Denne artikel indeholder et sæt af protokoller for udvikling af menneskeskabte pluripotente stamcelle-afledte cardiomyocyte (hiPSC-CM) netværk dyrket på multiwell MEA plader til reversibelt elektroporat cellemembranen for handling potentielle målinger. Optagelser med høj gennemløb hentes fra de samme celle steder gentagne gange i løbet af dage.
Kardiel sikkerhed screening er af afgørende betydning for Drug Discovery og Therapeutics. Derfor er udviklingen af nye high-gennemløb elektrofysiologiske tilgange til hiPSC-afledte cardiomyocyte (hiPSC-CM) præparater er meget nødvendigt for effektiv Drug test. Selvom multielektrode matricer (MEAs) ofte anvendes til felt potentielle målinger af overgearet celler, beskrev og validerede en nylig publikation af Joshi-Mukherjee og kollegaer sin ansøgning om gentagne aktionspotentialer (AP) fra samme hiPSC-CM forberedelse over dage. Formålet er her at give detaljerede trin-for-trin metoder til såning CMs og til måling af AP bølgeformer via elektro portering med høj præcision og en tidsmæssig opløsning på 1 μs. Denne fremgangsmåde afhjælper manglen på brugervenlig metode til at opnå intracellulær adgang til målinger med høj gennemløb for pålidelige elektrofysiologiske undersøgelser. En detaljeret arbejdsstrøm og metoder til plating af hiPSC-CMs på multiwell MEA plader diskuteres kritiske trin, hvor det er relevant. Derudover rapporteres et specialbygget MATLAB-script til hurtig datahåndtering, udtræk og analyse for omfattende undersøgelse af bølgeform analysen for at kvantificere subtile forskelle i morfologi for forskellige AP-varigheds parametre, der er impliceret i arytmi og kardiotoksicitet.
Human induceret pluripotente stamcelle-afledte kardiomyocytter (hipsc-CMS) er guldstandarden for et stigende antal laboratorier1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. At slå embryooide kroppe11,12,13 og enkeltlags3,7,10,11,12, 13,14,15,16,17 differentiering er de foretrukne metoder til produktion af kardiomyocytter, og multi elektrode systemet (MEA) er blevet en fælles modalitet til overvågning af elektro dynamikken i disse netværk18,19,20. Mens parametre, der kan udvindes fra felt potentialer (fps) såsom slaghastighed, amplitude, varighed og RR intervaller er baseline elektrofysiologisk respons af spontant slå monolag18,21, 22,23, er aktions potentiellet (AP), der underliggende disse ekstracellulære FP-signaler, svære at ekstrapolere24. Vores nylige publikation om opdagelsen af en anvendelse af mål for direkte tilbagevendende AP-målinger giver dokumentation for metodologien for eksemplariske intracellulære AP-udlæsninger med en omfattende bølgeform analyse ved forskellige repolariserings faser på tværs af flere partier af hiPSC-afledte kardiomyocyt-netværk3. I undersøgelsen viste vi, at leveringen af elektro porerende impulser til netværk af hiPSC-afledte kardiomyocytter muliggør intracellulær adgang til AP-optagelser. Disse forbigående AP-optagelser er afhængige af transmembran potentielle inddrivelser observeret gennem skades stedet3,25,26. Bølgeformer indspillet via MEA og patch-clamp i vores undersøgelse viste lignende AP morfologier således validere pålideligheden af tilgangen3.
Et par laboratorier har rapporteret måling ApS fra forskellige elektro gene celler ved hjælp af specialbyggede MEAs18,21,26,27,28,29, 30, men pålideligheden af at anvende mål for konsistente og gentagne AP-målinger blev ikke vurderet. I øjeblikket er den gyldne standard patch-clamp teknik begrænset til Terminal optagelser7,31 mens MEA-baserede AP målinger er forbigående og derfor kan udføres flere gange på samme celle. Vi viser også, at man nemt kan registrere høj kvalitet AP-signaler i millivolt-området, der kræver minimal filtrering. Forskerne kan derfor gennemføre ikke blot akutte, men også kroniske lægemiddel undersøgelser i de samme præparater ved hjælp af mål. Derudover tillader denne teknologi samtidige FP/AP-målinger, der genererer elektro-Biome-biblioteker i løbet af kort tid. I betragtning af den stigende vægt på arytmier forudsigelse og lægemiddel associeret kardiotoksicitet24,32,33,34,35, integration af AP måling tilgange vil forbedre narkotika sikkerhed og effektivitet vurderinger.
Her præsenterer vi protokoller for 1) forklækning af kryopræserverede hipsc-CMS til modning, 2) dissociering og plating af hipsc-CMS på multiwell MEAs, 3) optagelse af fps og ApS fra hipsc-cm netværk, 4) segmentering og udvinding af data til analyse, og 5) gendannelse af arrays for flere genbrug. Hvert trin er optimeret og understreger kritiske trin, hvor det er relevant. Krav til celle fastgørelse for at sikre en slå syncytial enkeltlags diskuteres og procedurer for multiwell MEA restaurering for gentagne elektrofysiologiske undersøgelser forklares. Endelig er en brugerdefineret GUI udviklet i laboratoriet præsenteret for AP signal udvinding, kvalitetssikring, og segmentering workflow at kvantificere og analysere AP parametre.
Gennem årene har anvendelsen af mål været begrænset til at gennemføre FP målinger af overgearet celler til at studere deres elektrofysiologiske egenskaber36,37,38,39. Kun få grupper har rapporteret AP spor fra elektro gene celler ved hjælp af Custom MEA baseret teknologi18,29,30. Men disse tilgange er ikke blevet undersøgt for gentagne optagelser fra de samme præparater. Vi udviklede en innovativ og præcis metode til at studere APs fra samme celle sted over dage i flere hiPSC-CM-netværk samtidigt3. I vores publicerede studie blev en multiwell Micro-Gold MEA-platform anvendt til at generere AP-bølgeform biblioteker fra flere partier af hiPSC-CM-kulturer med høj præcision og med en tidsmæssig opløsning på 1 μs. Den protokol, der er beskrevet her, forklarer såning af hiPSC-CMs på arrayet for effektiv udvikling af syncytial CM netværk til højt gennemløb AP optagelser. Flere kritiske trin i protokollen er: 1) produktion af flere høj renhed partier af kvalitetskontrolleret CMS for kryopræservering Banking, 2) meget levedygtige post-Thaw CMS til forklædning og modning, 3) behandling af multiwell MEA pladen til cm såning, 4) hiPSC-CM kultur dissociation ved 30 dage efter differentiering for belægning, og 5) genoprettelse af de multilaterale mål for multipel genbrug.
Det er vigtigt at bemærke, at batch-til-batch variation i hiPSC differentiering kan påvirke eksperimentelle resultater. Den enkeltlags metode til differentiering blev optimeret in-House for høj procent kardiomyocyte produktion3,40. FACS-analysen af MLC2v og TNNT2 markører i vores kulturer viser en ≥ 90% ventrikulær-lignende fænotype3. Disse kvalitets kontrollerede kulturer er kryopræserverede til eksperimentelle undersøgelser. De nuværende differentierings tilgange giver en heterogen blanding af nodal-, atrieflimle-og ventrikel lignende celler3,16,17,41. Derfor kan strategier anvendt til CM subtype population berigelse yderligere forbedre specificiteten af kulturerne. Derudover kan vævsteknik tilgange anvendes til at forbedre deres modning. De metoder, der foreslås her, kan nemt implementeres for andre CM-kilder.
De AP-bølgeformer, der blev registreret ved hjælp af MEA, var de samme som dem, som blev registreret fra netværk af kardiomyocytter ved optisk kortlægning42,43, komplementært metaloxid halvleder baseret MEA18,21og simuleret AP Brug af FP-optagelser20. For at adressere mekanismen for AP-målinger via MEA Hai og Spira25 viste det sig, at elektropore elektrode grænsefladen efterligner den etablerede skarpe glasmikroelektrode teknik. Dog kan muligheden for hvile membranen og de sande amplitude værdier i vores undersøgelse ikke fastslås, da elektropore elektroden i MEA-systemer ikke er kalibreret, og amplituden er en funktion af følsomheden og opløsningen af Teknik. Vores tilgang deler lignende begrænsninger for optisk kortlægning, når det kommer til AP amplitude.
De multiwell MEA-baserede FP/AP-udlæsninger, som er blevet omtalt her, åbner nye muligheder for lægemiddel sikkerhedsvurdering. Selvom spontane, disse hipsc-cm monolag slå med konstante satser. Analyse af APD parametre på tværs af flere netværk giver indsigt i elektrisk heterogenitet (Figur 13). Omfattende APD-restitutions analyser skal dog indeholde forudgående diastoliske intervaller. Desuden er høj kvalitet AP bølgeformer indspillet fra samme celle site over 96 h (figur 11b) er den første rapport til at spore membran elektrodynamik over tid, som vil være af værdi i udvikling og i sygdom.
Den her beskrevne protokol til kvantificering af AP-parametre kan bruges til at generere dosis-responskurver til test forbindelser. Som for nylig rapporteret af Edwards et al.3, dosisrespons af noradrenalin, izoproterenol og E 4031 er plottet for APD i forskellige repolariserings faser. Den offentliggjorte undersøgelse viste nøjagtigheden og pålideligheden af tilgangen til identifikation af de dosisafhængige subtile ændringer i AP-bølge formerne i realtid. Denne teknik kunne nemt udvides til andre forbindelser eller små molekyle biblioteker for at forstå forskellige elektrofysiologiske reaktioner.
Den MEA-baserede tilgang til AP-målinger, der præsenteres i denne undersøgelse, vil være af interesse ikke blot for elektro fysiologer, men også for celle biologer og in-silico- modellere. Endvidere, FP/AP optagelser fra samme celle site på hipsc-CMS vil gøre det muligt for forskere at generere bioelektriske data biblioteker af bred vifte af overgearet cellulære netværk inden for en kort periode. Tilgængeligheden af disse ressourcer vil være værdifuld for narkotika opdagelser og sygdoms modellering.
The authors have nothing to disclose.
Ingen
Accutase | Sigma Aldrich | A6964-100ML | cell dissociation solution |
Acquisition software | Multichannel Systems | Multiwell-Screen v 1.9.2.0 | |
B27 Supplement | ThermoFisher | 17504-044 | CM media supplement |
Converter software | Multichannel Systems | MultiChannel DataManager | |
DMEM/F12 | ThermoFisher | 11330-032 | |
D-PBS | ThermoFisher | 14190-250 | |
FBS | Fisher Scientific | SH3007103HI | |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141-5MG | |
Geltrex | ThermoFisher | A1413202 | coating substrate |
Interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot Interface Board | |
Multiwell MEA Plate | Multichannel Systems | 24W300/30G-288 | |
RPMI 1640 | ThermoFisher | 11875-093 | CM base medium |
Terg-a-zyme | Sigma Aldrich | Z273287-1EA | enzymatic detergent |
Transfer pipettes, individually wrapped | Fisher Scientific | 1371148 | |
Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154-100ML | |
Ultrapure sterile water | ThermoFisher | 10977-023 | |
6-well tissue-culture treated plates | Fisher Scientific | 08-772-1B |