Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Påvisning af ekstravaskulære Trypanosoma -parasitter ved fin nåle aspiration

doi: 10.3791/59798 Published: August 7, 2019

Summary

Fin nål aspiration er en teknik, hvorved celler er opnået fra en læsion eller orgel ved hjælp af en tynd nål. Aspireret materiale er smurt, plettet og undersøgt under et mikroskop til diagnosticering eller anvendes til molekylær biologi, cytometri eller in vitro-analyse. Det er billigt, enkelt, hurtigt og forårsager minimal traume.

Abstract

Fine needle aspiration (FNA) er en rutinemæssig diagnostisk procedure, der er afgørende for både medicinsk og veterinær praksis. Det består af den perkutane aspiration af celler og/eller mikroorganismer fra håndgribelige masser, organer eller effusioner (væskeophobning i en krop hulrum) ved hjælp af en tynd nål svarende til den normale nål anvendes til venøs punktering. Det materiale, der indsamles af FNA er generelt meget cellulære, og den hentede aspirat er derefter smurt, lufttørret, våd-fast, plettet og observeret under et mikroskop. I den kliniske sammenhæng, er FNA et vigtigt diagnostisk værktøj, der fungerer som en vejledning til den relevante terapeutiske forvaltning. Fordi det er enkelt, hurtigt, minimalt invasivt og kræver begrænset investering i laboratoriet og de menneskelige ressourcer, det er flittigt brugt af dyrlæger, for det meste i det indenlandske, men også i husdyr. I undersøgelser, der anvender dyremodeller, har FNA den fordel, at det kan udføres gentagne gange i det samme dyr, hvilket muliggør langsgående undersøgelser gennem indsamling af celler fra tumorer og organer/væv i løbet af sygdommen. Ud over rutinemæssig mikroskopi kan hentet materiale også anvendes til immunocytokemi, elektronmikroskopi, biokemisk analyse, flow cytometri, molekylær biologi eller in vitro-assays. FNA er blevet brugt til at identificere protozoen parasisitet Trypanosoma brucei i gonader af inficerede mus, der åbner mulighed for en fremtidig diagnose i kvæg.

Introduction

Fin nål aspiration (FNA) er meget udbredt i diagnosticering af kræft og ikke-neoplastiske sygdomme, både hos mennesker og husdyr. Teknikken er blevet standardiseret gennem årene og er beskrevet i talrige lærebøger1,2.

Det består i vid udstrækning af den perkutane aspiration af håndgribelig masse, organer eller effusioner med en tynd nål monteret på en tom sprøjte, ved hjælp af det negative Tryk for at trække celler eller væske fra massen1,3. Nåle er typisk 22 til 25 G (gauge svarende til nålen indre diameter), og brugen af en større bore nål (stor diameter, f. eks, 21 G) er nyttigt at øge cellularitet, selv om dette kan producere overdreven blod kontaminering. Nål længde vil afhænge af dybden af massen, men 1 eller 11/2 tommer er almindeligt anvendt til overfladiske masser. Sprøjter er typisk 5 til 10 mL, med større sprøjter opnå højere vakuum, hvilket igen øger aspirat udbytte. Ikke-håndgribelig dybtliggende masser kan også aspireres, med længere nåle og under billed vejledning (ultrasonografi). Den hentede aspirat kan derefter smøres, lufttørret, våd-fast, plettet og observeret under et mikroskop for at opnå en diagnose3 (figur 1).

Dette er en enkel, billig, smertefri og minimalt invasiv teknik, der hovedsagelig anvendes i den præoperative indstilling for at opnå en diagnose på hånd løse masser og også for organer, ligesom lymfeknuder, skjoldbruskkirtlen, prostata eller endda de eksterne mandlige reproduktive strukturer 1. ud over at være et diagnostisk værktøj, denne teknik kan bruges til indsamling af celler til andre formål samt, nemlig Cytogenetik, elektronmikroskopi (figur 1d), flow cytometrisk karakterisering4,5 ,6,7, etablering af cellekulturer8. Et almindeligt eksempel i klinisk praksis er sperm hentning for in vitro fertilisering9.

Aspiration kan gentages flere gange i samme masse for at opnå flere Smears. I tilfælde af en heterogen læsion, f. eks, et solidt område og et cystisk rum, er det vigtigt, at cellerne aspireres fra hver region. Det materiale, der indsamles af FNA er generelt meget cellulære, som i de fleste tilfælde giver mulighed for diagnosticering af sygdomme uden behov for en vævs biopsi. Særlige pletter, immunofluorescens. immunocytokemi (figur 1d), og molekylære teknikker kan også udføres i udstrygninger opnået gennem Fna, f. eks, til identifikation af infektiøse agenser, når de ikke kan genkendes af morfologi alene10. En kort oversigt over de generelle anvendelser og det udstyr og de forsyninger, der er nødvendige for FNA, er opsummeret i henholdsvis tabel 1 og 2.

Den første rapport om brugen af nålen punktering til diagnostiske formål er beskrevet i tidlige skrifter af arabisk medicin, men det er i begyndelsen af det tyvende århundrede, moderne nåle aspiration teknikker blev implementeret11. Især, måske den første rapport, der foreslår brugen af FNA til diagnosticering af smitsomme sygdomme var en undersøgelse i 1904, hvor Grieg og grå rapporterede nåle aspirationer af lymfeknuder fra patienter med sovende sygdom afsløret motile sædceller trypanosomes12 . Forfatterne rapporterede tilstedeværelsen af trypanosomer i både tidlige og avancerede tilfælde, og ved en højere tæthed end set i blod udstrygninger, hvor disse er ofte sjældne hændelser12.

Aktuel diagnose af trypanosomiasis hos kvæg afhænger af den direkte observation af parasitter i blodet, lymfeknuder eller i immun diagnostiske teknikker13,14,15. Vi har tidligere vist, at i eksperimentelle Trypanosoma infektioner i mus, Trypanosoma brucei (T. brucei) har en bemærkelsesværdig tropisme til fedtvæv16 og også til nogle af de ydre mandlige reproduktive strukturer, nemlig epididymis17. Parasitter ophobes i stroma af disse væv i stort tal16.

Nedenstående protokol beskriver en detaljeret trin-for-trin teknisk procedure for FNA i levende mus, med henblik på aspiration af trypanosomer til stede i de ydre mandlige reproduktive strukturer (testis, epididymis, og epididymale fedt), efterfulgt af konventionel cytologi og immun farvning for specifikke parasitinproteiner (VSG)16,17. Aspiration blev udført 6 dage efter infektionen og sikkerhedsprocedurer, der gælder, er de almindeligt etablerede for rutinemæssig håndtering af forsøgsdyr. Der kræves yderligere foranstaltninger for dyr, der har immundefekt (iført en damp steriliseret kjole, maske, hårhjelm, sterile handsker, og som sikrer aseptisk teknik til enhver tid) for at afbøde utilsigtet udsættelse for opportunistiske patogener.

Protocol

Alle dyreforsøg i denne protokol blev udført i henhold til EU-forordninger og godkendt af den etiske komité for Dyreetik i Instituto de Medicina Molecular (iMM) (AEC_2011_006_LF_TBrucei_IMM). Dyre faciliteten for iMM er i overensstemmelse med den portugisiske lov om anvendelse af forsøgsdyr (lovdekret nr. 113/2013) og følger det europæiske direktiv 2010/63/EU og FELASA (Sammenslutningen af europæiske laboratorie foreninger for dyrevidenskab) og anbefalinger vedrørende laboratoriedyrs velfærd.

1. aspiration af parasitter fra de ydre mandlige reproduktive organer af musen

Bemærk: Fin nål aspiration (FNA) blev udført i vild-type mandlige C57BL/6J mus, 6 til 10 uger gammel, inficeret med T. brucei gennem intraperitoneal injektion af 200 μl saltvand med 2.000 parasitter som beskrevet tidligere16.

  1. For FNA af de ydre mandlige kønsorganer, Placer musen i en laminar flow hætte, bedøve dyret med en intraperitoneal injektion af 200 μL af en blanding af 75 mg/kg ketamin + 1 mg/kg Medetomidin i saltvand.
    1. Bekræft bedøvelsesmiddel med toe pinch-metoden. Når refleksen af retraktionen af benet er fraværende, position mus i dorsale recumbency (figur 2a).
    2. Forsigtigt palpere testierne, vurdere størrelse og afstand fra den overliggende hud. Træk orglet mellem indekset og den midterste finger eller mellem pegefingeren og tommelfingeren. Stræk den overliggende hud stramt over massen for yderligere at immobilisere målet. Rengør overfladen med spritservietter (figur 2a).
    3. Hold den samlede 22 G nål og 5 mL sprøjte og sæt nålespidsen ind i målet, altid med stemplet i resten tilstand (figur 2b-C).
    4. Påfør sug ved at trække stemplet tilbage til 4 mL til 5 mL mærket 2-3 gange. Omdiriger nålen i orgel enten i en lige linje eller langs flere forskellige tangenter for at øge sandsynligheden for en repræsentativ prøve og målrette mindre strukturer som epididymis. Sørg for, at denne procedure er blid, for at minimere vævsskader (figur 2c-D).
    5. Frigør sugesen, og træk kanylen ud. Nålen må ikke trækkes tilbage med det tilbagekaldte stempel, da dette vil føre til sugning af aspiratet ind i sprøjtens tønde og hæmme dets genopretning (figur 2E). Efter tilbagetrækningen af nålen, kontrollere enhver blødning ved at anvende tryk med en steriliseret gaze svamp på punkturstedet.
    6. Frakobl sprøjten fra nålen, fyld den med luft, Tilslut nålen igen og skub forsigtigt indholdet af nålen ind på en slide. Placer spidsen af nålen meget tæt eller endda på diaset for at undgå sprøjt (figur 2F-I).
    7. Udfør mindst en yderligere aspiration pr. organ/dyr for at sikre replikat prøvetagning.
    8. Vende tilbage anæstesi med en subkutan injektion af 200 μL af 1 mg/kg Atipamezole i saltvand og returnere dyr til deres hjem bur til nyttiggørelse og observere indtil fuld helbredelse.

2. smear præparat fra det aspirerede materiale

Bemærk: Brug handsker under hele proceduren, og sørg for sikker bortskaffelse af nåle og sprøjter.

  1. To trin pull metode
    1. Saml den slide, der har dråbe af aspiratet ved hjælp af den ikke-dominerende hånd, og Knib den frostet ende mellem tommelfingeren og pegefingeren (figur 3a).
    2. Pick up en anden ren slide, sprederen slide, med den dominerende hånd og bringe den på tværs af den første slide med dråbe af aspirat. Placer glide Rens glatte kant på prøve sliden lige på toppen af faldet i en vinkel på ca. 30 ° (figur 3b).
    3. Glide diaset fremad med en let, kontinuerlig og stabil bevægelse for at opnå en tynd film (figur 3c).
    4. Resten af diaset og giver mulighed for komplet og hurtig lufttørring af materialet (figur 3D). Må ikke varme-fix. Mærk den frostet kant af diaset med en blyant.
      Bemærk: Protokollen kan sættes på pause på dette trin, og udstrygninger kan lagres på ubestemt tid, indtil de er klar til at blive plettet.

3. farvning af Smears

Bemærk: Brug handsker under hele proceduren, og sørg for, at trin 3.1.4 og 3.2.9 udføres inde i en stinkhætte.

  1. Giemsa farvnings protokol
    1. Fastgør luft tørrede udstrygninger ved at nedsænkes gliderne i en Coplin-krukke med 100% methanol i 5 min (figur 3e).
    2. Overflyt diaset til en Coplin-krukke, der indeholder 20% Giemsa-opløsning (fortyndet til 1/5 i destilleret vand) i 30 min, eller 10% Giemsa i 10 min (figur 3F).
    3. Skyl af i vand fra hanen og tør grundigt ved hjælp af silkepapir til DAB.
    4. Hold diaset vandret, og Påfør en dråbe af det ikke-vandige monterings medium på smear. Placer kanten af et dækglas på diaset, Sænk det, og tryk forsigtigt for at fjerne eventuelle luftbobler.
  2. Immunocytokemi i FNA-udstrygninger
    1. Fastgør luft tørrede udstrygninger i 100% methanol ved stuetemperatur i 10 min.
    2. Vask diaset i 5 min i en Coplin krukke med 1x fosfatbuffer (PBS), gentage dette trin 3 gange ved hjælp af frisk 1x PBS hver gang.
    3. Fjern diaset fra coplin jar, tør overskydende buffer uden at røre smøre og tegne en cirkel omkring smøre med en vandafvisende pen (tabel over materialer).
    4. Hold diaset vandret, og Anvend 150 μl fortyndet primær antistof opløsning på hver smøre, og Inkuber i 1 time ved stuetemperatur.
      Bemærk: Primære antistof anvendes her er en ikke-renset kaninserum anti-T. brucei VSG13 antigen (Cross-reaktiv med mange T. brucei vsgs, produceret in-House), fortyndet i 1x PBS på 1:50000. Udfør negative kontroller ved at erstatte det relevante primære antistof med præimmun serum (tabel over materialer) for at gøre det muligt at vurdere den ikke-specifikke binding af det sekundære antistof.
    5. Vask diaset i 5 min i en Coplin krukke med 1x PBS, gentage dette trin 3 gange ved hjælp af frisk 1x PBS hver gang.
    6. Hold diaset vandret, og Anvend 150 μL kommercielt tilgængeligt peberrod-peroxidase/DAB-visualiserings system til hver smear. Inkuber i 30 minutter ved stuetemperatur (tabel over materialer).
    7. Vask til 3x i 5 minutter i 1x PBS.
    8. Modpletten ved at nedsænkes gliderne i en Coplin-krukke, der indeholder Harris hematoxylin. Skyl af i vand fra hanen og tør grundigt med papir til DAB.
    9. Hold diaset vandret, og Påfør en dråbe af det ikke-vandige monterings medium på smear. Placer kanten af et dækglas på diaset, Sænk det, og tryk forsigtigt for at fjerne eventuelle luftbobler.

Representative Results

Fna blev udført i de ydre mandlige reproduktive organer af mus inficeret med T. brucei ved hjælp af en 22 G nål koblet til en 5 ml sprøjte, og glas glider til smøre forberedelse (figur 1a-C). Metoden er enkel, men optimale resultater afhænger af kritiske trin: perfekt immobilisering af musen opnået gennem generel anæstesi, og stabilisering af organerne under hele proceduren (figur 2a-B). Suge blev anvendt 2-3 gange og nål omdirigeret 1-2 gange for at give mulighed for repræsentative prøveudtagning af de mindre organer og væv: epididymis og epididymale fedt. Negativt tryk blev frigivet før eksteralisering af nålen. Aspiratet indeholdt i nålens lumen og knudepunkt (ca. 20 μL) blev anvendt til at fremstille 2 udstrygninger (figur 3a-C). I tilfælde, hvor nålen blev trukket tilbage uden frigivelse af Sugningen, blev materialet suget ind i sprøjten og kunne ikke erstattes. Processen blev gentaget to gange, én for hvert parret organ. Efter tørring, udstrygninger var våd-fast og immuncytokemi for trypanosome overflade proteiner blev udført.

En god kvalitet smøre (figur 4a-C) var karakteriseret ved en enkeltlags af celler med god cellulær tæthed, hvor værtscellerne viser bevarede morfologiske egenskaber, der giver mulighed for identifikation af deres væv af oprindelse og relative forholdet mellem hinanden. Parasitter var effektivt immuno-farvede, identificerbare og tælerbare (figur 4b). Et tilfælde af en FNA af en peritonealdialyse effusion i en inficeret mus, farves med Giemsa for direkte observation og diagnose, er også vist (figur 3D-F og figur 4c).

Et dårligt eller negativt FNA-resultat kan skyldes forskellige årsager: (1) for lidt FNA-materiale udtrykkes på diaset og er under repræsentativt for prøven; (2) for meget FNA-materiale udtrykkes på et enkelt dias, hvilket gør alt for tykke udstrygninger og hæmmer cytologiske evaluering; (3) for meget kraft påføres, når du laver smear, og cellerne forstyrres, hvilket resulterer i en masse nøgne kerner og DNA-striber (Crush artefakt); eller (4) der anvendes ikke tilstrækkelig kraft, når smøre og cellerne ikke opløses, hvilket resulterer i et stratificeret lag, som hæmmer vurderingen af cellernes morfologiske egenskaber (figur 5).

Når vi sammenligner FNA-cytopathologi med histopatologi, dvs analyse af celler versus væv, knytnæve har den fordel, at cellulære morfologi er bedre bevaret og relative proportioner og tælling af celler kan bedre vurderes (figur 6). Desuden er immuncytokemi enklere, hurtigere og nemmere at optimere end immun histokemi, som typisk udføres i formalin-fast og paraffin-indlejret væv.

Mål Programmer Fordele Begrænsninger
Håndgribelig masse Rutinemæssig mikroskopi, diagnose Enkel, hurtig Ingen vævs arkitektur
Orgel Immunhistokemi Billig Blind aspiration (nål kan savne mål tangentielt; aspiration kan målrette nekrotiske, cystiske eller hæmoragiske områder)
Hydrothorax Flow cytometri Prøveudtagning fra flere websteder
Cytogenetik Velbevaret cellulære morfologi
Elektronmikroskopi Fri for komplikationer
PCR, andre molekylære teknikker Høj diagnostisk nøjagtighed
Biokemisk analyse Anæstesi (til immobilisering)
In vitro-assays, cellekultur Ikke-Terminal procedure

Tabel 1: mål, generelle anvendelser, fordele og begrænsning af fine nåle aspiration.

FNA-sæt Arketype af en Aspirations nål og sprøjte
Aspiration: Nåle dele:
1. engangssprøjter af plast (5 eller 10 mL) (figur 1b) Bevel. Spidsen af nåle akslen er skrå til at danne et punkt, den skrå er facet. Kun affasede nåle er velegnede til perkutane aspirationer.
3. nåle på 22 til 25-gauge (diameter); 0,75, 1,0, 1,5 inches lang, med standard facet skrå nålespids kant (figur 1a) Aksel. Hule rørformede del af nålen, hvis længde kan justeres i henhold til dybden af massen. Nåle måleren svarer til diameteren af dens boring, som er diameteren af indersiden af akslen (mindre nåle har højere måler). Brugen af større bore nåle (mindre end 22 G) er nyttigt for at øge cellulariteten, selv om dette kan producere overdreven iatrogen blod kontaminering.
1. anæstesi (om nødvendigt). Smerter forbundet med FNA svarer til en venøs punktering, men god aspiration kræver god immobilisering af motivet, specielt vigtigt i små dyr og/eller for små, svingende læsioner og organer. Rotter og mus, der er omfattet af FNA, bør være passende passivt tilbageholdende eller, når det er nødvendigt, bedøvet eller være under let generel anæstesi. Hub. Plastik del af nålen, der er fastgjort til sprøjten; bør være gennemsigtige for at muliggøre visualisering af det aspirerede materiale. Det Aspirér materiale, der opnås under Fna, skal opsamles i nåle akslen, og aspiration stoppes, når der ses materiale ind i navet.
Fna-smøre-fremstilling og-tolkning: Sprøjte dele:
1. matteret ende glas mikroskop slides (figur 1c) Tønde/cylinder. Den hule del af sprøjten. Medmindre der beskæftiger sig med cystiske læsioner eller effusioner, materiale, som aspireres til tønden generelt ikke kan inddrives. Ideal volumen af aspirat for FNA cytologi er ca 5 μL, svarende til den gennemsnitlige volumen af aspirat, der indtager akslen og knudepunkt af nålen.
2. rombe type pletter (f. eks. diff-Quik, Giemsa) Tip. Enden af tønden, som nåle hubben er fastgjort til.
3. mikroskopet (lyst felt) Stemplet. Bevægelige del af sprøjten, der har en flad skive eller læbe i den ene ende og en gummiforsegling i den anden ende. Passer ind i tønden og giver trykket til at trække cellerne, væske i nålen. Et perfekt forseglet stempel, der skaber et godt negativt tryk, er obligatorisk for at opnå et godt aspirat udbytte.

Tabel 2: udstyr og forsyninger, der er nødvendige for fin nåle aspiration.

Figure 1
Figur 1 : Værktøjer og resultater for fin nåle aspiration. (A) den ideelle diameter af NÅLEN til Fna er fra 22 til 25 G.B) den ideelle sprøjte volumen for at opnå et godt aspirat udbytte er 5 til 10 ml. (C) ren, tør, fri for fedt glas slide med frostet mærknings område til skrivning med blyant og præ-belagt (hvis for immun histokemi). D) eksempel på Trypanosomer observeret med Giemsa farvning (sort pilespids), immun plettet for VSG overflade proteiner (hvid pilespids) og under transmission elektronmikroskopi (blok pil). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Skematik, der viser fin nåle aspiration (Fna) af de ydre mandlige reproduktive organer (testis, epididymis og epididymale fedt) i musA) når dyret er sikret, afhentes det tidligere monterede Aspirations instrument. (B-C) Indsæt kanylespidsen i målorganet. (D) Påfør Sugningen ved at trække stemplet tilbage til 1 ml til 2 ml mærket, gentagne gange 3-4 gange. Nålespids kan også flyttes frem og tilbage inden for målet, mens du anvender suge, at indsamle tilstrækkeligt materiale. (E) frigør sugesen, og træk først nålen ud. (F) Fjern kanylen fra sprøjten og (G) træk stemplet tilbage. (H) Monter nålen igen. (I) Udsæt materialet på et glas skred ved hurtigt at skubbe stemplet gennem sprøjten. For at undgå splattering, sikre, at spidsen af nålen hvile meget tæt på eller endda på diaset. Dråbe aspirat anbringes ca. 1 cm fra kanten af det frostet mærknings område. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Smear forberedelse og farvning. (A) hold den ene ende af diaset (frostet område) mellem tommelfingeren og pegefingeren. (B) Anbring den glatte, rene kant af et andet dias (sprederen) på prøve sliden lige foran dråbe materialet. (C) skub spændet fremad en gang med moderat hastighed for at opnå en tynd film. (D) Lad diaset lufttørre og mærke den frostet kant af diaset med en blyant. (E) efter komplet tørring med methanol i 5 min. (F) bejdsning med 20% Giemsa-opløsning i 30 minutter (eller 10% Giemsa i 10 min.). Skyl forsigtigt med vand, tør helt, dyp i xylen og monteret med et vand uopløseligt monterings middel. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 : Mikrofotografier af udstrygninger opnået fra Fna af eksterne mandlige reproduktive strukturer hos mus inficeret med T. brucei. A) groft udseende af en god kvalitet direkte smøre: materialet blev udtrykt på diaset ca. 1 cm væk fra den frostet kant (sort prik), smurt og stoppet 0,5 cm før kanten af diaset (parallelle linjer). (B) immunocytokemi for overfladen proteiner af parasiten (VSG) blev udført for udstrygninger opnået fra Fna af de ydre mandlige reproduktive organer på dag 6 af infektion. Talrige parasitter (Arrowhead) blev fundet tilblandet med muse kimceller (pil). DAB-over farves med Harris hematoxylin. Oprindelig forstørrelse: 40x (Skaleringsbar = 50 μm). C) Giemsa-farvning af smøre opnået efter Fna af en peritonealdialyse effusion på dag 21 af infektionen, viste talrige parasitter (Arrowhead) tilblandet med Host (mus) celler, i dette tilfælde inflammatoriske celler, makrofager (pil) og lymfocytter. Oprindelig forstørrelse: 40x (Skaleringsbar = 50 μm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 : Ringe kvalitet Fna Smears. A) dårligt cellulært smear, der er under repræsentativt for massen eller organet. B) meget tyk smear. C) knust artefakt med forstyrrede celler, nøgne kerner og DNA-striber. D) aggregater og stratificerede lag af celler. DAB-over farves med Harris hematoxylin. Oprindelig forstørrelse: 20x (skala bjælke = 100 μm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6 : Sammenligning af epididymale cytologi og histologi hos mus, som er inficeret med T. brucei. A) mikrofotografier svarende til en Fna-smøre ogB) et paraffin afsnit på 4 μm, med samme forstørrelse (20x oprindelig forstørrelse, skala stang = 100 μm), begge immun farvede for parasitens overflade proteiner (VSG). Smøre viste et stort antal parasitter (Arrowhead) med velbevaret cellulære morfologi, tilblandet med moderat antal kimceller og få spermatozoer (pil). Den histologiske del viste en velbevaret vævs arkitektur, sammensat af epididymale kanaler med intra-luminal spermatozoer (pil), og tilstedeværelsen af et stort antal parasitter, der udvider epididymale stroma (Arrowhead). DAB-over farves med Harris hematoxylin. Oprindelig forstørrelse: 20x (skala bjælke = 100 μm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Fine needle aspiration (FNA) er en metode, der anvendes i vid udstrækning til at diagnosticere sygdomme hos mennesker og husdyr. Teknikken er blevet standardiseret over mange år1,2, somgør brug af en lille bore nål til at aspirere celler eller væske fra en håndgribelig masse eller organ1,3. Aspiratet er derefter typisk smurt på en glas slide og farves for mikroskopisk observation for at opnå en diagnose, men teknikken kan også bruges til at hente celler til andre formål4,5,6, 7 , 8 , 9.

Proceduren er hurtig (< 5 min per mus, for en erfaren forsker) og risikoen for komplikationer er minimal, svarende til den risiko, der opstår, når undergår enkel venøs punktering. Af denne grund, for FNA af håndgribelig masse, anæstesi er kun påkrævet for følsomme anatomiske steder eller når en god immobilisering af dyret og stabilisering af orgel eller masse, der skal aspireres er yderst afgørende for optimale resultater. Dette er hyppige for små forsøgsdyr, som sikker og effektiv tilbageholdenhed af en lille gnaver med den ene hånd, samtidig med at den bedste adgang til området for aspiration med den anden hånd, er svært at opnå uden anæstesi. Kortsigtet anæstesi er i de fleste tilfælde tilstrækkeligt, ikke desto mindre nødvendigt, for en god FNA i musen. En god immobilisering maksimerer chancerne for at opnå en aspirat, der er repræsentativ for de cellulære komponenter i læsionen og også minimerer chancerne for eksteralisering spidsen af nålen, mens negative tryk påføres.

Selv om selve proceduren er meget enkel, er koordineret anvendelse og frigivelse af vakuum de mest kritiske trin. Efter indsættelse af nålen trækkes sprøjtens stempel tilbage for at opnå et kontrolleret vakuum (sugning), og nålen kan kun fjernes fra massen efter frigivelse af det negative tryk ved at give slip på stemplet (figur 2); ellers aspiratet suges ind i cylinderen af sprøjten og er så meget svært at komme sig. Et andet meget vigtigt skridt er forberedelsen af høj kvalitet Smears. Der er forskellige metoder til at gøre en smøre men uanset metoden, udstrygninger bør forberedes umiddelbart efter materialet er blevet placeret på glasset. Det biologiske materiale skal spredes forsigtigt for at undgå celle knuse artefakter. Brug af en dækglas som Sprederen kan hjælpe med at forhindre disse artefakter. Men, anvendelsen af for meget kraft, mens du gør smøre vil bryde coverslip. En god kvalitet smøre typisk har de fleste af celle befolkningen distribueret som enkeltlags, så de nemt kan sende lys. Cellulære materiale bør ikke være alt for fanget i blodprop.

Målet med en FNA er at indsamle celler fra en masse, væv eller orgel. Brugen af større bore nåle er nyttigt at øge cellularitet, men kan være forbundet med overdreven blod kontaminering, mens prøvetagning med mindre nåle giver højere kvalitet, men mindre rigelige materiale. I vores tilfælde, perkutan aspiration af de ydre mandlige reproduktive strukturer i mus eksperimentelt inficeret med T. brucei, blev udført med 22-gauge nåle koblet til en 5 ml sprøjte. Mus blev bedøvet, testierne blev stabiliseret med den ene hånd og punktering og aspiration guidet og udført med den anden hånd. Vi hentede talrige trypanosomes blandet med kimceller, spermatozoer, epiteliale celler og stromale celler, som blev smurt og immun farvede for parasitterne ' overflade proteiner (VSG) (figur 4).

Der er altid den potentielle stikprøvefejl i aspirater giver negative resultater, fordi selv om flere områder af en given læsion kan udtages flere gange, dette er en blind aspiration, hvor vi ikke visualisere nålen spids og målorgan eller masse. Dette er yderst relevant i en klinisk indstilling, hvor en negativ FNA af en mistænkelig læsion ikke udelukker yderligere undersøgelser, men det er ikke så relevant i dyremodeller af sygdom. Generelle begrænsninger omfatter således primært falsk negative resultater og mindre hyppigt falske positive resultater (f. eks. fra blod forurening), men den vigtigste begrænsning i fastsættelsen af dyreforsøg er manglen på oplysninger om vævs arkitektur17, som vi har med histopatologi, fx fordeling mønster af parasitter, af immunceller, og celle-celle interaktion funktioner. Ikke desto mindre, fordele er, at FNA er en ikke-Terminal procedure giver mulighed for gentagen prøvetagning i samme dyr over tid og altid giver mulighed for bedre bevaret cellulære morfologi (figur 5). Alternativer til FNA til høst værtsceller, immunceller eller mikroorganismer fra en mus altid stole på euthanizing musen til at indsamle massen eller organer af interesse.

Til vores viden, er der kun et par rapporter om brugen af FNA i små forsøgsdyr, en fra 1949 svarende til aspiration af knoglemarv med 22 G nål til at studere hæmatopoiese18, og alle andre i kombination med flow cytometri til kvantificere enten tumor-associerede inflammatoriske celler eller endotelceller7,19,20. Vores arbejde viser, at denne teknik kan udvides til diagnosticering og undersøgelse af smitsomme sygdomsmodeller og kan kombinere cytologi med teknikker som immuncytokemi eller elektronmikroskopi. To af de vigtigste fordele ved metoden i forsøgsdyr er: (1) denne procedure er ikke Terminal, dvs kan udføres i levende mus; og (2) på grund af sin milde sværhedsgrad det giver mulighed for serielle forhåbninger i det samme dyr. Der kræves derfor færre mus til hver undersøgelse, og sammenhængen mellem progression af klinisk sygdom og udviklingen af de cellulære og molekylære egenskaber ved en sygdom og/eller mikroorganisme kan let udføres, hvilket muliggør longitudinale undersøgelser.

Måske er den første rapport om brugen af FNA til diagnosticering af en infektionssygdom en undersøgelse af Grieg og Gray i 1904, der rapporterer nåle aspirationer af lymfeknuder fra patienter med sovende sygdom, som afslørede motile sædceller trypanosomes12. Hvis vores resultater i laboratorie mus finde oversættelse til kvæg, dvs, at hvis Trypanosoma let kan udtages af Fna fra de eksterne mandlige reproduktive strukturer, man kan forvente, at denne teknik vil være nyttigt at dyrlæger til diagnosticering af animalske trypanosomiasis in-Farm, i husdyr.

Disclosures

Forfatterne har intet at afsløre.

Acknowledgments

Dette projekt blev finansieret af Fundação para a Ciência e a tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência, tecnologia e ensino Superior (MCTES) gennem Fundos do Orçamento de Estado (Ref.: ID/BIM/50005/2019). LMF er undersøger af Fundação para a Ciência e tecnologia (IF/01050/2014), og laboratoriet er finansieret af ERC (FatTryp, Ref. 771714). Offentliggørelsen af dette arbejde blev også finansieret UID/BIM/50005/2019 projekt finansieret af Fundação para a Ciência e a tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência, tecnologia e ensino Superior (MCTES) gennem Fundos do Orçamento de Estado. Vi takker Andreia Pinto fra den histologi og komparativ patologisk laboratorium af iMM for ekspert elektronmikroskopi assistance, og Sandra Trindade, Tiago Rebelo og Henrique Machado (iMM) for deling af væv fra inficerede mus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL) Bio 2 7418046 Anesthesia reversal
Cover slips (24 x 60 No.1) VWR 631-0664 Smear making
DAB Dako K3468 Immunocytochemistry
Entellan (500 mL) VWR 1.07961.0500 Mounting media
Envision Flex antibody diluent Dako 8006 Immunocytochemistry
EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit) Dako K4010 Immunocytochemistry
Envision Flex Wash Buffer Dako K8007 Immunocytochemistry
Giemsa stain Atom Scientific Ltd RRSPSS-A Smear staining
Glass slides (Superfrost Plus) VWR 631-9483 Smear making
Harris Haematoxylin Bio-optica 05-06004E Immunocytochemistry
Hydrogen Peroxidase solution Sigma H1009-500ML Immunocytochemistry
Hypodermic needles Microlance 3 (23 G) Henry Schein 902-8001 Aspiration technique
Ketamin (IMALGENE 1,000-10 mL) Bio 2 7410928 Anesthesia
Medetomidine (DOMITOR 10 mL) Bio 2 7418335 Anesthesia
Methanol Merck 1.06009.2511 Smear fixative
Pap pen Merck Z377821-1EA Immunocytochemistry
Protein Block Serum free Dako X0909 Immunocytochemistry
Syringes (5 mL, 10 mL) Henry Schein 900-3311, 900-3304 Aspiration technique

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leopold, G., Koss, M. R. M. Koss’ Diagnostic cytology and it’s histologic bases. Lippincott Williams and Wilkins. (2006).
  2. Raskin, R. E., Meyer, D. J. Canine and Feline Cytology: a Color Atlas and Interpretation Guide. Canine and Feline Cytology. (2016).
  3. Hopper, K. D., Abendroth, C. S., Sturtz, K. W., Matthews, Y. L., Shirk, S. J. Fine-needle aspiration biopsy for cytopathologic analysis: Utility of syringe handles, automated guns, and the nonsuction method. Radiology. 185, (3), 819-824 (1992).
  4. Saliba, A. E., et al. Microfluidic sorting and multimodal typing of cancer cells in self-assembled magnetic arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 107, (33), 14524-14529 (2010).
  5. Guzera, M., Cian, F., Leo, C., Winnicka, A., Archer, J. The use of flow cytometry for immunophenotyping lymphoproliferative disorders in cats: a retrospective study of 19 cases. Veterinary and Comparative Oncology. 14, 40-51 (2016).
  6. Young, N. A., Al-Saleem, T. I., Ehya, H., Smith, M. R. Utilization of fine-needle aspiration cytology and flow cytometry in the diagnosis and subclassification of primary and recurrent lymphoma. Cancer. 40, (4), 307-319 (1998).
  7. Carroll, C. S. E., Altin, J. G., Neeman, T., Fahrer, A. M. Repeated fine-needle aspiration of solid tumours in mice allows the identification of multiple infiltrating immune cell types. Journal of Immunological Methods. 425, 102-107 (2015).
  8. Araujo, R. W., Paiva, V., Gartner, F., Amendoeira, I., Martinez Oliveira, J., Schmitt, F. C. Fine needle aspiration as a tool to establish primary human breast cancer cultures in vitro. Acta Cytologica. 43, (6), 985-990 (1999).
  9. Craft, I., et al. Percutaneous epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection in the management of infertility due to obstructive azoospermia. Fertility and Sterility. 63, (5), 1038-1042 (1995).
  10. Powers, C. N. Diagnosis of infectious diseases: A cytopathologist’s perspective. Clinical Microbiology Reviews. 120, (3), 351-367 (1998).
  11. Diamantis, A., Magiorkinis, E., Koutselini, H. Fine-needle aspiration (FNA) biopsy: Historical aspects. Folia Histochemica et Cytobiologica. 47, (2), 191-197 (2009).
  12. Greig, E. D. W., Gray, A. C. H. Note on the lymphatic glands in sleeping sickness. British Medical Journal. 1, (2265), 1252 (1904).
  13. Robson, J., Ashkar, T. S. Trypanosomiasis in domestic livestock in the Lambwe Valley area and a field evaluation of various diagnostic techniques. Bulletin of the World Health Organization. 47, (6), 727-734 (1972).
  14. Disease, T. African Animal Trypanosomiasis. In Vitro. 1-15 (2009).
  15. Kennedy, P. G. E. Clinical features, diagnosis, and treatment of human African trypanosomiasis (sleeping sickness). Lancet Neurology. 12, (2), 186-194 (2012).
  16. Trindade, S., et al. Trypanosoma brucei parasites occupy and functionally adapt to the adipose tissue in mice. Cell Host and Microbe. 19, (6), 837-848 (2016).
  17. Carvalho, T., Trindade, S., Pimenta, S., Santos, A. B., Rijo-Ferreira, F., Figueiredo, L. M. Trypanosoma bruceitriggers a marked immune response in male reproductive organs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12, (8), 1-15 (2018).
  18. Sundberg, R. D., Hodgson, R. E. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, (5), 557-561 (2013).
  19. Sottnik, J. L., Guth, A. M., Mitchell, L. A., Dow, S. W. Minimally invasive assessment of tumor angiogenesis by fine needle aspiration and flow cytometry. Angiogenesis. 13, (3), 251-258 (2010).
  20. Betka, J., Hovorka, O., Boucek, J., Ulbrich, K., Etrych, T., Rihova, B. Fine needle aspiration biopsy proves increased T-lymphocyte proliferation in tumor and decreased metastatic infiltration after treatment with doxorubicin bound to PHPMA copolymer carrier. Journal of Drug Targeting. 21, (7), 648-661 (2013).
Påvisning af ekstravaskulære <em>Trypanosoma</em> -parasitter ved fin nåle aspiration
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carvalho, T., Santos, A. M., Figueiredo, L. M. Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration. J. Vis. Exp. (150), e59798, doi:10.3791/59798 (2019).More

Carvalho, T., Santos, A. M., Figueiredo, L. M. Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration. J. Vis. Exp. (150), e59798, doi:10.3791/59798 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter