Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

الكشف عن طفيليات التربانوسوما خارج الأوعية الدموية عن طريق الشفط الإبرة الدقيقة

doi: 10.3791/59798 Published: August 7, 2019

Summary

غرامة إبرة الطموح هو تقنية، حيث يتم الحصول على الخلايا من آفة أو عضو باستخدام إبرة رقيقة. يتم تشويه المواد المستنشقة، ملطخة وفحصها تحت المجهر للتشخيص أو استخدامها للبيولوجيا الجزيئية، قياس الخلايا أو التحليل في المختبر. انها رخيصة وبسيطة وسريعة ويسبب الحد الأدنى من الصدمة.

Abstract

الشفط بالإبرة الجميلة (FNA) هو إجراء تشخيصي روتيني ضروري لكل من الممارسات الطبية والبيطرية. وهو يتألف من الطموح عن طريق الجلد من الخلايا و / أو الكائنات الحية الدقيقة من الجماهير واضح، والأعضاء أو الانصباب (تراكم السوائل في تجويف الجسم) باستخدام إبرة رقيقة مماثلة للإبرة العادية المستخدمة للثقب الوريدي. المواد التي تم جمعها من قبل FNA بشكل عام الخلوية للغاية، ويتم تشويه النستناس المستردة ثم، والهواء المجفف، الرطب الثابتة، ملطخة ولاحظ تحت المجهر. في السياق السريري، FNA هو أداة تشخيصية هامة التي تعمل كدليل للإدارة العلاجية المناسبة. ولأنها بسيطة وسريعة وطفيفة التوغل وتتطلب استثمارات محدودة في المختبر والموارد البشرية، فإنها تستخدم على نطاق واسع من قبل الممارسين البيطريين، ومعظمهم في المنازل، ولكن أيضا في الحيوانات الزراعية. في الدراسات التي تستخدم النماذج الحيوانية، FNA لديه ميزة أنه يمكن القيام به مرارا وتكرارا في نفس الحيوان، مما يتيح الدراسات الطولية من خلال جمع الخلايا من الأورام والأعضاء / الأنسجة على مدى المرض. بالإضافة إلى الفحص المجهري الروتيني، يمكن أيضا استخدام المواد المستردة لالكيمياء المناعية، المجهر الإلكتروني، التحليل البيوكيميائي، قياس التدفق الخلوي، البيولوجيا الجزيئية أو الاختبارات المختبرية. وقد استخدمت FNA لتحديد الطفيلي البروتوزوان تريبانوسوما بروسي في الغدد التناسلية للفئران المصابة، وفتح إمكانية لتشخيص في المستقبل في الماشية.

Introduction

يستخدم على نطاق واسع الشفط إبرة غرامة (FNA) في تشخيص السرطان والأمراض غير الأورام، سواء في الحيوانات البشرية والمنزلية. وقد تم توحيد هذه التقنية على مرالسنين، ويرد وصفها في العديد من الكتب المدرسية 1،2.

وهو يتكون إلى حد كبير من الطموح عن طريق الجلد من الجماهير واضح، والأعضاء أو الانصباب مع إبرة رقيقة تركيبها على حقنة فارغة، وذلك باستخدام الضغط السلبي لسحب الخلايا أو السوائل من كتلة1،3. الإبر هي عادة 22 إلى 25 G (قياس المقابلة للقطر الداخلي إبرة)، واستخدام إبرة تتحمل أكبر (قطر كبير، على سبيل المثال، 21 G) مفيد لزيادة الخلوية، على الرغم من أن هذا يمكن أن تنتج تلوث الدم المفرط. طول إبرة سوف تعتمد على عمق الكتلة ولكن 1 أو 1 1 × بوصة يستخدم عادة للجماهير السطحية. المحاقن عادة ما تكون 5 إلى 10 مل، مع محاقن أكبر تحقيق فراغ أعلى، مما يزيد بدوره من العائد يستنشق. كما يمكن أيضًا استنشاق الكتل العميقة الجذور غير الملموسة، مع الإبر الأطول وتحت توجيه الصورة (التصوير بالموجات فوق الصوتية). ويمكن بعد ذلك تشويه النقاق المستردة، والهواء المجفف، الرطب الثابتة، وملطخة ولاحظ تحت المجهر لتحقيق التشخيص3 (الشكل1).

هذا هو أسلوب بسيط، غير مكلفة، غير مؤلم ة طفيفة التوغل تستخدم أساسا في إعداد ما قبل الجراحة لتحقيق التشخيص على الجماهير واضح وأيضا للأعضاء، مثل الغدد الليمفاوية، الغدة الدرقية، البروستاتا أو حتى الهياكل التناسلية الذكور الخارجية 1.بالإضافة إلى كونها أداة تشخيصية، يمكن استخدام هذه التقنية لجمع الخلايا لأغراض أخرى أيضا، وهي علم الوراثة الخلوية، المجهر الإلكتروني (الشكل1D)،تدفق التوصيف الخلوي5 ،6،7، إنشاء الثقافات الخلية8. ومن الأمثلة الشائعة في الممارسة السريرية استرجاع الحيوانات المنوية للإخصاب في المختبر9.

يمكن تكرار الطموح عدة مرات في نفس الكتلة للحصول على مسحات متعددة. في حالة وجود آفة غير متجانسة ، على سبيل المثال ، منطقة صلبة ومساحة كيسية ، من المهم أن يتم استنشاق الخلايا من كل منطقة. المواد التي تجمعها FNA بشكل عام الخلوية للغاية، والذي يسمح في معظم الحالات لتشخيص الأمراض دون الحاجة إلى خزعة الأنسجة. بقع خاصة، الفلورة المناعية. الكيمياء المناعية (الشكل1D)،ويمكن أيضا أن يتم تنفيذ التقنيات الجزيئية في مسحات التي تم الحصول عليها من خلال FNA، على سبيل المثال، لتحديد العوامل المعدية عندما لا يمكن التعرف عليها من قبل مورفولوجيا وحدها10. ويرد في الجدولين 1 و2، على التوالي، موجز لمحة عامة عن التطبيقات العامة والمعدات واللوازم اللازمة لـ FNA.

ويرد وصف التقرير الأول عن استخدام ثقب الإبرة لأغراض التشخيص في الكتابات المبكرة للطب العربي، ولكن في أوائل القرن العشرين تم تنفيذ تقنيات التطلع بالإبرة الحديثة11. وتجدر الإشارة إلى أن التقرير الأول الذي يشير إلى استخدام FNA لتشخيص الأمراض المعدية كان دراسة في عام 1904، حيث أبلغ جريج وغراي عن تطلعات إبرة العقد الليمفاوية من المرضى الذين يعانون من مرض النوم كشفت موتيلي تريبانوسومس12 . وأفاد المؤلفون بوجود التربانوسوم في كل من الحالات المبكرة والمتقدمة، وفي كثافة أعلى من تلك التي شوهدت في مسحات الدم، حيث تكون هذه في كثير من الأحيان أحداث نادرة12.

التشخيص الحالي لداء المثقبيات في الماشية يعتمد على المراقبة المباشرة للطفيليات في الدم أو الليمفاوية أو في تقنيات التشخيص المناعي13،14،15. لقد أظهرنا سابقا أنه في العدوى التربانوموسوما التجريبية في الماوس، تريبانوسوما بروسي (T.بروسي)لديه تروبيسم ملحوظا لالدهنية الأنسجة16 وأيضا لبعض الهياكل التناسلية الذكور الخارجية، وهي البربخ17. تتراكم الطفيليات في ستروما من هذه الأنسجة بأعداد كبيرة16.

يصف البروتوكول الموضح أدناه إجراءً تقنياً مفصلاً خطوة بخطوة لـ FNA في الفئران الحية، يهدف إلى طموح التربانوسوم الموجود ة في الهياكل التناسلية الخارجية للذكور (الخصية، والبربخ، والدهون الميبيدية)، تليها علم الخلايا التقليدي وتلطيخ المناعة لبروتينات طفيلية محددة (VSG)16،17. تم إجراء الطموح بعد 6 أيام من العدوى وإجراءات السلامة التي تنطبق هي تلك التي أنشئت عادة للتعامل الروتيني مع الحيوانات التجريبية. يلزم اتخاذ تدابير إضافية للالحيوانات التي تعاني من نقص المناعة (ارتداء ثوب معقم بالبخار، قناع، غطاء محرك السيارة الشعر، قفازات معقمة، وضمان تقنية العقيم في جميع الأوقات) للتخفيف من التعرض العرضي للأمراض الانتهازية.

Protocol

وقد أجريت جميع التجارب الحيوانية في هذا البروتوكول وفقا للوائح الاتحاد الأوروبي ووافقت عليها لجنة أخلاقيات الحيوان في معهد الطب الجزيئي (iMM)، (AEC_2011_006_LF_TBrucei_IMM). المرفق الحيواني iMM يتوافق مع القانون البرتغالي لاستخدام الحيوانات المختبرية (المرسوم بقانون 113/2013) ويتبع التوجيه الأوروبي 2010/63/EU وFELASA (اتحاد الرابطات الأوروبية لعلوم الحيوانات المختبرية) والمبادئ التوجيهية توصيات بشأن رعاية الحيوانات المختبرية.

1. طموح الطفيليات من الأعضاء التناسلية الخارجية للذكور من الماوس

ملاحظة: تم إجراء شفط إبرة غرامة (FNA) في الفئران C57BL/6J الذكور من النوع البري، 6 إلى 10 أسابيع من العمر، المصابة T. بروسي من خلال حقن داخل الصفاق من 200 ميكرولتر من المالحة مع 2000 طفيليكما سبق وصفه16.

  1. بالنسبة لـ FNA من الأعضاء التناسلية الذكرية الخارجية، ضع الماوس في غطاء تدفق اللامينار، والتخدير للحيواني بحقن داخل الصفاق بـ 200 ميكرولتر من خليط من الكيتامين 75 ملغم/كغم + 1 ملغم/كغم من الميديتوميدين في المالحة.
    1. تأكيد التخدير مع طريقة قرصة اصبع القدم. عندما يكون رد الفعل من التراجع عن الساق غائبة، موقف الماوس في recumbency الرحالة (الشكل2A).
    2. نلب بعناية الخصية، وتقييم حجم والمسافة من الجلد فوق. تقييد الجهاز بين الفهرس والإصبع الأوسط أو بين السبابة والإبهام. تمتد الجلد فوق بإحكام عبر الكتلة لمزيد من تعطيل الهدف. تنظيف السطح مع مناديل الكحول (الشكل2A).
    3. عقد تجميعها 22 G إبرة و 5 مل حقنة وإدراج طرف إبرة في الهدف،دائما مع الغطاس في حالة بقية (الشكل 2B-C).
    4. تطبيق شفط عن طريق سحب الغطاس حقنة إلى علامة 4 مل إلى 5 مل 2-3 مرات. إعادة توجيه الإبرة داخل الجهاز إما في خط مستقيم أو على طول العديد من المماس المختلفة لزيادة احتمال عينة تمثيلية واستهداف هياكل أصغر مثل البربخ. تأكد من أن هذا الإجراء هو لطيف، للحد من تلف الأنسجة (الشكل2C-D).
    5. حرر الشفط ثم اسحب الإبرة. لا تقم بإعادة رسم الإبرة مع الغطاس تراجع لأن هذا سيؤدي إلى شفط من يستثير في برميل من الحقنة وعرقلة استعادتها (الشكل2E). بعد سحب الإبرة، والسيطرة على أي نزيف عن طريق تطبيق الضغط مع اسفنجة الشاش معقمة في موقع ثقب.
    6. افصل الحقنة عن الإبرة، وملئها بالهواء، واعيد توصيل الإبرة، وأخرج محتويات الإبرة برفق على شريحة. وضع غيض من إبرة قريبة جدا أو حتى على الشريحة لتجنب الرش (الشكل2F-I).
    7. إجراء طموح إضافي واحد على الأقل لكل عضو/حيواني لضمان تكرار أخذ العينات.
    8. إعادة التخدير مع حقن تحت الجلد من 200 ميكرولتر من 1 ملغ / كغ Atipamezole في المالحة وإعادة الحيوانات إلى قفص منزلهم للانتعاش ومراقبة حتى الشفاء الكامل.

2. إعداد مسحة من المواد المستنشقة

ملاحظة: استخدام القفازات في جميع أنحاء الإجراء وضمان التخلص الآمن من الإبر والمحاقن.

  1. طريقة سحب خطوتين
    1. التقاط الشريحة التي لديها قطرة من النشق باستخدام اليد غير المهيمنة، وقرصة نهاية متجمد بين الإبهام والسبابة (الشكل3A).
    2. التقاط شريحة نظيفة ثانية، والشريحة المنتشر، مع اليد المهيمنة وإحضارها عبر الشريحة الأولى مع انخفاض من يستنشق. وضع حافة نظيفة على نحو سلس من الشريحة على الشريحة عينة فقط على الجزء العلوي من قطرة في زاوية من حوالي 30 درجة (الشكل3B).
    3. انزلق الشريحة إلى الأمام مع حركة واحدة على ضوء، مستمرة وثابتة للحصول على فيلم رقيقة (الشكل3C).
    4. بقية الشريحة والسماح لتجفيف الهواء الكامل والسريع للمواد (الشكل3D). لا تقم بإصلاح الحرارة. تسمية حافة متجمد من الشريحة مع قلم رصاص.
      ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً عند هذه الخطوة ويمكن تخزين اللطخات إلى أجل غير مسمى حتى تصبح جاهزة للتلوين.

3. تلطيخ اللطخات

ملاحظة: استخدم القفازات طوال الإجراء وتأكد من تنفيذ الخطوتين 3.1.4 و3.2.9 داخل غطاء الدخان.

  1. بروتوكول تلطيخ غيمسا
    1. إصلاح مسحات الهواء المجففة عن طريق غمر الشرائح في جرة كوبلين تحتوي على الميثانول 100٪ لمدة 5 دقائق (الشكل3E).
    2. نقل الشريحة إلى جرة كوبلين تحتوي على 20٪ محلول Giemsa (المخفف إلى 1/5 في الماء المقطر) لمدة 30 دقيقة، أو 10٪ Giemsa لمدة 10 دقيقة (الشكل3F).
    3. شطف في مياه الصنبور وتجف جيدا باستخدام ورقة الأنسجة لداب.
    4. عقد الشريحة أفقيا وتطبيق قطرة واحدة من المتوسطة تصاعد غير مائي على مسحة. ضع حافة زجاج الغلاف على الشريحة، واخفضه واضغط برفق لإزالة أي فقاعات هواء.
  2. الكيمياء المناعية في مسحات FNA
    1. إصلاح مسحات الهواء المجففة في الميثانول 100٪ في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
    2. اغسل الشريحة لمدة 5 دقائق في جرة كوبلين مع 1X الفوسفات العازلة (PBS)، وتكرار هذه الخطوة 3 مرات باستخدام PBS 1X الطازجة في كل مرة.
    3. إزالة الشريحة من جرة كوبلين، ومسح العازلة الزائدة دون لمس مسحة ورسمدائرة حول مسحة مع قلم طارد للماء (جدول المواد).
    4. عقد الشريحة أفقيا وتطبيق 150 درجة مئوية من محلول الأجسام المضادة الأولية المخففة لكل مسحة وحضانة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: الأجسام المضادة الأولية المستخدمة هنا هو غير تنقية مصل الأرنب المضادة-T. بروسي VSG13 مستضد (عبر رد الفعل مع العديد من VSGs T. بروسي، التي تنتج في المنزل)، المخففة في 1X PBS في 1:50،000. إجراء ضوابط سلبية عن طريق استبدال الأجسام المضادةالأولية المناسبة مع مصل ما قبل المناعة (جدول المواد) للسماح لتقييم الربط غير محددة من الأجسام المضادة الثانوية.
    5. غسل الشريحة لمدة 5 دقائق في جرة كوبلين مع 1X PBS، وتكرار هذه الخطوة 3 مرات باستخدام PBS 1X الطازجة في كل مرة.
    6. عقد الشريحة أفقيا وتطبيق 150 €L من peroxidase الفجل المتاحة تجاريا / DAB نظام التصور على كل مسحة. حضانة لمدة 30 دقيقة فيدرجة حرارة الغرفة (جدول المواد).
    7. يغسل لمدة 3X لمدة 5 دقائق في 1X PBS.
    8. مضاد من خلال غمر الشرائح في جرة كوبلين التي تحتوي على هيماتوكسيلين هاريس. شطف في مياه الصنبور وتجف جيدا باستخدام الورق لداب.
    9. عقد الشريحة أفقيا وتطبيق قطرة واحدة من المتوسطة تصاعد غير مائي على مسحة. ضع حافة زجاج الغلاف على الشريحة، واخفضه واضغط برفق لإزالة أي فقاعات هواء.

Representative Results

تم إجراء FNA في الأعضاء التناسلية الذكور الخارجية من الفئران المصابة T. بروسي باستخدام إبرة 22 G إلى جانب حقنة 5 مل، والشرائح الزجاجية لإعداد مسحة (الشكل 1A-C). الطريقة بسيطة ولكن النتائج المثلى تعتمد على الخطوات الحاسمة: تجميد الكمال للماوس يتحقق منخلال التخدير العام، وتثبيت الأعضاء في جميع أنحاء الإجراء كله (الشكل 2A-B). تم تطبيق شفط 2-3 مرات وإعادة توجيه إبرة 1-2 مرات للسماح لأخذ عينات تمثيلية من الأعضاء والأنسجة الصغيرة: البربخ والدهون البربخية. تم إطلاق الضغط السلبي قبل الخرج من الإبرة. تم استخدام النستنس الوارد في التجويف ومحور الإبرة (حوالي 20 درجة مئوية) لإنتاج 2 مسحات (الشكل3A-C). وفي الحالات التي سحبت فيها الإبرة دون الإفراج عن الشفط، تم امتصاص المادة في الحقنة ولم تكن قابلة للاسترداد. وقد تكررت العملية بنجاح مرتين، واحدة لكل جهاز مقترن. بعد التجفيف، تم إجراء مسحات الرطب الثابتة والكيمياء المناعية للبروتينات السطحية trypanosome.

مسحة ذات نوعية جيدة (الشكل4A-C)تميزت طبقة أحادية من الخلايا ذات الكثافة الخلوية الجيدة، حيث تظهر الخلايا المضيفة السمات المورفولوجية المحفوظة، مما يسمح بتحديد أنسجة المنشأ والأقارب نسبة بين بعضها البعض. وكانت الطفيليات ملطخة بالمناعة بكفاءة، ويمكن التعرف عليها وحصرها (الشكل4B). كما تظهر حالة واحدة من FNA من الانصباب العضد في فأر مصاب، ملطخة Giemsa للمراقبة المباشرة والتشخيص ، (الشكل3D-F والشكل 4C).

قد تكون نتيجة FNA ضعيفة أو سلبية لأسباب مختلفة: (1) يتم التعبير عن القليل جدا من المواد FNA على الشريحة وناقص ممثل العينة; (2) يتم التعبير عن الكثير من المواد FNA على شريحة واحدة، مما يجعل مسحات سميكة بشكل مفرط وإضعاف التقييم الخلوي؛ (3) يتم تطبيق الكثير من القوة عند إجراء مسحة، وتعطلت الخلايا، مما أدى إلى الكثير من النوى العارية والشرائط الحمض النووي (سحق قطعة أثرية)؛ أو (4) لا يتم تطبيق ما يكفي من القوة عند جعل مسحة والخلايا لا تصنف، مما أدىإلى طبقة طبقية التي تعوق تقييم السمات المورفولوجية للخلايا (الشكل 5).

عندما نقارن علم أمراض الخلايا FNA مع علم أمراض الأنسجة، أي تحليل الخلايا مقابل الأنسجة، وقبضة لديه ميزة أن مورفولوجيا الخلويةيتم الحفاظ عليها بشكل أفضل والنسب النسبية وعد الخلايا يمكن تقييمها بشكل أفضل (الشكل 6). وعلاوة على ذلك، الكيمياء المناعية هي أبسط وأسرع وأسهل لتحسين من الكيمياء المناعية، والتي يتم تنفيذها عادة في الأنسجة الرسمية الثابتة والبارافين جزءا لا يتجزأ.

الهدف التطبيقات مزايا القيود
كتلة واضحة الفحص المجهري الروتيني، التشخيص بسيطة وسريعة لا بنية الأنسجة
الجهاز الكيمياء المناعية تكلفة منخفضة الشفط الأعمى (قد تفوت الإبرة الهدف بشكل عرضي؛ وقد يستهدف الطموح المناطق النخرية أو الكيسية أو النزفية)
الانصبابات قياس التدفق السيتومي أخذ العينات من مواقع متعددة
علم الوراثة الخلوية مورفولوجيا خلوية محفوظة بشكل جيد
الفحص المجهري الإلكتروني خالية من المضاعفات
PCR، تقنيات جزيئية أخرى دقة التشخيص العالية
التحليل الكيميائي الحيوي التخدير (للتجميد)
في المختبر الاختبارات، وثقافة الخلية إجراء غير طرفي

الجدول 1: الهدف والتطبيقات العامة والمزايا والحد من شفط الإبرة الدقيقة.

طقم FNA نموذج من إبرة وحقنة شفط
التطلع: إبرة أجزاء:
1. المحاقن البلاستيكية القابل للتصرف (5 أو 10 مل) (الشكل1B) (شطبة) - (بيفيل) يميل غيض من رمح إبرة لتشكيل نقطة، والميل يجري شطبة. فقط الإبر المنقطع هي مناسبة للتطلعات عن طريق الجلد.
3. الإبر من 22 إلى 25 مقياس (قطر)؛ 0.75، 1.0، 1.5 بوصة طويلة، مع معيار حافة طرف إبرة المنكرة (الشكل1A) (شافت) - (شافت) جزء أنبوبي جوفاء من الإبرة التي يمكن تعديل طولها وفقا لعمق الكتلة. مقياس الإبرة يتوافق مع قطر تتحملها، وهو قطر داخل رمح (الإبر الصغيرة لديها مقياس أعلى). استخدام إبر تحمل أكبر (أقل من 22 G) مفيد لزيادة الخلوية، على الرغم من أن هذا يمكن أن تنتج تلوث الدم iatrogenic المفرط.
1. التخدير (إذا لزم الأمر). الألم المرتبط بـ FNA يشبه الألم الذي يحدث ثقبًا وريديًا، ومع ذلك، يتطلب الطموح الجيد تجميدًا جيدًا للموضوع، وهو أمر مهم بشكل خاص في الحيوانات الصغيرة الحجم و/أو للآفات والأعضاء الصغيرة المفلطفة. يجب تقييد الفئران والفئران الخاضعة لـ FNA بشكل سلبي مناسب، أو، عند الضرورة، تخديرأو أن تكون تحت التخدير العام الخفيف. (هاب) - (هاب جزء من البلاستيك من الإبرة التي تعلق على المحاقن. يجب أن تكون شفافة للسماح لتصور المواد المستنشقة. وينبغي جمع المواد النستنكسي التي تم الحصول عليها خلال FNA في رمح إبرة وتوقف الطموح عندما ينظر إلى المواد دخول المحور.
صنع وتفسير تشويه FNA: أجزاء الحقنة:
1. متجمد نهاية الزجاج المجهر الشرائح (الشكل1C) برميل / اسطوانة. جزء جوفاء من الحقنة. ما لم يتم التعامل مع الآفات الكيسية أو الانصباب، لا يمكن استرداد المواد التي يتم استنشاقها إلى البرميل بشكل عام. الحجم المثالي للاستنشق لcytology FNA هو ما يقرب من 5 ميكرولتر، المقابلة لمتوسط حجم النستناشق الذي يحتل رمح ومحور الإبرة.
2. Romanowsky نوع البقع (على سبيل المثال Diff-Quik, Giemsa) نصيحة- .لا، لا، نهاية البرميل الذي يتم إرفاق محور إبرة.
3. المجهر (مشرق الميدان) الغطاس. جزء متحرك من الحقنة يحتوي على قرص مسطح أو شفة في نهاية واحدة وختم مطاطي في الطرف الآخر. يناسب في برميل ويوفر الضغط على رسم الخلايا، والسوائل في الإبرة. الغطاس مختومة تماما أن يخلق ضغط سلبي جيد إلزامي للحصول على عائد استنشق جيد.

الجدول 2: المعدات واللوازم اللازمة لطموح الإبرة الدقيقة.

Figure 1
الشكل 1 الأدوات والنتائج لطموح إبرة غرامة. (أ) القطر المثالي للإبرة لFNA هو من 22 إلى 25 G. (B) حجم الحقنة المثالي للحصول على عائد استنشق جيد هو من 5 إلى 10 مل. (C) نظيفة وجافة وخالية من الشريحة الزجاجية الشحوم مع منطقة وضع العلامات بلوري للكتابة مع قلم رصاص والمغلفة مسبقا (إذا لالكيمياء المناعية). (D) مثال على التربانوسم التي لوحظت مع تلطيخ غيمسا (رأس السهم الأسود)، ملطخة بالمناعة للبروتينات السطحية VSG (رأس السهم الأبيض) وتحت المجهر الإلكتروني انتقال (سهم كتلة). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2 المخططات التي تظهر شفط إبرة غرامة (FNA) من الأعضاء التناسلية الذكور الخارجية (الخصية، البربخ، والدهون البربخية) في الفئران. (أ) بمجرد تأمين الحيوان، يتم التقاط أداة الطموح التي تم تجميعها مسبقًا. (B-C) أدخل طرف الإبرة في الجهاز المستهدف. (D) تطبيق الشفط عن طريق سحب الغطاس حقنة إلى علامة 1 مل إلى 2 مل، مرارا وتكرارا 3-4 مرات. ويمكن أيضا نقل طرف إبرة ذهابا وإيابا داخل الهدف أثناء تطبيق شفط، لجمع ما يكفي من المواد. (E) الإفراج عن شفط ثم فقط سحب الإبرة. (F) إزالة الإبرة من الحقنة و (G) سحب الغطاس مرة أخرى. (H) إعادة إرفاق الإبرة. (I) طرد المواد على شريحة زجاجية عن طريق دفع الغطاس بسرعة من خلال الحقنة. من أجل تجنب الرش، تأكد من أن غيض من إبرة بقية قريبة جدا أو حتى على الشريحة. يتم وضع قطرة من النستنس ما يقرب من 1 سم من حافة منطقة وضع العلامات بلوري. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3 إعداد اللطاخة وتلطيخ. (أ) عقد نهاية واحدة من الشريحة (منطقة متجمد) بين الإبهام والسبابة. (B) وضع حافة نظيفة على نحو سلس من الشريحة الثانية (المنشر) على الشريحة عينة فقط أمام قطرة من المواد. (C) حرك انتشار إلى الأمام مرة واحدة مع سرعة معتدلة للحصول على فيلم رقيقة. (D) السماح للشريحة للهواء الجاف وتسمية حافة متجمد من الشريحة مع قلم رصاص. (E) بعد إصلاح التجفيف الكامل مع الميثانول لمدة 5 دقائق (F) وصمة عار مع 20٪ محلول غيمسا لمدة 30 دقيقة (أو 10٪ Giemsa لمدة 10 دقيقة). شطف طفيفة بالماء، وتجف تماما، وتراجع في الزيلين، وشنت مع عامل تصاعد غير قابل للذوبان في الماء. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4 الصور الدقيقة للمسحات التي تم الحصول عليها من FNA من الهياكل التناسلية الخارجية الذكور في الفئران المصابة (تي بروسي) (أ) المظهر الإجمالي لمسحة مباشرة ذات نوعية جيدة: تم التعبير عن المواد على الشريحة حوالي 1 سم بعيدا عن الحافة المتجمدة (نقطة سوداء)، لطخت وتوقفت 0.5 سم قبل حافة الشريحة (خطوط متوازية). (ب) تم إجراء الكيمياء المناعية للبروتينات السطحية للطفيلي (VSG) للمسحات التي تم الحصول عليها من FNA من الأعضاء التناسلية الذكرية الخارجية في اليوم 6 من العدوى. تم الكشف عن العديد من الطفيليات (رأس السهم) مختلطة مع الخلايا الجرثومية الماوس (السهم). [دب] يلوّن مع هاريس [هيماتوإكسلين]. التكبير الأصلي: 40x (شريط مقياس = 50 ميكرومتر). (C) غيمسا تلطيخ من مسحة التي تم الحصول عليها بعد FNA من الانصباب العبي في اليوم 21 من العدوى، وأظهرت العديد من الطفيليات (رأس السهم) admixed مع الخلايا المضيفة (الماوس)، في هذه الحالة الخلايا الالتهابية، الضامة (السهم) والخلايا الليمفاوية. التكبير الأصلي: 40x (شريط مقياس = 50 ميكرومتر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 5
الشكل 5 رديئة النوعية FNA مسحات. (أ) تشويه الخلايا سيئة، ناقص ممثل الكتلة أو الجهاز. (ب) مسحة سميكة جدا. (C) قطعة أثرية سحقت، مع الخلايا المعطلة، والنوى العارية والشرائط الحمض النووي. (د) المجاميع والطبقات الطبقية من الخلايا. [دب] يلوّن مع هاريس [هيماتوإكسلين]. التكبير الأصلي: 20x (شريط مقياس = 100 ميكرومتر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 6
الشكل 6 مقارنة علم الخلايا البربخية وعلم الأنسجة في الفئران المصابة (تي بروسي) (أ) الصور الدقيقة المقابلة لمسحة FNA و (B) قسم البارافين 4 ميكرومتر، في التكبير نفسه (20X التكبير الأصلي، شريط مقياس = 100 درجة مئوية)، وكلاهما ملطخة بالمناعة للبروتينات السطحية من الطفيلي (VSG). وأظهرت مسحة أعداد كبيرة من الطفيليات (رأس السهم) مع مورفولوجيا الخلوية المحفوظة جيدا، admixed مع أعداد معتدلة من الخلايا الجرثومية وعدد قليل من الحيوانات المنوية (السهم). أظهر القسم النسيجي بنية نسيجية محفوظة بشكل جيد، وتتألف من قنوات مُحَدِّفة مع الحيوانات المنوية داخل الإنارة (السهم)، ووجود أعداد كبيرة من الطفيليات التي توسع ستروما البربخ (رأس السهم). [دب] يلوّن مع هاريس [هيماتوإكسلين]. التكبير الأصلي: 20x (شريط مقياس = 100 ميكرومتر). الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Discussion

الشفط بالإبرة الجميلة (FNA) هو طريقة تستخدم على نطاق واسع لتشخيص المرض في الحيوانات البشرية والمنزلية. وقد تم توحيد هذه التقنية على مدى سنوات عديدة1،2، مما يجعل استخدام إبرة صغيرة تتحمل لاستنشاق الخلايا أو السوائل من كتلة واضحة أو الجهاز1،3. ثم يتم تشويه النقاق عادة على شريحة زجاجية وملطخة للمراقبة المجهرية لتحقيق التشخيص،ولكن يمكن أيضا استخدام هذه التقنية لاسترداد الخلايا لأغراض أخرى 4، 7 , 8 , 9.

الإجراء سريع (<5 دقيقة لكل فأر، بالنسبة للباحث من ذوي الخبرة) وخطر المضاعفات هو الحد الأدنى، على غرار المخاطر التي تحدث عند التعرض لثقب وريدي بسيط. لهذا السبب، لFNA من الجماهير واضح، مطلوب التخدير فقط للمواقع التشريحية الحساسة أو عندما تجميد جيد للحيواني وتثبيت الجهاز أو الكتلة التي سيتم استنشاقها أمر بالغ الأهمية للحصول على النتائج المثلى. هذا هو متكررة لالحيوانات مختبر صغير، وضبط النفس آمنة وفعالة من القوارض الصغيرة بيد واحدة مع ضمان أفضل الوصول إلى المنطقة للتطلعات من ناحية أخرى، من الصعب تحقيق دون تخدير. التخدير على المدى القصير هو في معظم الحالات كافية، ومع ذلك من الضروري، لFNA جيدة في الماوس. تجميد جيد يزيد من فرص الحصول على النقاس الذي يمثل المكونات الخلوية للآفة، ويقلل أيضا من فرص خارج طرف الإبرة في حين يتم تطبيق الضغط السلبي.

على الرغم من أن الإجراء نفسه بسيط جدا، وتطبيق منسق وإطلاق الفراغ هي الخطوات الأكثر أهمية. بعد إدخال الإبرة ، يتم سحب الغطاس من المحاقن لتحقيق فراغ تسيطر عليها (شفط) ، ويمكن إزالة الإبرة فقط من الكتلة بعد الإفراج عن الضغط السلبي عن طريق التخلي عن الغطاس (الشكل 2) ؛ وإلا يتم امتصاص النستنس في برميل من الحقنة ومن ثم من الصعب جدا لاسترداد. وثمة خطوة أخرى هامة جدا هي إعداد مسحات عالية الجودة. هناك طرق مختلفة لجعل تشويه ولكن بغض النظر عن الطريقة، يجب إعداد مسحات مباشرة بعد أن وضعت المواد على الزجاج. يجب أن تنتشر المواد البيولوجية بلطف لتجنب القطع الأثرية سحق الخلية. استخدام غطاء كما المنشر يمكن أن تساعد على منع هذه القطع الأثرية. ومع ذلك، فإن تطبيق الكثير من القوة في حين جعل تشويه كسر غطاء. مسحة ذات نوعية جيدة وعادة ما يكون معظم السكان الخلية موزعة على أنها أحادية الطبقة بحيث يمكن بسهولة نقل الضوء. يجب ألا تكون المواد الخلوية عالقة بشكل مفرط في جلطة الدم.

الهدف من FNA هو جمع الخلايا من كتلة أو أنسجة أو عضو. استخدام إبر تتحمل أكبر مفيد لزيادة الخلوية، ولكن يمكن أن تكون مرتبطة بالتلوث المفرط في الدم، في حين أن أخذ العينات مع الإبر الصغيرة تسفر عن جودة أعلى، على الرغم من مواد أقل وفرة. في حالتنا، تم تنفيذ الطموح عن طريق الجلد من الهياكل التناسلية الذكور الخارجية في الفئران المصابة تجريبيا مع T. بروسي، مع الإبر قياس 22 إلى جانب حقنة 5 مل. تم التخدير الفئران، واستقرت الخصية بيد واحدة وثقب والطموح الموجهة وتنفيذها من ناحية أخرى. لقد استرجعنا العديد من التربانوسوم اتاصالها مع الخلايا الجرثومية والحيوانات المنوية والخلايا الظهارية والخلايا السترومة، التيتم تشويهها وملطخة بالمناعة للبروتينات السطحية للطفيليات (VSG) (الشكل 4).

هناك دائما خطأ أخذ العينات المحتملة في يستنشق تسفر عن نتائج سلبية لأنه على الرغم من أن مناطق متعددة من آفة معينة يمكن أخذ عينات عدة مرات، وهذا هو طموح أعمى حيث أننا لا تصور طرف إبرة والجهاز المستهدف أو كتلة. هذا هو ذات الصلة للغاية في بيئة سريرية، حيث FNA السلبية من آفة مشبوهة لا يتفادى المزيد من التحقيقات، لكنها ليست ذات الصلة حتى في النماذج الحيوانية للمرض. وهكذا، تشمل القيود العامة النتائج السلبية الكاذبة بشكل رئيسي، ونتائج إيجابية كاذبة أقل تواترا (على سبيل المثال، من تلوث الدم)، ولكن أهم قيد في وضع التجارب الحيوانية هو عدم وجود معلومات عن الأنسجة الهندسة المعمارية17، كما هو الحال مع علم أمراض الأنسجة ، على سبيل المثال نمط توزيع الطفيليات ، من الخلايا المناعية ، وملامح التفاعل الخلية الخلية. ومع ذلك، فإن المزايا هي أن FNA هو إجراء غير المحطة الطرفية يسمح لأخذ العينات المتكررة في نفسالحيوان على مر الزمن ويسمح دائما لمورفولوجيا الخلوية الحفاظ عليها بشكل أفضل (الشكل 5). بدائل FNA لحصاد الخلايا المضيفة، والخلايا المناعية أو الكائنات الحية الدقيقة من الماوس تعتمد دائما على القتل الرحيم الماوس لجمع الكتلة أو الأجهزة ذات الأهمية.

على حد علمنا، هناك فقط عدد قليل من التقارير عن استخدام FNA في الحيوانات مختبر صغير، واحد من عام 1949 المقابلة لطموح نخاع العظام مع إبرة 22 G لدراسة الهيماتوبويز18،وجميع أخرى في تركيبة مع تدفق قياس السيتومترية إلى تحديد كمية إما الخلايا الالتهابية المرتبطة بالورم أو الخلايا البطانية7،19،20. ويبين عملنا أن هذه التقنية يمكن أن تمتد إلى تشخيص ودراسة نماذج الأمراض المعدية ويمكن الجمع بين علم الخلايا مع تقنيات مثل الكيمياء المناعية أو المجهر الإلكتروني. وتتمثل ميزتان رئيسيتان للطريقة في الحيوانات التجريبية فيما يلي: (1) أن هذا الإجراء ليس نهائيا، أي يمكن أن يتم في الفئران الحية؛ (2) هذا الإجراء ليس نهائيا. و(2) نظرا لشدته خفيفة فإنه يسمح للتطلعات التسلسلية في نفس الحيوان. وبالتالي هناك حاجة إلى عدد أقل من الفئران لكل دراسة، ويمكن بسهولة إجراء العلاقة بين تطور المرض السريري وتطور السمات الخلوية والجزيئية للمرض و/أو الكائنات الدقيقة، مما يتيح إجراء دراسات طولية.

ولعل التقرير الأول عن استخدام FNA لتشخيص الأمراض المعدية هو دراسة من قبل Grieg وغراي في عام 1904 أن تقارير تطلعات إبرة من الغدد الليمفاوية من المرضى الذين يعانون من مرض النوم، والتي كشفت مجانب trypanosomes12. إذا وجدت النتائج التي توصلنا إليها في الفئران المختبرية ترجمة إلى الماشية، أي أنه إذا كان يمكن بسهولة أخذ عينات من التريبانوسوما من قبل FNA من الهياكل التناسلية الخارجية للذكور، يمكن للمرء أن يتوقع أن هذه التقنية ستكون مفيدة للأطباء البيطريين لتشخيص الحيوان التريبنوموسوميافية في المزرعة، في الثروة الحيوانية.

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgments

تم تمويل هذا المشروع من قبل مؤسسة المأكولات الخاصة بالتكنولوجا/وزارة المأكولات المركزية، وشركة Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) من خلال Fundos do Orçamento de Estado (المرجع: ID/BIM/50005/2019). ومختبر اللوازم المالية هو محقق في مؤسسة العلوم والتكنولوجيا (IF/01050/2014) ويمول المختبر من قبل المركز (FatTryp, ref.771714). كما تم تمويل نشر هذا العمل من خلال صندوق الأمم المتحدة للمشاريع التي تمولها مؤسسة المأكولات الخاصة/وزارة الضمانات، وشركة Tecnologia e Ensino Superior (MCTES) من خلال صندوق خدمات المنظمات غير الحكومية. نشكر أندريا بينتو من مختبر علم الأنسجة وعلم الأمراض المقارنة في iMM للمساعدة في الفحص المجهري الإلكترون الخبراء، وساندرا ترينداد، تياغو ريبيلو وهنريك ماتشادو (iMM) لتقاسم الأنسجة من الفئران المصابة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL) Bio 2 7418046 Anesthesia reversal
Cover slips (24 x 60 No.1) VWR 631-0664 Smear making
DAB Dako K3468 Immunocytochemistry
Entellan (500 mL) VWR 1.07961.0500 Mounting media
Envision Flex antibody diluent Dako 8006 Immunocytochemistry
EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit) Dako K4010 Immunocytochemistry
Envision Flex Wash Buffer Dako K8007 Immunocytochemistry
Giemsa stain Atom Scientific Ltd RRSPSS-A Smear staining
Glass slides (Superfrost Plus) VWR 631-9483 Smear making
Harris Haematoxylin Bio-optica 05-06004E Immunocytochemistry
Hydrogen Peroxidase solution Sigma H1009-500ML Immunocytochemistry
Hypodermic needles Microlance 3 (23 G) Henry Schein 902-8001 Aspiration technique
Ketamin (IMALGENE 1,000-10 mL) Bio 2 7410928 Anesthesia
Medetomidine (DOMITOR 10 mL) Bio 2 7418335 Anesthesia
Methanol Merck 1.06009.2511 Smear fixative
Pap pen Merck Z377821-1EA Immunocytochemistry
Protein Block Serum free Dako X0909 Immunocytochemistry
Syringes (5 mL, 10 mL) Henry Schein 900-3311, 900-3304 Aspiration technique

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leopold, G., Koss, M. R. M. Koss’ Diagnostic cytology and it’s histologic bases. Lippincott Williams and Wilkins. (2006).
  2. Raskin, R. E., Meyer, D. J. Canine and Feline Cytology: a Color Atlas and Interpretation Guide. Canine and Feline Cytology. (2016).
  3. Hopper, K. D., Abendroth, C. S., Sturtz, K. W., Matthews, Y. L., Shirk, S. J. Fine-needle aspiration biopsy for cytopathologic analysis: Utility of syringe handles, automated guns, and the nonsuction method. Radiology. 185, (3), 819-824 (1992).
  4. Saliba, A. E., et al. Microfluidic sorting and multimodal typing of cancer cells in self-assembled magnetic arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 107, (33), 14524-14529 (2010).
  5. Guzera, M., Cian, F., Leo, C., Winnicka, A., Archer, J. The use of flow cytometry for immunophenotyping lymphoproliferative disorders in cats: a retrospective study of 19 cases. Veterinary and Comparative Oncology. 14, 40-51 (2016).
  6. Young, N. A., Al-Saleem, T. I., Ehya, H., Smith, M. R. Utilization of fine-needle aspiration cytology and flow cytometry in the diagnosis and subclassification of primary and recurrent lymphoma. Cancer. 40, (4), 307-319 (1998).
  7. Carroll, C. S. E., Altin, J. G., Neeman, T., Fahrer, A. M. Repeated fine-needle aspiration of solid tumours in mice allows the identification of multiple infiltrating immune cell types. Journal of Immunological Methods. 425, 102-107 (2015).
  8. Araujo, R. W., Paiva, V., Gartner, F., Amendoeira, I., Martinez Oliveira, J., Schmitt, F. C. Fine needle aspiration as a tool to establish primary human breast cancer cultures in vitro. Acta Cytologica. 43, (6), 985-990 (1999).
  9. Craft, I., et al. Percutaneous epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection in the management of infertility due to obstructive azoospermia. Fertility and Sterility. 63, (5), 1038-1042 (1995).
  10. Powers, C. N. Diagnosis of infectious diseases: A cytopathologist’s perspective. Clinical Microbiology Reviews. 120, (3), 351-367 (1998).
  11. Diamantis, A., Magiorkinis, E., Koutselini, H. Fine-needle aspiration (FNA) biopsy: Historical aspects. Folia Histochemica et Cytobiologica. 47, (2), 191-197 (2009).
  12. Greig, E. D. W., Gray, A. C. H. Note on the lymphatic glands in sleeping sickness. British Medical Journal. 1, (2265), 1252 (1904).
  13. Robson, J., Ashkar, T. S. Trypanosomiasis in domestic livestock in the Lambwe Valley area and a field evaluation of various diagnostic techniques. Bulletin of the World Health Organization. 47, (6), 727-734 (1972).
  14. Disease, T. African Animal Trypanosomiasis. In Vitro. 1-15 (2009).
  15. Kennedy, P. G. E. Clinical features, diagnosis, and treatment of human African trypanosomiasis (sleeping sickness). Lancet Neurology. 12, (2), 186-194 (2012).
  16. Trindade, S., et al. Trypanosoma brucei parasites occupy and functionally adapt to the adipose tissue in mice. Cell Host and Microbe. 19, (6), 837-848 (2016).
  17. Carvalho, T., Trindade, S., Pimenta, S., Santos, A. B., Rijo-Ferreira, F., Figueiredo, L. M. Trypanosoma bruceitriggers a marked immune response in male reproductive organs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12, (8), 1-15 (2018).
  18. Sundberg, R. D., Hodgson, R. E. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, (5), 557-561 (2013).
  19. Sottnik, J. L., Guth, A. M., Mitchell, L. A., Dow, S. W. Minimally invasive assessment of tumor angiogenesis by fine needle aspiration and flow cytometry. Angiogenesis. 13, (3), 251-258 (2010).
  20. Betka, J., Hovorka, O., Boucek, J., Ulbrich, K., Etrych, T., Rihova, B. Fine needle aspiration biopsy proves increased T-lymphocyte proliferation in tumor and decreased metastatic infiltration after treatment with doxorubicin bound to PHPMA copolymer carrier. Journal of Drug Targeting. 21, (7), 648-661 (2013).
الكشف عن طفيليات <em>التربانوسوما</em> خارج الأوعية الدموية عن طريق الشفط الإبرة الدقيقة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carvalho, T., Santos, A. M., Figueiredo, L. M. Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration. J. Vis. Exp. (150), e59798, doi:10.3791/59798 (2019).More

Carvalho, T., Santos, A. M., Figueiredo, L. M. Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration. J. Vis. Exp. (150), e59798, doi:10.3791/59798 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter