Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Detektion av extravaskulära Trypanosoma parasiter genom fin nål aspiration

doi: 10.3791/59798 Published: August 7, 2019

Summary

Fin nål aspiration är en teknik, varvid celler erhålls från en lesion eller orgel med en tunn nål. Aspireras material smetas, färgas och undersöks under ett mikroskop för diagnos eller används för molekylär biologi, cytometri eller in vitro-analys. Det är billigt, enkelt, snabbt och orsakar minimalt trauma.

Abstract

Fin nål aspiration (FNA) är ett rutinmässigt diagnostiskt förfarande som är avgörande för både medicinsk och veterinärpraxis. Den består av perkutan aspiration av celler och/eller mikroorganismer från påtaglig massa, organ eller effusioner (vätskeansamling i en kropp hålighet) med en tunn nål som liknar den vanliga nålen används för venösa punktering. Det material som samlas in av Fna är i allmänhet mycket cellulära, och den hämtade aspirera är sedan utsmetad, lufttorkad, våt-fast, färgade och observeras under ett mikroskop. I det kliniska sammanhanget är FNA ett viktigt diagnostiskt verktyg som fungerar som en guide till lämplig terapeutisk hantering. Eftersom det är enkelt, snabbt, minimalt invasiva och kräver begränsade investeringar i laboratorium och mänskliga resurser, är det i stor utsträckning används av veterinär utövare, främst i inhemska, men även i husdjur. I studier med djurmodeller, FNA har fördelen att det kan utföras upprepade gånger i samma djur, möjliggör longitudinella studier genom insamling av celler från tumörer och organ/vävnader under loppet av sjukdomen. Förutom rutinmässig mikroskopi kan även det hämtade materialet användas för immunocytokemi, elektronmikroskopi, biokemisk analys, flödescytometri, molekylärbiologi eller in vitro-analyser. Fna har använts för att identifiera den protozoska parasiten Trypanosoma rhodesiense i gonaderna av infekterade möss, vilket öppnar möjligheten för en framtida diagnos hos nötkreatur.

Introduction

Fin nål aspiration (FNA) används ofta vid diagnos av cancer och icke-neoplastiska sjukdomar, både hos människor och husdjur. Tekniken har standardiserats under årens lopp och beskrivs i ett flertal läroböcker1,2.

Det består till stor del av den perkutan aspiration av påtaglig massa, organ eller effusioner med en tunn nål monterad på en tom spruta, med hjälp av det negativa trycket att dra celler eller vätska från massan1,3. Nålar är typiskt 22 till 25 G (mätare som motsvarar nålen innerdiameter), och användningen av en större bar nål (stor diameter, e.g., 21 G) är till hjälp för att öka cellularitet, även om detta kan producera överdriven blod förorening. Nål längd beror på djupet av massan men 1 eller 11/2 tum används ofta för ytliga massorna. Sprutor är typiskt 5 till 10 mL, med större sprutor uppnå högre vakuum, vilket i sin tur ökar aspirera avkastning. Icke-palpable djupt sittande massorna kan också aspireras, med längre nålar och under bild vägledning (ultraljud). Den hämtade aspirera kan sedan smetas, lufttorkas, våt-fixas, färgas och observeras under ett mikroskop för att uppnå en diagnos3 (figur 1).

Detta är en enkel, billig, smärtfri och minimalt invasiv teknik som främst används i preoperativ inställning för att uppnå en diagnos på påtaglig massa och även för organ, som lymfkörtlar, sköldkörtel, prostata eller till och med de externa manliga reproduktions strukturer 1. Förutom att vara ett diagnostiskt verktyg, kan denna teknik användas för insamling av celler för andra ändamål samt, nämligen cytogenetik, elektronmikroskopi (figur 1d), flödescytometrisk karaktärisering4,5 ,6,7, etablering av cellkulturer8. Ett vanligt exempel i klinisk praxis är spermie hämtning för in vitro fertilisering9.

Aspiration kan upprepas flera gånger i samma massa för att få flera smetar. Vid en heterogen lesion, t ex ett fast område och ett cystiskt utrymme, är det viktigt att cellerna är aspirade från varje region. Det material som samlas in av FNA är i allmänhet mycket cellulära, vilket i de flesta fall möjliggör diagnos av sjukdomar utan behov av en vävnad biopsi. Speciella fläckar, immunofluorescens. immunocytokemi (figur 1d), och molekylära tekniker kan också utföras i utstryk som erhålls genom Fna, t. ex., för identifiering av infektiösa agens när den inte kan identifieras med enbart morfologi10. En kort översikt över de allmänna tillämpningarna och av den utrustning och de förnödenheter som behövs för FNA sammanfattas i tabellerna 1 respektive 2.

Den första rapporten om användningen av nålen punktering för diagnostiska ändamål beskrivs i tidiga skrifter av arabisk medicin, men det är i början 20th Century att moderna nål aspiration tekniker genomfördes11. Särskilt, kanske den första rapporten som antyder användning av Fna för diagnos av infektionssjukdomar var en studie i 1904, där Grieg och grått rapporterade nål ambitioner lymfkörtlar från patienter med sömnsjuka avslöjade rörliga innebörder12 . Författarna rapporterade närvaron av innebörder i både tidiga och avancerade fall, och vid en högre densitet än den som ses i blodets fläckar, där dessa är ofta sällsynta händelser12.

Aktuell diagnos av trypanosomiasis hos nötkreatur förlitar sig på direkt observation av parasiter i blodet, lymfa eller i diagnostiska tekniker13,14,15. Vi har tidigare visat att i experimentella Trypanosoma infektioner i musen, Trypanosoma rhodesiense (T. rhodesiense) har en anmärkningsvärd tropism att fettvävnad16 och även till några av de externa manliga reproduktiva strukturer, nämligen bitestiklarna17. Parasiter ackumuleras i stroma av dessa vävnader i stort antal16.

Det protokoll som beskrivs nedan beskriver ett detaljerat steg-för-steg-tekniskt förfarande för Fna i levande möss, som syftar till att aspirera på innebörder som finns i de externa manliga reproduktions strukturerna (testiklarna, epididymis och epididymalt fett), följt av konventionell cytologi och immunofärgning för specifika parasit proteiner (VSG)16,17. Aspiration utfördes 6 dagar efter den infektion och säkerhetsrutiner som gäller är de som vanligen fastställts för rutinmässig hantering av försöksdjur. Ytterligare åtgärder krävs för djur som har immunbrist (klädd i en ång-steriliserad klänning, mask, hår Bonnet, sterila handskar, och säkerställa aseptisk teknik hela tiden) för att minska oavsiktlig exponering för opportunistiska patogener.

Protocol

Alla djurförsök i detta protokoll utfördes enligt EU-förordningar och godkändes av den Djuretiska kommittén för Instituto de Medicina Molecular (iMM), (AEC_2011_006_LF_TBrucei_IMM). Den animaliska faciliteten för iMM följer den portugisiska lagen om användning av försöksdjur (lagdekret 113/2013) och följer EU-direktiv 2010/63/EU och FELASA (federationen för Europeiska laboratoriedjur vetenskaps föreningar) riktlinjer och rekommendationer om laboratorie djurens välbefinnande.

1. aspiration av parasiter från de yttre manliga fortplantningsorganen av musen

Anmärkning: Fin nål aspiration (Fna) utfördes i vildtyp manliga C57BL/6j möss, 6 till 10 veckor gamla, infekterade med T. rhodesiense genom intraperitoneal injektion av 200 μl av saltlösning med 2 000 parasiter som beskrivs tidigare16.

  1. För Fna av de yttre manliga reproduktionsorganen, Placera musen i ett laminärt flöde huva, söva djuret med en intraperitoneal injektion av 200 μl av en blandning av 75 mg/kg ketamin + 1 mg/kg Medetomidin i saltlösning.
    1. Bekräfta anesthetization med tå nypa metod. När reflexen av indragning av benet är frånvarande, Placera musen i dorsala vilo (figur 2A).
    2. Försiktigt palpera testis, bedöma storlek och avstånd från den överliggande huden. Begränsa orgeln mellan index och långfingret eller mellan pekfingret och tummen. Sträck den överliggande huden tätt över massan för att ytterligare immobilisera målet. Rengör ytan med spritkompresser (figur 2A).
    3. Håll den monterade 22 G nålen och 5 mL sprutan och sätt in nålspetsen i målet, alltid med kolven i viloläge (figur 2b-C).
    4. Applicera sug genom att dras tillbaka sprutkolven till 4 mL till 5 mL mark 2-3 gånger. Omdirigera nålen inom orgeln antingen i en rak linje eller längs flera olika tangenter för att öka sannolikheten för ett representativt urval och för att rikta mindre strukturer som epididymis. Se till att denna procedur är skonsam, för att minimera vävnadsskadan (figur 2C-D).
    5. Frigör sugningen och dra sedan ut injektionsnålen. Dra inte tillbaka injektionsnålen med den indragna kolven eftersom detta kommer att leda till sug av aspirera i sprutcylindern och hindra dess återhämtning (figur 2e). Efter tillbakadragande av nålen, kontrollera någon blödning genom att tillämpa tryck med en steriliserad gasbinda svamp på punkteringsstället.
    6. Koppla bort sprutan från nålen, fyll den med luft, återanslut nålen och försiktigt mata ut innehållet i nålen på en bild. Placera spetsen på nålen mycket nära eller ens på bilden för att undvika stänk (figur 2F-I).
    7. Utföra minst en ytterligare aspiration per organ/djur för att säkerställa replikerande provtagning.
    8. Återgå anestesi med en subkutan injektion av 200 μL av 1 mg/kg Atipamezole i saltlösning och returnera djur till deras hem bur för återhämtning och observera tills fullständig återhämtning.

2. smear beredning från det Aspirade materialet

Anmärkning: Använd handskar under hela proceduren och säkerställ säker kassering av nålar och sprutor.

  1. Två steg pull metod
    1. Plocka upp bilden som har droppe av aspirera med dominanta hand, och nypa den frostade änden mellan tummen och pekfingret (figur 3a).
    2. Plocka upp en andra ren bild, spridaren Slide, med den dominerande handen och föra den över den första bilden med droppe av aspirate. Placera den släta, rena kanten av bilden på preparatglaset precis på ovansidan av droppens ovansida i en vinkel på ca 30 ° (figur 3b).
    3. Glid glida framåt med en lätt, kontinuerlig och stadig rörelse för att få en tunn film (figur 3c).
    4. Vila bilden och låt den kompletta och snabba lufttorkning av materialet (figur 3D). Värm inte-Fix. Märk den frostade kanten av bilden med en penna.
      Anmärkning: Protokollet kan pausas i detta steg och smetar kan lagras på obestämd tid tills de är redo att färgas.

3. färgning av utstryk

Anmärkning: Använd handskar under hela proceduren och se till att steg 3.1.4 och 3.2.9 utförs inuti ett draghuv.

  1. Giemsa infärgnings protokoll
    1. Fix lufttorkad smetar genom att doppa bilderna i en Coplin burk som innehåller 100% metanol i 5 min (figur 3E).
    2. Överför bilden till en Coplin burk innehållande 20% Giemsa lösning (utspädd till 1/5 i destillerat vatten) för 30 min, eller 10% Giemsa för 10 min (figur 3F).
    3. Skölj av i kranvatten och torka noggrant med hjälp av mjukpapper till DAB.
    4. Håll bilden horisontellt och applicera en droppe av det icke-vattenhaltiga monterings mediet på utstryk. Placera kanten på ett Cover-glas på bilden, Sänk den och tryck försiktigt för att ta bort eventuella luftbubblor.
  2. Immunocytokemi i Fna utstryk
    1. Fix lufttorkad smetar i 100% metanol vid rumstemperatur i 10 min.
    2. Tvätta bilden i 5 min i en Coplin burk med 1x fosfatbuffert (PBS), upprepa detta steg 3 gånger med färska 1x PBS varje gång.
    3. Ta bort bilden från Coplin jar, torka överflödig buffert utan att röra smeta och rita en cirkel runt smeta med en vattenavvisande penna (tabell över material).
    4. Håll bilden horisontellt och applicera 150 μL utspädd primär antikropps lösning på varje smeta och inkubera i 1 h vid rumstemperatur.
      Anmärkning: Primär antikropp som används här är en icke-renad kanin serum anti-t. rhodesiense VSG13 antigen (Cross-reaktiva med många T. rhodesiense vsgs, producerade i egen produktion), utspädd i 1x PBS vid 1:50000. Utför negativa kontroller genom att ersätta lämplig primär antikropp med preimmunserum (tabell över material) för att möjliggöra en bedömning av den icke-specifika bindningen av den sekundära antikroppen.
    5. Tvätta bilden i 5 min i en Coplin burk med 1x PBS, upprepa detta steg 3 gånger med färska 1x PBS varje gång.
    6. Håll bilden horisontellt och Använd 150 μL kommersiellt tillgängliga visualiseringssystem med pepparrotperoxidas/DAB för varje utstryk. Inkubera i 30 minuter vid rumstemperatur (tabell över material).
    7. Tvätta för 3x i 5 min i 1x PBS.
    8. Motfärgning genom att doppa bilderna i en Coplin burk som innehåller Harris hematoxylin. Skölj av i kranvatten och torka noggrant med hjälp av papper till DAB.
    9. Håll bilden horisontellt och applicera en droppe av det icke-vattenhaltiga monterings mediet på utstryk. Placera kanten på ett Cover-glas på bilden, Sänk den och tryck försiktigt för att ta bort eventuella luftbubblor.

Representative Results

Fna utfördes i de externa manliga reproduktionsorganen hos möss infekterade med T. rhodesiense med hjälp av en 22 G nål kopplad till en 5 ml spruta, och glasfiber för utstrykspreparationen (figur 1a-C). Metoden är enkel men optimala resultat förlitar sig på kritiska steg: perfekt immobilisering av musen uppnås genom allmän anestesi, och stabilisering av organen under hela förfarandet (figur 2A-B). Sug applicerades 2-3 gånger och nål omdirigeras 1-2 gånger för att möjliggöra representativa provtagning av de mindre organ och vävnader: bitestiklarna och epididymalt fett. Negativt tryck släpptes innan nålen externaliserades. Aspirera som finns i lumen och nav av nålen (cirka 20 μl), användes för att producera 2 utstryk (figur 3a-C). I fall där nålen drogs tillbaka utan frisläppandet av sug, var materialet sugs in i sprutan och var inte återvinningsbart. Processen har upprepats två gånger, en för varje Parade orgel. Efter torkning, var utstryk våt-fast och immunocytokemi för trypanosome ytan proteiner utfördes.

En god kvalitet smeta (figur 4a-C) kännetecknades av en enskiktslager av celler med god cellulär densitet, där värdceller visar bevarade morfologiska egenskaper, vilket möjliggör identifiering av deras vävnad av ursprung och relativ proportion mellan varandra. Parasiter var effektivt immunfärgade, identifierbara och räknebara (figur 4b). Ett fall av en FNA av en peritonealdialys utgjutning i en infekterad mus, färgas med Giemsa för direkt observation och diagnos, visas också (figur 3D-F och figur 4c).

Ett dåligt eller negativt FNA-resultat kan bero på olika orsaker: (1) för lite FNA-material uttrycks på bilden och är underrepresentativ för provet. (2) för mycket FNA-material uttrycks på en enda bild, vilket gör alltför tjocka smetar och försämrar Cytologisk utvärdering; (3) för mycket kraft tillämpas när man gör utstryk, och celler störs, vilket resulterar i en hel del nakna kärnor och DNA-streck (krossa artefakt); eller (4) inte tillräckligt med kraft tillämpas när utstryk och celler inte disaggregeras, vilket resulterar i ett stratifierat skikt som hämmar utvärderingen av de morfologiska egenskaper hos cellerna (figur 5).

När vi jämför FNA cytopatologi med histopatologi, dvs analys av celler kontra vävnader, knytnäve har fördelen att cellulär morfologi är bättre bevarade och relativa proportioner och räkning av celler kan bedömas bättre (figur 6). Dessutom, vävnad är enklare, snabbare och lättare att optimera än immunohistokemi, som vanligtvis utförs i formalin-fast och paraffin-inbäddade vävnad.

Mål Program Fördelar Begränsningar
Påtaglig massa Rutinmässig mikroskopi, diagnos Enkel, snabb Ingen vävnads arkitektur
Organ Immunohistokemi Låg kostnad Blind aspiration (nål kan sakna mål tangentially; aspiration kan rikta nekrotiska, cystiska eller hemorragiska områden)
Vätskeansamlingar Flödescytometri Provtagning från flera platser
Cytogenetik Välbevarad cellulär morfologi
Elektronmikroskopi Fria från komplikationer
PCR, andra molekylära tekniker Hög diagnostisk noggrannhet
Biokemisk analys Anestesi (för immobilisering)
In vitro-analyser, cellodling Icke-terminalförfarande

Tabell 1: mål, allmänna tillämpningar, fördelar och begränsning av finnålens aspiration.

FNA kit Arketyp av en aspirationnål och spruta
Strävan: Nåldelar:
1. engångsplastsprutor (5 eller 10 mL) (figur 1b) Fasning . Spetsen på nålens skaft är lutande för att bilda en punkt, den sneda är avfasning. Endast avfasade nålar är lämpliga för perkutan ambitioner.
3. nålar av 22 till 25-gauge (diameter); 0,75, 1,0, 1,5 inches lång, med standard avfasade nål spetskant (figur 1a) Axeln. Ihåliga tubulär del av nålen vars längd kan justeras beroende på djupet av massan. Mätaren av nålen motsvarar diametern på dess borrning, som är diametern på insidan av axeln (mindre nålar har högre mätare). Användningen av större tråg nålar (mindre än 22 G) är till hjälp för att öka cellularitet, även om detta kan ge överdriven iatrogen blod förorening.
1. anestesi (om nödvändigt). Smärta i samband med FNA är liknande den av en venös punktering, dock, bra aspiration kräver bra immobilisering av ämnet, särskilt viktigt i små medelstora djur och/eller för små, fluktuerande lesioner och organ. Råttor och möss som omfattas av FNA bör vara lämpligt passivt återhållsamma, eller vid behov, Sedated eller vara underlätta narkos. Hub. Plast del av nålen som är fäst på sprutan; bör vara transparent för att möjliggöra visualisering av det aspirade materialet. Den aspirerande material som erhålls under FNA bör samlas i nålaxeln och ambitionen stoppas när materialet ses in i navet.
Fna smeta Making och tolkning: Sprutans delar:
1. frostat änd glas Mikroskop diabilder (figur 1c) Fat/cylinder. Den ihåliga delen av sprutan. Om inte hantera cystisk lesioner eller utgjutning, material som är aspireras på fat i allmänhet inte kan återvinnas. Den idealiska volymen av aspirera för FNA cytologi är cirka 5 μL, vilket motsvarar den genomsnittliga volymen av aspirera som upptar axeln och navet i nålen.
2. Romanowsky typ fläckar (t. ex. diff-quik, Giemsa) Tips. Änden på det fat som nålnavet är monterat på.
3. Mikroskop (ljus-fält) Kolven. Rörlig del av sprutan som har en platt skiva eller läpp i ena änden och en gummitätning i den andra änden. Passar in i fat och ger trycket att dra cellerna, vätska i nålen. En perfekt förseglad kolv som skapar ett bra negativt tryck är obligatoriskt för att få en bra aspirationspavkastning.

Tabell 2: utrustning och tillbehör som behövs för fin nål aspiration.

Figure 1
Figur 1 : Verktyg och resultat för fin nål aspiration. (A) den idealiska diametern på nålen för Fna är från 22 till 25 G. (B) idealisk spruta volym för att få en bra aspirera avkastningen är av 5 till 10 ml. (C) ren, torr, fri från fett glas glida med frostat märkning område för att skriva med blyerts och pre-belagda (om för immunohistokemi). D) exempel på Trypanosomer som observerats med Giemsa-färgning (svart pilspets), immunostained för VSG-ytproteiner (vit pilspets) och under transmissionselektronmikroskopi (blockpil). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2 : Schematics visar fin nål aspiration (Fna) av de yttre manliga reproduktionsorganen (testiklarna, epididymis, och epididymalt fett) hos mössA) När djuret väl har säkrats, plockas det tidigare monterade sug instrumentet upp. (B-C) Sätt in nålspetsen i målorganet. (D) Applicera sug genom att dras tillbaka sprutkolven till 1 ml till 2 ml-märket, upprepade gånger 3-4 gånger. Nålspetsen kan också flyttas fram och tillbaka inom målet medan du använder sug, att samla in tillräckligt med material. (E) frigör sugningen och dra sedan ut injektionsnålen. (F) ta bort nålen från sprutan och (G) dra tillbaka kolven. (H) sätt tillbaka injektionsnålen. (I) utvisa materialet på en glas rutschbana genom att trycka kolven snabbt genom sprutan. För att undvika stänk, se till att spetsen på nålen vilar mycket nära eller till och med på bilden. En droppe aspirera placeras ca 1 cm från kanten av det frostade märknings området. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3 : Smear beredning och färgning. (A) Håll ena änden av bilden (frostat område) mellan tummen och pekfingret. (B) placera den släta rena kanten på en andra bild (spridare) på preparatglaset precis framför material dropparen. (C) Skjut spridningen framåt en gång med måttlig hastighet för att få en tunn film. (D) Låt bilden lufttorka och märk den frostade kanten av bilden med en penna. (E) efter fullständig torkning Fix med metanol i 5 min. (F) fläcken med 20% Giemsa lösning för 30 min (eller 10% Giemsa för 10 min). Skölj försiktigt med vatten, torka helt, doppa i xylen och monteras med ett vatten olösligt monteringsmedel. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4 : Mikrofotografier av utstryk som erhållits från Fna av externa manliga reproduktions strukturer hos möss infekterade med T. brucei. A) bruttoförekomst av ett direkt utstryk av god kvalitet: materialet uttrycks på bilden ca 1 cm från den frostade kanten (svart prick), insmorda och stoppad 0,5 cm före kanten av bilden (parallella linjer). (B) immunocytokemi för ytan proteiner av parasiten (VSG) utfördes för utstryk erhållits från Fna av de yttre manliga reproduktionsorganen på dag 6 av infektion. Talrika parasiter (Arrowhead) upptäcktes blandas med mus könsceller (pil). DAB motmålat med Harris hematoxylin. Ursprunglig förstoring: 40x (Skalstapel = 50 μm). (C) Giemsa-färgning av smeta erhålls efter Fna av en peritonealdialys utgjutning på dag 21 av infektionen, visade många parasiter (Arrowhead) blandas med värd (mus) celler, i detta fall inflammatoriska celler, makrofager (pil) och lymfocyter. Ursprunglig förstoring: 40x (Skalstapel = 50 μm). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5 : Dålig kvalitet Fna smears. Adåligt cellulärt utstryk, under representativt för massan eller orgeln. (B) mycket tjockt utstryk. Ckrossad artefakt, med störda celler, Nakna kärnor och DNA-streck. D) ballast och stratifierade cellskikt. DAB motmålat med Harris hematoxylin. Ursprunglig förstoring: 20x (Skalstapel = 100 μm). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 6
Figur 6 : Jämförelse av epididymalt cytologi och histologi hos möss infekterade med T. brucei. Amikrofotografier som motsvarar ett Fna-prov ochBen paraffin sektion på 4 μm, med samma förstoring 20X ursprunglig förstoring, skal stång = 100 μm, båda immunfärgade för parasitens ytproteiner (VSG). Utstryk visade ett stort antal parasiter (Arrowhead) med välbevarad cellulär morfologi, blandat med måttligt antal könsceller och få spermatozoer (pil). Den histologiska avsnitt visade en välbevarad vävnad arkitektur, består av epididymala kanaler med intra-Luminal spermier (pil), och närvaron av ett stort antal parasiter utvidga epididymal stroma (Arrowhead). DAB motmålat med Harris hematoxylin. Ursprunglig förstoring: 20x (Skalstapel = 100 μm). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Discussion

Fin nål aspiration (FNA) är en metod som ofta används för att diagnostisera sjukdom hos människor och husdjur. Tekniken har standardiserats under många år1,2, somanvänder sig av en liten bar nål för att aspirera celler eller vätska från en påtaglig massa eller orgel1,3. Aspirationen är sedan typiskt utsmetad på en glas rutschbana och färgas för mikroskopisk observation för att uppnå en diagnos, men tekniken kan också användas för att hämta celler för andra ändamål4,5,6, 7 , 8 , 9.

Förfarandet är snabbt (< 5 min per mus, för en erfaren forskare) och risken för komplikationer är minimal, liknande den risk som uppstår när genomgår enkel venös punktering. Av denna anledning, för FNA av påtaglig massa, anestesi krävs endast för känsliga anatomiska platser eller när en bra immobilisering av djuret och stabilisering av orgeln eller massan som aspireras är oerhört viktigt för optimala resultat. Detta är vanligt för små försöksdjur, som säker och effektiv återhållsamhet av en liten gnagare med en hand samtidigt som den bästa tillgång till området för aspiration med den andra handen, är svårt att uppnå utan anestesi. Kortsiktig anestesi är i de flesta fall tillräckligt, icke desto mindre nödvändigt, för ett bra FNA i musen. En bra immobilisering maximerar chanserna att få en aspirera som är representativ för de cellulära komponenterna i lesionen och minimerar också chanserna att externalizing spetsen av nålen medan negativt tryck appliceras.

Även om förfarandet i sig är mycket enkel, samordnad tillämpning och utsläpp av vakuum är de mest kritiska stegen. Efter insättning av nålen, är sprutkolven indragna för att uppnå ett kontrollerat vakuum (sug), och nålen kan endast avlägsnas från massan efter att ha släppt det negativa trycket genom att släppa kolven (figur 2); annars aspirera sugs in i fat av sprutan och är då mycket svårt att återhämta sig. Ett annat mycket viktigt steg är utarbetandet av högkvalitativa utstryk. Det finns olika metoder för att göra ett utstryk men oavsett metod bör smeten förberedas omedelbart efter det att materialet har placerats på glaset. Det biologiska materialet bör spridas ut försiktigt för att undvika cell-krossa artefakter. Användning av en täckslip som spridaren kan hjälpa till att förhindra dessa artefakter. Men tillämpningen av för mycket kraft samtidigt som smeta kommer att bryta täckslip. En god kvalitet smeta typiskt har de flesta av cellpopulationen distribueras som enskiktslager så att de lätt kan överföra ljus. Cellulärt material bör inte vara överdrivet instängd i blodpropp.

Målet med ett FNA är att samla in celler från en massa, vävnad eller orgel. Användningen av större hål nålar är till hjälp för att öka cellularitet, men kan associeras med överdriven blod förorening, medan provtagning med mindre nålar ger högre kvalitet, men mindre riklig material. I vårt fall, perkutan aspiration av externa manliga reproduktions strukturer hos möss experimentellt infekterade med T. rhodesiense, utfördes med 22-gauge nålar kopplade till en 5 ml spruta. Möss var sövda, testiklarna stabiliserades med en hand och punktering och aspiration guidade och utförs med andra handen. Vi hämtade många innebörder blandas med könsceller, spermatozoer, epitelceller och stromaceller, som var insmorda och immunostained för parasiternas yta proteiner (VSG) (figur 4).

Det finns alltid den potentiella provtagning fel i nasofarynxaspirat ger negativa resultat eftersom även om flera områden av en given lesion kan samplas flera gånger, detta är en blind ambition där vi inte visualisera nålspetsen och mål organ eller massa. Detta är ytterst relevant i en klinisk miljö, där en negativ FNA av en misstänkt lesion inte undanröja ytterligare utredningar, men det är inte så relevant i djurmodeller av sjukdom. Allmänna begränsningar omfattar således huvudsakligen falskt negativa resultat, och mindre frekvent positiva resultat (t. ex. från blod förorening), men den viktigaste begränsningen vid djurförsök är bristen på information om vävnads arkitektur17, som vi har med histopatologi, t. ex. spridningsmönster av parasiter, av immunceller, och cell-cell interaktions funktioner. Icke desto mindre, fördelar är att FNA är en icke-terminal förfarande som möjliggör upprepad provtagning i samma djur över tid och alltid möjliggör bättre bevarade cellulära morfologi (figur 5). Alternativ till FNA för skörd av värdceller, immunceller eller mikroorganismer från en mus alltid förlita sig på euthanizing musen för att samla in massa eller organ av intresse.

Till vår kännedom finns det bara ett fåtal rapporter om användningen av FNA i små försöksdjur, en från 1949 som motsvarar aspiration av benmärg med 22 G nål för att studera hematopoies18, och alla andra i kombination med flödescytometri till kvantifiera antingen tumör-associerade inflammatoriska celler eller endotelceller7,19,20. Vårt arbete visar att denna teknik kan utvidgas till diagnos och studier av infektions sjukdomsmodeller och kan kombinera cytologi med tekniker som immunocytokemi eller elektronmikroskopi. Två av de stora fördelarna med metoden i försöksdjur är: (1) detta förfarande är inte Terminal, dvs kan utföras i levande möss; och (2) på grund av dess milda svårighetsgrad det möjliggör seriella ambitioner i samma djur. Därför krävs färre möss för varje studie, och sambandet mellan progression av klinisk sjukdom och utvecklingen av cellulära och molekylära egenskaper hos en sjukdom och/eller mikroorganism kan enkelt utföras, vilket möjliggör longitudinella studier.

Kanske den första rapporten om användningen av Fna för att diagnostisera en infektionssjukdomar är en studie av Grieg och Gray i 1904 som rapporterar nål ambitioner lymfkörtlar från patienter med sömnsjuka, som avslöjade rörliga innebörder12. Om våra fynd i laboratoriemöss hitta översättning till nötkreatur, dvs, att om Trypanosoma lätt kan samplas av Fna från den externa manliga reproduktions strukturer, man kan förvänta sig att denna teknik kommer att vara till nytta för veterinärer för att diagnostisera djur trypanosomiasis i-gård, i boskap.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta projekt finansierades av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino Superior (MCTES) genom fundos do Orçamento de Estado (Ref.: ID/BIM/50005/2019). LMF är en utredare av Fundação para a Ciência e Tecnologia (IF/01050/2014) och laboratoriet finansieras av ERC (FatTryp, Ref. 771714). Publiceringen av detta arbete finansierades också UID/BIM/50005/2019 projekt finansierat av Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT)/Ministério da Ciência, Tecnologia e ensino Superior (MCTES) genom fundos do Orçamento de Estado. Vi tackar Andreia Pinto från histologin och jämförande patologi laboratoriet för iMM för expert elektronmikroskopi bistånd, och Sandra Trindade, Tiago Rebelo och Henrique Machado (iMM) för att dela vävnader från infekterade möss.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Atipamezole (ANTISEDAN 10 mL) Bio 2 7418046 Anesthesia reversal
Cover slips (24 x 60 No.1) VWR 631-0664 Smear making
DAB Dako K3468 Immunocytochemistry
Entellan (500 mL) VWR 1.07961.0500 Mounting media
Envision Flex antibody diluent Dako 8006 Immunocytochemistry
EnVision Flex conjugated w/ HRP (anti-rabbit) Dako K4010 Immunocytochemistry
Envision Flex Wash Buffer Dako K8007 Immunocytochemistry
Giemsa stain Atom Scientific Ltd RRSPSS-A Smear staining
Glass slides (Superfrost Plus) VWR 631-9483 Smear making
Harris Haematoxylin Bio-optica 05-06004E Immunocytochemistry
Hydrogen Peroxidase solution Sigma H1009-500ML Immunocytochemistry
Hypodermic needles Microlance 3 (23 G) Henry Schein 902-8001 Aspiration technique
Ketamin (IMALGENE 1,000-10 mL) Bio 2 7410928 Anesthesia
Medetomidine (DOMITOR 10 mL) Bio 2 7418335 Anesthesia
Methanol Merck 1.06009.2511 Smear fixative
Pap pen Merck Z377821-1EA Immunocytochemistry
Protein Block Serum free Dako X0909 Immunocytochemistry
Syringes (5 mL, 10 mL) Henry Schein 900-3311, 900-3304 Aspiration technique

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Leopold, G., Koss, M. R. M. Koss’ Diagnostic cytology and it’s histologic bases. Lippincott Williams and Wilkins. (2006).
  2. Raskin, R. E., Meyer, D. J. Canine and Feline Cytology: a Color Atlas and Interpretation Guide. Canine and Feline Cytology. (2016).
  3. Hopper, K. D., Abendroth, C. S., Sturtz, K. W., Matthews, Y. L., Shirk, S. J. Fine-needle aspiration biopsy for cytopathologic analysis: Utility of syringe handles, automated guns, and the nonsuction method. Radiology. 185, (3), 819-824 (1992).
  4. Saliba, A. E., et al. Microfluidic sorting and multimodal typing of cancer cells in self-assembled magnetic arrays. Proceedings of the National Academy of Sciences, U.S.A. 107, (33), 14524-14529 (2010).
  5. Guzera, M., Cian, F., Leo, C., Winnicka, A., Archer, J. The use of flow cytometry for immunophenotyping lymphoproliferative disorders in cats: a retrospective study of 19 cases. Veterinary and Comparative Oncology. 14, 40-51 (2016).
  6. Young, N. A., Al-Saleem, T. I., Ehya, H., Smith, M. R. Utilization of fine-needle aspiration cytology and flow cytometry in the diagnosis and subclassification of primary and recurrent lymphoma. Cancer. 40, (4), 307-319 (1998).
  7. Carroll, C. S. E., Altin, J. G., Neeman, T., Fahrer, A. M. Repeated fine-needle aspiration of solid tumours in mice allows the identification of multiple infiltrating immune cell types. Journal of Immunological Methods. 425, 102-107 (2015).
  8. Araujo, R. W., Paiva, V., Gartner, F., Amendoeira, I., Martinez Oliveira, J., Schmitt, F. C. Fine needle aspiration as a tool to establish primary human breast cancer cultures in vitro. Acta Cytologica. 43, (6), 985-990 (1999).
  9. Craft, I., et al. Percutaneous epididymal sperm aspiration and intracytoplasmic sperm injection in the management of infertility due to obstructive azoospermia. Fertility and Sterility. 63, (5), 1038-1042 (1995).
  10. Powers, C. N. Diagnosis of infectious diseases: A cytopathologist’s perspective. Clinical Microbiology Reviews. 120, (3), 351-367 (1998).
  11. Diamantis, A., Magiorkinis, E., Koutselini, H. Fine-needle aspiration (FNA) biopsy: Historical aspects. Folia Histochemica et Cytobiologica. 47, (2), 191-197 (2009).
  12. Greig, E. D. W., Gray, A. C. H. Note on the lymphatic glands in sleeping sickness. British Medical Journal. 1, (2265), 1252 (1904).
  13. Robson, J., Ashkar, T. S. Trypanosomiasis in domestic livestock in the Lambwe Valley area and a field evaluation of various diagnostic techniques. Bulletin of the World Health Organization. 47, (6), 727-734 (1972).
  14. Disease, T. African Animal Trypanosomiasis. In Vitro. 1-15 (2009).
  15. Kennedy, P. G. E. Clinical features, diagnosis, and treatment of human African trypanosomiasis (sleeping sickness). Lancet Neurology. 12, (2), 186-194 (2012).
  16. Trindade, S., et al. Trypanosoma brucei parasites occupy and functionally adapt to the adipose tissue in mice. Cell Host and Microbe. 19, (6), 837-848 (2016).
  17. Carvalho, T., Trindade, S., Pimenta, S., Santos, A. B., Rijo-Ferreira, F., Figueiredo, L. M. Trypanosoma bruceitriggers a marked immune response in male reproductive organs. PLoS Neglected Tropical Diseases. 12, (8), 1-15 (2018).
  18. Sundberg, R. D., Hodgson, R. E. Aspiration of bone marrow in laboratory animals. Blood. 4, (5), 557-561 (2013).
  19. Sottnik, J. L., Guth, A. M., Mitchell, L. A., Dow, S. W. Minimally invasive assessment of tumor angiogenesis by fine needle aspiration and flow cytometry. Angiogenesis. 13, (3), 251-258 (2010).
  20. Betka, J., Hovorka, O., Boucek, J., Ulbrich, K., Etrych, T., Rihova, B. Fine needle aspiration biopsy proves increased T-lymphocyte proliferation in tumor and decreased metastatic infiltration after treatment with doxorubicin bound to PHPMA copolymer carrier. Journal of Drug Targeting. 21, (7), 648-661 (2013).
Detektion av extravaskulära <em>Trypanosoma</em> parasiter genom fin nål aspiration
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Carvalho, T., Santos, A. M., Figueiredo, L. M. Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration. J. Vis. Exp. (150), e59798, doi:10.3791/59798 (2019).More

Carvalho, T., Santos, A. M., Figueiredo, L. M. Detection of Extravascular Trypanosoma Parasites by Fine Needle Aspiration. J. Vis. Exp. (150), e59798, doi:10.3791/59798 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter