-T. brucei VSG13 Antigen (kreuzreaktiv mit vielen T. brucei VSGs, im eigenen Haus produziert), verdünnt in 1x PBS bei 1:50.000. Führen Sie negative Kontrollen durch, indem Sie den entsprechenden primären Antikörper durch das PräimmuneSerum (Materialtabelle) ersetzen, um die Beurteilung der unspezifischen Bindung des sekundären Antikörpers zu ermöglichen.
    5. Waschen Sie die Rutsche für 5 min in einem Coplin Glas mit 1x PBS, wiederholen Sie diesen Schritt 3 mal mit frischen 1x PBS jedes Mal.
    6. Halten Sie den Schlitten horizontal und wenden Sie 150 L handelsüblichen Meerrettichperoxidase/DAB-Visualisierungssystems auf jeden Abstrich an. Inkubieren für 30 min bei Raumtemperatur (Tisch der Materialien).
    7. Waschen Sie für 3x für 5 min in 1x PBS.
    8. Gegenstain, indem Sie die Dias in ein Coplin-Glas mit Harris Hämatoxylin eintauchen. In Leitungswasser abspülen und gründlich mit Papier trocknen.
    9. Halten Sie die Folie horizontal und tragen Sie einen Tropfen des nicht wässrigen Montagemediums auf den Abstrich auf. Legen Sie die Kante eines Deckglases auf die Rutsche, senken Sie sie und drücken Sie vorsichtig, um Luftblasen zu entfernen.

Representative Results

FNA wurde in den äußeren männlichen Fortpflanzungsorganen von Mäusen durchgeführt, die mit T. brucei infiziert waren, mit einer 22 G-Nadel, die an eine 5 ml Spritze gekoppelt war, und Glasrutschen für die Abstrichvorbereitung (Abbildung1A-C). Die Methode ist einfach, aber optimale Ergebnisse basieren auf kritischen Schritten: perfekte Immobilisierung der Maus durch Vollnarkose erreicht, und Stabilisierung der Organe während des gesamten Verfahrens (Abbildung 2A-B). Die Saugkraft wurde 2-3 mal angewendet und die Nadel 1-2 mal umgeleitet, um eine repräsentative Probenahme der kleineren Organe und Gewebe zu ermöglichen: Epididymis und epididymales Fett. Vor dem Externalisieren der Nadel wurde Negativdruck freigesetzt. Das im Lumen und an der Nabe der Nadel enthaltene Aspirat (ca. 20 l) wurde zur Herstellung von 2 Abstrichen verwendet (Abbildung 3A-C). In Fällen, in denen die Nadel ohne Freisetzung der Absaugung entnommen wurde, wurde das Material in die Spritze gesaugt und war nicht wiederherstellbar. Der Prozess wurde zweimal erfolgreich wiederholt, einer für jedes gepaarte Organ. Nach dem Trocknen wurden Abstriche nassfixiert und immunzytochemie für die trypanosomeoberflächenproteine durchgeführt.

Ein guter Qualitätsabstrich (Abbildung 4A-C) zeichnete sich durch eine Monoschicht von Zellen mit guter Zelldichte aus, in der Wirtszellen konservierte morphologische Merkmale aufweisen, die die Identifizierung ihres Ursprungsgewebes und ihrer relativen Verhältnis zwischen einander. Parasiten waren effizient immungefärbt, identifizierbar und zählbar (Abbildung 4B). Ein Fall eines FNA eines peritonealen Ergusses in einer infizierten Maus, der mit Giemsa zur direkten Beobachtung und Diagnose gefärbt ist, ist ebenfalls dargestellt (Abbildung 3D-F und Abbildung 4C).

Ein schlechtes oder negatives FNA-Ergebnis kann auf unterschiedliche Gründe zurückzuführen sein: (1) zu wenig FNA-Material wird auf dem Dia ausgedrückt und ist unterrepräsentativ für die Probe; (2) zu viel FNA-Material auf einem einzigen Schlitten ausgedrückt wird, was zu dicke Abstriche und eine beeinträchtigungde zytologische Bewertung macht; (3) Bei der Abstriche wird zu viel Kraft angewendet, und die Zellen werden gestört, was zu vielen nackten Kernen und DNA-Streifen führt (Crush-Artefakt); oder (4) bei der Nichtzerginkandung des Abstrichs und der Zellen wird nicht genügend Kraft angewendet, was zu einer geschichteten Schicht führt, die die Bewertung der morphologischen Merkmale der Zellen behindert (Abbildung 5).

Wenn wir die FNA-Zytopathologie mit der Histopathologie vergleichen, d.h. die Analyse von Zellen im Vergleich zu Geweben, hat die Faust den Vorteil, dass die zelluläre Morphologie besser erhalten ist und relative Proportionen und das Zählen von Zellen besser bewertet werden können (Abbildung 6). Darüber hinaus ist die Immunzytochemie einfacher, schneller und einfacher zu optimieren als die Immunhistochemie, die typischerweise in formalinfixiertem und paraffinintegriertem Gewebe durchgeführt wird.

zielscheibe Anwendungen Vorteile Einschränkungen
Spürbare Masse Routinemikroskopie, Diagnose Einfach, schnell Keine Gewebearchitektur
sprachrohr Immunohistochemistry Niedrige Kosten Blindes Aspiration (Nadel kann Ziel tangential verfehlen; Aspiration kann nekrotische, zystische oder hämorrhagische Bereiche zielen)
Ergüsse Durchflusszytometrie Sampling von mehreren Standorten
Cytogenetik Gut erhaltene zelluläre Morphologie
Elektronenmikroskopie Frei von Komplikationen
PCR, andere molekulare Techniken Hohe Diagnosegenauigkeit
Biochemische Analyse Anästhesie (zur Immobilisierung)
In-vitro-Assays, Zellkultur Nicht-terminales Verfahren

Tabelle 1: Ziel, allgemeine Anwendungen, Vorteile und Begrenzung der Feinnadelabsaugung.

FNA Kit Archetyp einer Aspirationsnadel und Spritze
aspiration: Nadelteile:
1. Einweg-Kunststoffspritzen (5 oder 10 ml) (Abbildung 1B) Abschrägung. Die Spitze der Nadelwelle ist geneigt, um einen Punkt zu bilden, wobei die Schräge die Abschrägung ist. Nur abgeschrägte Nadeln sind für perkutane Aspirationen geeignet.
3. Nadeln von 22 bis 25-Spur (Durchmesser); 0,75, 1,0, 1,5 Zoll lang, mit Standard abgeschrägte Nadelspitze (Abbildung 1A) Welle. Hohlrohrteil der Nadel, dessen Länge entsprechend der Tiefe der Masse eingestellt werden kann. Das Messgerät der Nadel entspricht dem Durchmesser der Bohrung, d. h. dem Durchmesser der Innenseite der Welle (kleinere Nadeln haben eine höhere Spurweite). Die Verwendung von größeren Bohrungsnadeln (weniger als 22 G) ist hilfreich, um die Zelllichkeit zu erhöhen, obwohl dies übermäßige iatrogene Blutkontamination produzieren kann.
1. Anästhesie (falls erforderlich). Schmerzen im Zusammenhang mit FNA ist ähnlich wie bei einer Venenpunktion, jedoch erfordert eine gute Aspiration eine gute Immobilisierung des Themas, besonders wichtig bei kleinen Tieren und/oder für kleine, fluktutive Läsionen und Organe. Ratten und Mäuse, die der FNA unterliegen, sollten angemessen passiv zurückgehalten oder, falls erforderlich, sediert oder unter leichter Vollnarkose sein. Hub. Kunststoffanteil der Nadel, der an der Spritze befestigt ist; sollte transparent sein, um die Visualisierung des angesaugten Materials zu ermöglichen. Das während der FNA gewonnene Aspiratmaterial sollte in der Nadelwelle gesammelt und die Aspiration gestoppt werden, wenn Material in die Nabe gelangt.
FNA Schmieren herstellung und Interpretation: Spritzenteile:
1. Frosted End Glasmikroskop-Dias (Abbildung 1C) Fass/Zylinder. Hohlteil der Spritze. Wenn es nicht mit zystischen Läsionen oder Ergüssen zu tun hat, kann Material, das in das Fass angesaugt wird, in der Regel nicht zurückgewonnen werden. Das ideale Aspiratvolumen für die FNA-Zytologie beträgt ca. 5 l, was dem durchschnittlichen Aspiratvolumen entspricht, das die Welle und Nabe der Nadel einnimmt.
2. Romanowsky-Flecken (z.B. Diff-Quik, Giemsa) Tipp. Ende des Laufs, an dem die Nadelnbenabe befestigt ist.
3. Mikroskop (Hellfeld) Plunger. Beweglicher Teil der Spritze, der eine flache Scheibe oder Lippe an einem Ende und eine Gummidichtung am anderen Ende hat. Passt in den Lauf und bietet den Druck, die Zellen zu ziehen, Flüssigkeit in die Nadel. Ein perfekt abgedichteter Kolben, der guten Unterdruck erzeugt, ist obligatorisch, um eine gute Saugausbeute zu erzielen.

Tabelle 2: Ausrüstung und Zubehör, die für die feine Nadelabsaugung benötigt werden.

Figure 1
Abbildung 1 : Werkzeuge und Ergebnisse für feine Nadelabsaugung. (A) Idealer Nadeldurchmesser für FNA ist von 22 bis 25 G. (B) Ideales Spritzenvolumen, um eine gute Saugausbeute von 5 bis 10 ml zu erhalten. (C) Sauber, trocken, fettfrei Glasschlitten mit mattiertem Markierungsbereich zum Schreiben mit Bleistift und vorbeschichtet (wenn für Diebtochemie). (D) Beispiel für Trypanosomen, beobachtet mit Giemsa-Färbung (schwarze Pfeilspitze), immunostainiert für die VSG-Oberflächenproteine (weiße Pfeilspitze) und unter Transmissionselektronenmikroskopie (Blockpfeil). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2 : Schemata mit feiner Nadelabsaugung (FNA) der äußeren männlichen Fortpflanzungsorgane (Hoden, Epididymis und epididymales Fett) bei Mäusen. (A) Sobald das Tier gesichert ist, wird das zuvor montierte Aspirationsinstrument abgeholt. (B-C) Setzen Sie die Nadelspitze in das Zielorgan ein. (D) Tragen Sie die Absaugung auf, indem Sie den Spritzenkolben auf die 1 ml bis 2 ml-Marke zurückziehen, wiederholt 3-4 mal. Nadelspitze kann auch innerhalb des Ziels beim Aufbringen von Saugkraft hin und her bewegt werden, um genügend Material zu sammeln. (E) Lassen Sie die Absaugung los und ziehen Sie die Nadel erst zurück. (F) Entfernen Sie die Nadel aus der Spritze und (G) Ziehen Sie den Kolben zurück. (H) Befestigen Sie die Nadel wieder an. (I) Vertreiben Sie das Material auf eine Glasrutsche, indem Sie den Kolben schnell durch die Spritze schieben. Um Spritzen zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass die Spitze der Nadel sehr nah oder sogar auf der Rutsche ruht. Der Tropfen des Aspirats wird ca. 1 cm vom Rand des frostigen Markierungsbereichs entfernt platziert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3 : Abstrichvorbereitung und Färbung. (A) Halten Sie ein Ende der Folie (Frostbereich) zwischen Daumen und Zeigefinger. (B) Legen Sie die glatte saubere Kante eines zweiten Schlittens (Streuer) auf die Probenrutsche direkt vor dem Materialtropfen. (C) Schieben Sie den Spread einmal mit mäßiger Geschwindigkeit nach vorne, um einen dünnen Film zu erhalten. (D) Lassen Sie die Folie an der Luft trocknen und beschriften Sie die mattierte Kante der Folie mit einem Bleistift. (E) Nach vollständiger Trocknung fix mit Methanol für 5 min. (F) Fleck mit 20% Giemsa Lösung für 30 min (oder 10% Giemsa für 10 min). Leicht mit Wasser abspülen, vollständig trocknen, in Xylol tauchen und mit einem wasserunlöslichen Montagemittel montieren. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4 : Mikrophotos von Abstrichen, die von FNA von externen männlichen Fortpflanzungsstrukturen bei Mäusen, die mit T. brucei. (A) Bruttoes Aussehen eines guten Qualitäts-Direktabstrichs: Das Material wurde auf dem Dia etwa 1 cm von der mattierten Kante (schwarzer Punkt) entfernt ausgedrückt, verschmiert und 0,5 cm vor dem Rand der Rutsche gestoppt (parallele Linien). (B) Die Immunzytochemie für die Oberflächenproteine des Parasiten (VSG) wurde für Abstriche durchgeführt, die von FNA der äußeren männlichen Fortpflanzungsorgane am Tag 6 der Infektion erhalten wurden. Zahlreiche Parasiten (Pfeilspitze) wurden mit Mauskeimzellen (Pfeil) gemischt nachgewiesen. DAB konterkariert mit Harris Hämatoxylin. Ursprüngliche Vergrößerung: 40x (Scale bar = 50 'm). (C) Die Giemsa-Färbung des nach FNA erhaltenen Abstrichs eines peritonealen Ergusses am 21. Tag der Infektion zeigte zahlreiche Parasiten (Pfeilspitze) mit Wirtszellen (Mauszellen), in diesem Fall Entzündliche Zellen, Makrophagen (Pfeil) und Lymphozyten. Ursprüngliche Vergrößerung: 40x (Scale bar = 50 'm). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5 : Schlechte Qualität FNA Abstriche. (A) Schlecht zellulärer Abstrich, unterrepräsentativ für die Masse oder das Organ. (B) Sehr dicker Abstrich. (C) Zerkleinertes Artefakt, mit gestörten Zellen, nackten Kernen und DNA-Streifen. (D) Aggregate und geschichtete Zellschichten. DAB konterkariert mit Harris Hämatoxylin. Ursprüngliche Vergrößerung: 20x (Scale bar = 100 m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6 : Vergleich der epididymalen Zytologie und Histologie bei Mäusen, die mit T. brucei. (A) Mikrophotos, die einem FNA-Abstrich und (B) einem 4 m Paraffin-Abschnitt bei gleicher Vergrößerung (20x Originalvergrößerung, Scale bar = 100 m) entsprechen, beide immunostainiert für die Oberflächenproteine des Parasiten (VSG). Der Abstrich zeigte eine große Anzahl von Parasiten (Pfeilspitze) mit gut erhaltener zellulärer Morphologie, gemischt mit einer moderaten Anzahl von Keimzellen und wenigen Spermatozoen (Pfeil). Der histologische Abschnitt zeigte eine gut erhaltene Gewebearchitektur, bestehend aus epididymalen Kanälen mit intraluminalen Spermatozoen (Pfeil), und dem Vorhandensein einer großen Anzahl von Parasiten, die die epididymale Stroma (Pfeilspitze) ausdehnten. DAB konterkariert mit Harris Hämatoxylin. Ursprüngliche Vergrößerung: 20x (Scale bar = 100 m). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Discussion

Fine Needle Aspiration (FNA) ist eine Methode, die weit verbreitet ist, um Krankheiten bei menschlichen und Haustieren zu diagnostizieren. Die Technik wurde über viele Jahre standardisiert1,2, die Verwendung einer Kleinbohrnadel verwendet, um Zellen oder Flüssigkeit aus einer fühlbaren Masse oder Organ1,3zu aspirieren. Das Aspirat wird dann in der Regel auf einem Glasschlitten verschmiert und für die mikroskopische Beobachtung gebeizt, um eine Diagnose zu erhalten, aber die Technik kann auch verwendet werden, um Zellen für andere Zwecke abzurufen4,5,6, 7 , 8 , 9.

Das Verfahren ist schnell (<5 min pro Maus, für einen erfahrenen Forscher) und das Risiko von Komplikationen ist minimal, ähnlich dem Risiko, das bei einer einfachen venösen Punktion anfällt. Aus diesem Grund ist bei FNA von fühlbaren Massen eine Anästhesie nur für empfindliche anatomische Stellen erforderlich oder wenn eine gute Immobilisierung des Tieres und die Stabilisierung des Organs oder der zu aspirierenden Masse für optimale Ergebnisse extrem entscheidend ist. Dies ist häufig für kleine Labortiere, da sichere und effektive Zurückhaltung eines kleinen Nagetiers mit einer Hand bei gleichzeitiger Gewährleistung des besten Zugangs zum Gebiet für Aspiration mit der anderen Hand, ist schwer ohne Anästhesie zu erreichen. Kurzzeitanästhesie ist in den meisten Fällen ausreichend, dennoch notwendig, für eine gute FNA in der Maus. Eine gute Immobilisierung maximiert die Chancen, ein Aspirat zu erhalten, das repräsentativ für die zellulären Komponenten der Läsion ist und minimiert auch die Wahrscheinlichkeit, die Spitze der Nadel zu externalisieren, während Unterdruck ausgeübt wird.

Obwohl das Verfahren selbst sehr einfach ist, sind koordinierte Anwendung und Freisetzung von Vakuum die wichtigsten Schritte. Nach dem Einsetzen der Nadel wird der Kolben der Spritze zurückeingezogen, um ein kontrolliertes Vakuum (Saugung) zu erreichen, und die Nadel kann nur nach Freigabe des Unterdrucks durch Loslassen des Kolbens aus der Masse entfernt werden (Abbildung 2); andernfalls wird das Aspirat in den Lauf der Spritze gesaugt und ist dann sehr schwer zu erholen. Ein weiterer sehr wichtiger Schritt ist die Herstellung von hochwertigen Abstrichen. Es gibt verschiedene Methoden, um einen Abstrich zu machen, aber unabhängig von der Methode sollten Abstriche sofort vorbereitet werden, nachdem das Material auf das Glas gelegt wurde. Das biologische Material sollte sanft verteilt werden, um Zellzerkleinerungsartefakte zu vermeiden. Die Verwendung eines Deckzettels als Streuer kann helfen, diese Artefakte zu verhindern. Jedoch, die Anwendung von zu viel Kraft während der Herstellung der Abstrich wird den Abdeckungsrutsch brechen. Ein guter Abstrich hat in der Regel den größten Teil der Zellpopulation als Monolayer verteilt, so dass sie leicht Licht übertragen können. Zellmaterial sollte nicht übermäßig im Blutgerinnsel gefangen sein.

Das Ziel einer FNA ist es, Zellen aus einer Masse, Gewebe oder Organ zu sammeln. Die Verwendung von größeren Bohrungsnadeln ist hilfreich, um die Zelllichkeit zu erhöhen, kann aber mit übermäßiger Blutkontamination in Verbindung gebracht werden, während Proben mit kleineren Nadeln eine höhere Qualität ergeben, wenn auch weniger reichlich Material. In unserem Fall wurde die perkutane Aspiration der äußeren männlichen Fortpflanzungsstrukturen bei Mäusen, die experimentell mit T. bruceiinfiziert waren, mit 22-Spur-Nadeln durchgeführt, die an eine 5 ml Spritze gekoppelt waren. Mäuse wurden anästhesiert, die Hoden mit einer Hand stabilisiert und Punktion und Aspiration geführt und mit der anderen Hand durchgeführt. Wir haben zahlreiche Trypanosomen mit Keimzellen, Spermatozoen, Epithelzellen und Stromalzellen gefunden, die für die Oberflächenproteine der Parasiten (VSG) verschmiert und immungefärbt wurden (Abbildung 4).

Es gibt immer den potenziellen Stichprobenfehler bei Aspiren, der negative Ergebnisse liefert, denn obwohl mehrere Bereiche einer bestimmten Läsion mehrmals beprobt werden können, ist dies eine blinde Aspiration, bei der wir die Nadelspitze und das Zielorgan oder die Masse nicht visualisieren. Dies ist äußerst relevant in einem klinischen Umfeld, in dem eine negative FNA einer verdächtigen Läsion weitere Untersuchungen nicht ausschließt, aber sie ist nicht so relevant in Tiermodellen von Krankheiten. Allgemeine Einschränkungen umfassen daher hauptsächlich falsch negative Ergebnisse und seltener falsch positive Ergebnisse (z. B. durch Blutkontamination), aber die wichtigste Einschränkung bei der Einstellung von Tierversuchen ist der Mangel an Informationen über Gewebe Architektur17, wie wir es bei der Histopathologie haben, z.B. Verteilungsmuster von Parasiten, von Immunzellen und Zell-Zell-Interaktionsmerkmalen. Dennoch ist es von Vorteil, dass FNA ein nicht-terminales Verfahren ist, das die wiederholte Probenahme im gleichen Tierüberlauf ermöglicht und immer eine besser erhaltene zelluläre Morphologie ermöglicht (Abbildung 5). Alternativen zu FNA zur Gewinnung von Wirtszellen, Immunzellen oder Mikroorganismen von einer Maus verlassen sich immer auf die Einschläferung der Maus, um die Masse oder die Voninteresse entosenden Organe zu sammeln.

Unserer Kenntnis nach gibt es nur wenige Berichte über die Verwendung von FNA bei kleinen Labortieren, einer von 1949, der der Aspiration des Knochenmarks mit 22 G Nadel für die Untersuchung der Hämatopoese18entspricht, und alle anderen in Kombination mit der Durchflusszytometrie, um quantifizieren entweder tumorassoziierte Entzündungszellen oder Endothelzellen7,19,20. Unsere Arbeit zeigt, dass diese Technik auf die Diagnose und Untersuchung von Infektionskrankheitsmodellen ausgedehnt werden kann und Zytologie mit Techniken wie Immunzytochemie oder Elektronenmikroskopie kombinieren kann. Zwei der Hauptvorteile der Methode bei Versuchstieren sind: (1) Dieses Verfahren ist nicht endlos, d. h. kann bei lebenden Mäusen durchgeführt werden; und (2) aufgrund seiner milden Schwere ermöglicht es serielle Aspirationen bei demselben Tier. Daher werden für jede Studie weniger Mäuse benötigt, und die Korrelation zwischen dem Fortschreiten der klinischen Krankheit und der Evolution der zellulären und molekularen Merkmale einer Krankheit und/oder eines Mikroorganismus kann leicht durchgeführt werden, was Längsschnittstudien ermöglicht.

Vielleicht ist der erste Bericht über die Verwendung von FNA zur Diagnose einer Infektionskrankheit eine Studie von Grieg und Gray aus dem Jahr 1904, die Nadelabsaugungen von Lymphknoten von Patienten mit Schlafkrankheit meldet, die motile Trypanosomen12offenbarten. Wenn unsere Befunde bei Labormäusen eine Übersetzung in s. Rinder finden, d.h. dass, wenn Trypanosoma leicht von FNA aus den äußeren männlichen Fortpflanzungsstrukturen beprobt werden kann, kann man erwarten, dass diese Technik für Tierärzte nützlich sein wird, um Tiere zu diagnosigen Trypanosomiasis in der Landwirtschaft, im Viehbestand.

Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Dieses Projekt wurde von Fundaéo para a Ciéncia e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciéncia, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) über Fundos do Oréamento de Estado (Ref.: ID/BIM/50005/2019) finanziert. LMF ist ein Prüfer des Fundaéo para a Ciéncia e Tecnologia (IF/01050/2014) und das Labor wird vom ERC (FatTryp, Ref.771714) finanziert. Die Veröffentlichung dieser Arbeit wurde auch gefördert UID/BIM/50005/2019 Projekt finanziert, das von Fundaéo para a Ciéncia e a Tecnologia (FCT)/ Ministério da Ciéncia, Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) über Fundos do Oréamento de Estado finanziert wurde. Wir danken Andreia Pinto vom Histologie- und Vergleichslabor für Pathologie des iMM für die fachkundige Unterstützung der Elektronenmikroskopie und Sandra Trindade, Tiago Rebelo und Henrique Machado (iMM) für die gemeinsame Nutzung von Geweben von infizierten Mäusen.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL) Bio 2 7418046 Anesthesia reversal
Cover slips (24 x 60 No.1) VWR 631-0664 Smear making
DAB Dako K3468 Immunocytochemistry
Entellan (500 mL) VWR 1.07961.0500 Mounting media
Envision Flex antibody diluent Dako 8006 Immunocytochemistry
EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit) Dako K4010 Immunocytochemistry
Envision Flex Wash Buffer Dako K8007 Immunocytochemistry
Giemsa stain Atom Scientific Ltd RRSPSS-A Smear staining
Glass slides (Superfrost Plus) VWR 631-9483 Smear making
Harris Haematoxylin Bio-optica 05-06004E Immunocytochemistry
Hydrogen Peroxidase solution Sigma H1009-500ML Immunocytochemistry
Hypodermic needles Microlance 3 (23 G) Henry Schein 902-8001 Aspiration technique
Ketamin (IMALGENE 1,000-10 mL) Bio 2 7410928 Anesthesia
Medetomidine (DOMITOR 10 mL) Bio 2 7418335 Anesthesia
Methanol Merck 1.06009.2511 Smear fixative
Pap pen Merck Z377821-1EA Immunocytochemistry
Protein Block Serum free Dako X0909 Immunocytochemistry
Syringes (5 mL, 10 mL) Henry Schein 900-3311, 900-3304 Aspiration technique

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References

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Nachweis von extravaskulären <em>Trypanosoma</em> Parasiten durch Feine Nadelaspiration
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Carvalho, T., Santos, A. M., Figueiredo, L. M. Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration. J. Vis. Exp. (150), e59798, doi:10.3791/59798 (2019).More

Carvalho, T., Santos, A. M., Figueiredo, L. M. Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration. J. Vis. Exp. (150), e59798, doi:10.3791/59798 (2019).

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