Fin nål aspiration er en teknik, hvorved celler er opnået fra en læsion eller orgel ved hjælp af en tynd nål. Aspireret materiale er smurt, plettet og undersøgt under et mikroskop til diagnosticering eller anvendes til molekylær biologi, cytometri eller in vitro-analyse. Det er billigt, enkelt, hurtigt og forårsager minimal traume.
Fine needle aspiration (FNA) er en rutinemæssig diagnostisk procedure, der er afgørende for både medicinsk og veterinær praksis. Det består af den perkutane aspiration af celler og/eller mikroorganismer fra håndgribelige masser, organer eller effusioner (væskeophobning i en krop hulrum) ved hjælp af en tynd nål svarende til den normale nål anvendes til venøs punktering. Det materiale, der indsamles af FNA er generelt meget cellulære, og den hentede aspirat er derefter smurt, lufttørret, våd-fast, plettet og observeret under et mikroskop. I den kliniske sammenhæng, er FNA et vigtigt diagnostisk værktøj, der fungerer som en vejledning til den relevante terapeutiske forvaltning. Fordi det er enkelt, hurtigt, minimalt invasivt og kræver begrænset investering i laboratoriet og de menneskelige ressourcer, det er flittigt brugt af dyrlæger, for det meste i det indenlandske, men også i husdyr. I undersøgelser, der anvender dyremodeller, har FNA den fordel, at det kan udføres gentagne gange i det samme dyr, hvilket muliggør langsgående undersøgelser gennem indsamling af celler fra tumorer og organer/væv i løbet af sygdommen. Ud over rutinemæssig mikroskopi kan hentet materiale også anvendes til immunocytokemi, elektronmikroskopi, biokemisk analyse, flow cytometri, molekylær biologi eller in vitro-assays. FNA er blevet brugt til at identificere protozoen parasisitet Trypanosoma brucei i gonader af inficerede mus, der åbner mulighed for en fremtidig diagnose i kvæg.
Fin nål aspiration (FNA) er meget udbredt i diagnosticering af kræft og ikke-neoplastiske sygdomme, både hos mennesker og husdyr. Teknikken er blevet standardiseret gennem årene og er beskrevet i talrige lærebøger1,2.
Det består i vid udstrækning af den perkutane aspiration af håndgribelig masse, organer eller effusioner med en tynd nål monteret på en tom sprøjte, ved hjælp af det negative Tryk for at trække celler eller væske fra massen1,3. Nåle er typisk 22 til 25 G (gauge svarende til nålen indre diameter), og brugen af en større bore nål (stor diameter, f. eks, 21 G) er nyttigt at øge cellularitet, selv om dette kan producere overdreven blod kontaminering. Nål længde vil afhænge af dybden af massen, men 1 eller 11/2 tommer er almindeligt anvendt til overfladiske masser. Sprøjter er typisk 5 til 10 mL, med større sprøjter opnå højere vakuum, hvilket igen øger aspirat udbytte. Ikke-håndgribelig dybtliggende masser kan også aspireres, med længere nåle og under billed vejledning (ultrasonografi). Den hentede aspirat kan derefter smøres, lufttørret, våd-fast, plettet og observeret under et mikroskop for at opnå en diagnose3 (figur 1).
Dette er en enkel, billig, smertefri og minimalt invasiv teknik, der hovedsagelig anvendes i den præoperative indstilling for at opnå en diagnose på hånd løse masser og også for organer, ligesom lymfeknuder, skjoldbruskkirtlen, prostata eller endda de eksterne mandlige reproduktive strukturer 1. ud over at være et diagnostisk værktøj, denne teknik kan bruges til indsamling af celler til andre formål samt, nemlig Cytogenetik, elektronmikroskopi (figur 1d), flow cytometrisk karakterisering4,5 ,6,7, etablering af cellekulturer8. Et almindeligt eksempel i klinisk praksis er sperm hentning for in vitro fertilisering9.
Aspiration kan gentages flere gange i samme masse for at opnå flere Smears. I tilfælde af en heterogen læsion, f. eks, et solidt område og et cystisk rum, er det vigtigt, at cellerne aspireres fra hver region. Det materiale, der indsamles af FNA er generelt meget cellulære, som i de fleste tilfælde giver mulighed for diagnosticering af sygdomme uden behov for en vævs biopsi. Særlige pletter, immunofluorescens. immunocytokemi (figur 1d), og molekylære teknikker kan også udføres i udstrygninger opnået gennem Fna, f. eks, til identifikation af infektiøse agenser, når de ikke kan genkendes af morfologi alene10. En kort oversigt over de generelle anvendelser og det udstyr og de forsyninger, der er nødvendige for FNA, er opsummeret i henholdsvis tabel 1 og 2.
Den første rapport om brugen af nålen punktering til diagnostiske formål er beskrevet i tidlige skrifter af arabisk medicin, men det er i begyndelsen af det tyvende århundrede, moderne nåle aspiration teknikker blev implementeret11. Især, måske den første rapport, der foreslår brugen af FNA til diagnosticering af smitsomme sygdomme var en undersøgelse i 1904, hvor Grieg og grå rapporterede nåle aspirationer af lymfeknuder fra patienter med sovende sygdom afsløret motile sædceller trypanosomes12 . Forfatterne rapporterede tilstedeværelsen af trypanosomer i både tidlige og avancerede tilfælde, og ved en højere tæthed end set i blod udstrygninger, hvor disse er ofte sjældne hændelser12.
Aktuel diagnose af trypanosomiasis hos kvæg afhænger af den direkte observation af parasitter i blodet, lymfeknuder eller i immun diagnostiske teknikker13,14,15. Vi har tidligere vist, at i eksperimentelle Trypanosoma infektioner i mus, Trypanosoma brucei (T. brucei) har en bemærkelsesværdig tropisme til fedtvæv16 og også til nogle af de ydre mandlige reproduktive strukturer, nemlig epididymis17. Parasitter ophobes i stroma af disse væv i stort tal16.
Nedenstående protokol beskriver en detaljeret trin-for-trin teknisk procedure for FNA i levende mus, med henblik på aspiration af trypanosomer til stede i de ydre mandlige reproduktive strukturer (testis, epididymis, og epididymale fedt), efterfulgt af konventionel cytologi og immun farvning for specifikke parasitinproteiner (VSG)16,17. Aspiration blev udført 6 dage efter infektionen og sikkerhedsprocedurer, der gælder, er de almindeligt etablerede for rutinemæssig håndtering af forsøgsdyr. Der kræves yderligere foranstaltninger for dyr, der har immundefekt (iført en damp steriliseret kjole, maske, hårhjelm, sterile handsker, og som sikrer aseptisk teknik til enhver tid) for at afbøde utilsigtet udsættelse for opportunistiske patogener.
Fine needle aspiration (FNA) er en metode, der anvendes i vid udstrækning til at diagnosticere sygdomme hos mennesker og husdyr. Teknikken er blevet standardiseret over mange år1,2, somgør brug af en lille bore nål til at aspirere celler eller væske fra en håndgribelig masse eller organ1,3. Aspiratet er derefter typisk smurt på en glas slide og farves for mikroskopisk observation for at opnå en diagnose, men teknikken kan også bruges til at hente celler til andre formål4,5,6, 7 , 8 , 9.
Proceduren er hurtig (< 5 min per mus, for en erfaren forsker) og risikoen for komplikationer er minimal, svarende til den risiko, der opstår, når undergår enkel venøs punktering. Af denne grund, for FNA af håndgribelig masse, anæstesi er kun påkrævet for følsomme anatomiske steder eller når en god immobilisering af dyret og stabilisering af orgel eller masse, der skal aspireres er yderst afgørende for optimale resultater. Dette er hyppige for små forsøgsdyr, som sikker og effektiv tilbageholdenhed af en lille gnaver med den ene hånd, samtidig med at den bedste adgang til området for aspiration med den anden hånd, er svært at opnå uden anæstesi. Kortsigtet anæstesi er i de fleste tilfælde tilstrækkeligt, ikke desto mindre nødvendigt, for en god FNA i musen. En god immobilisering maksimerer chancerne for at opnå en aspirat, der er repræsentativ for de cellulære komponenter i læsionen og også minimerer chancerne for eksteralisering spidsen af nålen, mens negative tryk påføres.
Selv om selve proceduren er meget enkel, er koordineret anvendelse og frigivelse af vakuum de mest kritiske trin. Efter indsættelse af nålen trækkes sprøjtens stempel tilbage for at opnå et kontrolleret vakuum (sugning), og nålen kan kun fjernes fra massen efter frigivelse af det negative tryk ved at give slip på stemplet (figur 2); ellers aspiratet suges ind i cylinderen af sprøjten og er så meget svært at komme sig. Et andet meget vigtigt skridt er forberedelsen af høj kvalitet Smears. Der er forskellige metoder til at gøre en smøre men uanset metoden, udstrygninger bør forberedes umiddelbart efter materialet er blevet placeret på glasset. Det biologiske materiale skal spredes forsigtigt for at undgå celle knuse artefakter. Brug af en dækglas som Sprederen kan hjælpe med at forhindre disse artefakter. Men, anvendelsen af for meget kraft, mens du gør smøre vil bryde coverslip. En god kvalitet smøre typisk har de fleste af celle befolkningen distribueret som enkeltlags, så de nemt kan sende lys. Cellulære materiale bør ikke være alt for fanget i blodprop.
Målet med en FNA er at indsamle celler fra en masse, væv eller orgel. Brugen af større bore nåle er nyttigt at øge cellularitet, men kan være forbundet med overdreven blod kontaminering, mens prøvetagning med mindre nåle giver højere kvalitet, men mindre rigelige materiale. I vores tilfælde, perkutan aspiration af de ydre mandlige reproduktive strukturer i mus eksperimentelt inficeret med T. brucei, blev udført med 22-gauge nåle koblet til en 5 ml sprøjte. Mus blev bedøvet, testierne blev stabiliseret med den ene hånd og punktering og aspiration guidet og udført med den anden hånd. Vi hentede talrige trypanosomes blandet med kimceller, spermatozoer, epiteliale celler og stromale celler, som blev smurt og immun farvede for parasitterne ‘ overflade proteiner (VSG) (figur 4).
Der er altid den potentielle stikprøvefejl i aspirater giver negative resultater, fordi selv om flere områder af en given læsion kan udtages flere gange, dette er en blind aspiration, hvor vi ikke visualisere nålen spids og målorgan eller masse. Dette er yderst relevant i en klinisk indstilling, hvor en negativ FNA af en mistænkelig læsion ikke udelukker yderligere undersøgelser, men det er ikke så relevant i dyremodeller af sygdom. Generelle begrænsninger omfatter således primært falsk negative resultater og mindre hyppigt falske positive resultater (f. eks. fra blod forurening), men den vigtigste begrænsning i fastsættelsen af dyreforsøg er manglen på oplysninger om vævs arkitektur17, som vi har med histopatologi, fx fordeling mønster af parasitter, af immunceller, og celle-celle interaktion funktioner. Ikke desto mindre, fordele er, at FNA er en ikke-Terminal procedure giver mulighed for gentagen prøvetagning i samme dyr over tid og altid giver mulighed for bedre bevaret cellulære morfologi (figur 5). Alternativer til FNA til høst værtsceller, immunceller eller mikroorganismer fra en mus altid stole på euthanizing musen til at indsamle massen eller organer af interesse.
Til vores viden, er der kun et par rapporter om brugen af FNA i små forsøgsdyr, en fra 1949 svarende til aspiration af knoglemarv med 22 G nål til at studere hæmatopoiese18, og alle andre i kombination med flow cytometri til kvantificere enten tumor-associerede inflammatoriske celler eller endotelceller7,19,20. Vores arbejde viser, at denne teknik kan udvides til diagnosticering og undersøgelse af smitsomme sygdomsmodeller og kan kombinere cytologi med teknikker som immuncytokemi eller elektronmikroskopi. To af de vigtigste fordele ved metoden i forsøgsdyr er: (1) denne procedure er ikke Terminal, dvs kan udføres i levende mus; og (2) på grund af sin milde sværhedsgrad det giver mulighed for serielle forhåbninger i det samme dyr. Der kræves derfor færre mus til hver undersøgelse, og sammenhængen mellem progression af klinisk sygdom og udviklingen af de cellulære og molekylære egenskaber ved en sygdom og/eller mikroorganisme kan let udføres, hvilket muliggør longitudinale undersøgelser.
Måske er den første rapport om brugen af FNA til diagnosticering af en infektionssygdom en undersøgelse af Grieg og Gray i 1904, der rapporterer nåle aspirationer af lymfeknuder fra patienter med sovende sygdom, som afslørede motile sædceller trypanosomes12. Hvis vores resultater i laboratorie mus finde oversættelse til kvæg, dvs, at hvis Trypanosoma let kan udtages af Fna fra de eksterne mandlige reproduktive strukturer, man kan forvente, at denne teknik vil være nyttigt at dyrlæger til diagnosticering af animalske trypanosomiasis in-Farm, i husdyr.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt blev finansieret af Fundação para a Ciência e a tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência, tecnologia e ensino Superior (MCTES) gennem Fundos do Orçamento de Estado (Ref.: ID/BIM/50005/2019). LMF er undersøger af Fundação para a Ciência e tecnologia (IF/01050/2014), og laboratoriet er finansieret af ERC (FatTryp, Ref. 771714). Offentliggørelsen af dette arbejde blev også finansieret UID/BIM/50005/2019 projekt finansieret af Fundação para a Ciência e a tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência, tecnologia e ensino Superior (MCTES) gennem Fundos do Orçamento de Estado. Vi takker Andreia Pinto fra den histologi og komparativ patologisk laboratorium af iMM for ekspert elektronmikroskopi assistance, og Sandra Trindade, Tiago Rebelo og Henrique Machado (iMM) for deling af væv fra inficerede mus.
Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL) | Bio 2 | 7418046 | Anesthesia reversal |
Cover slips (24 x 60 No.1) | VWR | 631-0664 | Smear making |
DAB | Dako | K3468 | Immunocytochemistry |
Entellan (500 mL) | VWR | 1.07961.0500 | Mounting media |
Envision Flex antibody diluent | Dako | 8006 | Immunocytochemistry |
EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit) | Dako | K4010 | Immunocytochemistry |
Envision Flex Wash Buffer | Dako | K8007 | Immunocytochemistry |
Giemsa stain | Atom Scientific Ltd | RRSPSS-A | Smear staining |
Glass slides (Superfrost Plus) | VWR | 631-9483 | Smear making |
Harris Haematoxylin | Bio-optica | 05-06004E | Immunocytochemistry |
Hydrogen Peroxidase solution | Sigma | H1009-500ML | Immunocytochemistry |
Hypodermic needles Microlance 3 (23G) | Henry Schein | 902-8001 | Aspiration technique |
Ketamin (IMALGENE 1000 – 10 mL) | Bio 2 | 7410928 | Anesthesia |
Medetomidine (DOMITOR 10 mL) | Bio 2 | 7418335 | Anesthesia |
Methanol | Merck | 1.06009.2511 | Smear fixative |
Pap pen | Merck | Z377821-1EA | Immunocytochemistry |
Protein Block Serum free | Dako | X0909 | Immunocytochemistry |
Syringes (5 mL, 10 mL) | Henry Schein | 900-3311, 900-3304 | Aspiration technique |