Denne artikkelen inneholder et sett med protokoller for utvikling av humant indusert pluripotent stilk cellen-avledet cardiomyocyte (hiPSC CM) nettverk kultivert på multiwell MEA plater til reverserbart electroporate cellemembranen for handling potensielle målinger. Opptak med høy gjennomstrømming hentes fra de samme celleområdene gjentatte ganger over dager.
Hjerte sikkerhet screening er av overordnet betydning for stoffet oppdagelse og legemiddel selskap. Derfor er utviklingen av romanen høy gjennomstrømming elektrofysiologisk tilnærminger for hiPSC-avledet cardiomyocyte (hiPSC-CM) preparater mye nødvendig for effektiv narkotika testing. Selv om multielectrode matriser (tiltak) ofte brukes til felt potensielle målinger av nervøs celler, har en nylig publikasjon av Joshi-Mukherjee og kollegaer beskrevet og validert sin søknad om tilbakevendende handlinger (AP)-innspillinger fra samme hiPSC-CM forberedelse over dager. Målet her er å gi detaljerte trinn-for-trinn metoder for seeding CMs og for å måle AP bølgeformer via electroporation med høy presisjon og en temporal oppløsning på 1 μs. Denne tilnærmingen tar for seg mangelen på brukervennlige metoder for å få intracellulære tilgang til AP-målinger med høy gjennomstrømning for pålitelige elektrofysiologisk undersøkelser. En detaljert arbeidsflyt og metoder for plating av hiPSC-CMs på multiwell MEA platene er diskutert understreker kritiske skritt der det er relevant. I tillegg er en spesialbygd MATLAB script for rask datahåndtering, utvinning og analyse rapporteres for omfattende undersøkelse av bølgeform analyse for å kvantifisere subtile forskjeller i morfologi for ulike AP varighet parametre innblandet i arytmi og Kardiotoksisitet.
Humant indusert pluripotent stilk cellen-avledet cardiomyocytes (hiPSC-CMs) er gullstandarden for et økende antall laboratorier1,2,3,4,5,6 ,7,8,9,10. Juling embryoid organer11,12,13 og monolag3,7,10,11,12, 13,14,15,16,17 differensiering er de foretrukne metodene for cardiomyocyte produksjon og multielectrode array (Mea) har blitt en felles modalitet for overvåking av elektrodynamikk av disse nettverkene18,19,20. Mens parametere som kan trekkes ut fra feltet potensialer (FPS) som juling rate, amplitude, varighet og RR intervaller er Baseline elektrofysiologisk svar av spontant juling monolagere18,21, 22,23: handlings potensialet (AP)-komponentene som er underliggende for disse ekstracellulære FP-signalene, er vanskelige å ekstrapolere24. Vår siste utgivelse på oppdagelsen av en anvendelse av tiltak for direkte tilbakevendende AP målinger gir bevis på metodikk for eksemplarisk intracellulære AP readouts med en omfattende bølgeform analyse på ulike repolarisasjon faser på tvers av flere grupper av hiPSC-avledet cardiomyocyte nettverk3. I studien viste vi at levering av electroporating pulser til nettverk av hiPSC-avledet cardiomyocytes muliggjør intracellulære tilgang for AP innspillinger. Disse transient Ap-opptakene er avhengig av transmembrane potensielle gjenoppretting observert gjennom skaden nettstedet3,25,26. Bølgeformer innspilt via MEA og patch-Clamp i vår studie viste lignende AP morfologier dermed validere påliteligheten av tilnærmingen3.
Noen laboratorier har rapportert måle APS fra ulike electrogenic celler ved hjelp av spesialbygde tiltak18,21,26,27,28,29, 30, men påliteligheten til å bruke tiltak for konsistente og tilbakevendende Ap-målinger ble ikke vurdert. For tiden er gull standard patch-Clamp teknikk begrenset til Terminal innspillinger7,31 mens, Mea-baserte Ap målinger er forbigående og derfor kan gjennomføres flere ganger på samme celle. Vi viser også at man enkelt kan ta opp høykvalitets AP-signaler i millivolt området som krever minimalt med filtrering. Forskerne kan derfor ikke bare utføre akutte, men også kroniske legemiddelstudier i de samme forberedelsene som bruker tiltak. i tillegg tillater denne teknologien samtidig FP/AP-måling som genererer elektro-biome biblioteker i løpet av kort tid. Gitt den økende vekt på arytmi prediksjon og narkotika forbundet Kardiotoksisitet24,32,33,34,35, integrering av AP måling tilnærminger vil forbedre narkotika sikkerhet og effekt vurderinger.
Her presenterer vi protokoller for 1) pre-plating av embryo hiPSC-CMs for modning, 2) dissociating og plating av hiPSC-CMs på multiwell tiltak, 3) innspilling av FPs og APs fra hiPSC-CM nettverk, 4) segmentere og utpakking av data for analyse, og 5) gjenopprette matriser for flere gjenbruk. Hvert trinn er optimalisert med vekt på kritiske trinn der det er relevant. Krav til celle vedlegg for å sikre en vibrerende syncytial monolag diskuteres og prosedyrer for multiwell MEA restaurering for repeterende elektrofysiologisk studier er forklart. Endelig er en tilpasset GUI utviklet i laboratoriet presentert for AP signal utvinning, kvalitetssikring, og segmentering arbeidsflyt å kvantifisere og analysere AP parametere.
Gjennom årene har tiltak vært begrenset til å utføre FP målinger av nervøs celler for å studere deres elektrofysiologisk egenskaper36,37,38,39. Bare noen få grupper har rapportert Ap spor fra electrogenic celler ved hjelp av tilpassede Mea teknologi18,29,30. Imidlertid har disse tilnærmingene ikke blitt undersøkt for gjentatte innspillinger fra de samme forberedelsene. Vi utviklet en innovativ og nøyaktig metode for å studere APs fra samme celleområde over dager i flere hiPSC-CM-nettverk samtidig3. I vår publiserte studie, en multiwell mikro-gull MEA-plattformen ble brukt til å generere AP bølgeform biblioteker fra flere grupper av hiPSC-CM kulturer med høy presisjon og med en temporal oppløsning på 1 μs. Protokollen beskrevet her forklarer seeding av hiPSC-CMs på array for effektiv utvikling av syncytial CM nettverk for høy gjennomstrømming AP innspillinger. Flere kritiske trinn i protokollen er: 1) produksjon av flere høy renhet partier av kvalitets-kontrollerte CMs for kryonisk bevaring bank, 2) svært levedyktig post-tine CMs for pre-plating og modning, 3) behandling av multiwell MEA plate for CM seeding, 4) hiPSC-CM kultur dissosiasjon på 30 dager etter differensiering for MEA plating, og 5) restaurering av tiltak for flere gjenbruk.
Det er viktig å merke seg at batch-til-batch variasjon i hiPSC differensiering kan påvirke eksperimentelle utfall. Den monolag metoden for differensiering ble optimalisert i huset for høy prosent cardiomyocyte produksjon3,40. FACS-analysen av MLC2v og TNNT2 markører i våre kulturer viser en ≥ 90% ventrikkel-lignende fenotype3. Disse kvalitets kontrollerte kulturene er embryo for eksperimentelle studier. Den nåværende differensiering tilnærminger gir en heterogen blanding av Nodal-, atrieflimmer-og ventrikkel-lignende celler3,16,17,41. Derfor strategier ansatt for CM under type befolkning berikelse kan ytterligere forbedre spesifisitet av kulturer. I tillegg kan vevs tekniske tilnærminger anvendes for å forbedre deres modning. Metodene som foreslås her kan enkelt implementeres for andre CM kilder.
Ap bølgeformer innspilt med Mea var lik de som er registrert fra nettverk av cardiomyocytes ved optisk kartlegging42,43, komplementære metalloksid Semiconductor-basert Mea18,21, og simulert Ap med FP-innspillinger20. For å møte mekanismen av AP målinger via MEA hai og Spira25 demonstrert at electropore-elektrode grensesnitt etterligne den etablerte skarp glass microelectrode teknikk. Imidlertid kan ikke hvile membran potensialet og de sanne amplitude verdiene i vår studie etableres, gitt at electropore-grensesnittet i MEA-systemer ikke kalibreres, og at amplituden er en funksjon av følsomheten og oppløsningen til Teknikk. Vår tilnærming aksjer lignende begrensninger til optisk kartlegging når det gjelder AP amplitude.
Den multiwell MEA-baserte FP/AP-readouts som rapporteres her, åpner nye muligheter for vurdering av narkotika sikkerhet. Selv om spontane, disse hiPSC-CM monolagere beat på konstant hastighet. Analyse av APD-parametere på tvers av flere nettverk gir innsikt i elektriske heterogenitet (figur 13). Imidlertid må omfattende APD restitusjon analyser innlemme foregående diastolisk intervaller. Videre høy kvalitet AP bølgeformer registrert fra samme celleområdet over 96 h (figur 11b) er den første rapporten til å spore membran elektrodynamikk over tid som vil være av verdi i utvikling og sykdom.
Protokollen som beskrives her for kvantifisere AP-parametre kan brukes til å generere dose reaksjons kurver for å teste forbindelser. Som nylig rapportert av Edwards et al.3, dose respons av noradrenalin, Isoproterenol og E 4031 er PLOTTET for APD på ulike repolarisasjon faser. Den publiserte studien viste nøyaktigheten og påliteligheten til tilnærmingen for identifisering av dose avhengige subtile endringer i AP bølgeformer i sanntid. Denne teknikken kan lett utvides for andre forbindelser eller små molekyl biblioteker for å forstå ulike elektrofysiologisk svar.
Den MEA-baserte tilnærmingen for AP-målinger presentert i denne studien vil være av interesse ikke bare å electrophysiologists, men også til celle biologer og in-silisiummangan modelers. Videre, FP/AP registreringene fra det likt cellen sted opp på hiPSC-CMs ville sette i stand forskning å utvikle bioelectric data biblioteker av bred oppstille av nervøs cellular nettverk innen en kort perioden. Tilgjengeligheten av disse ressursene vil være verdifullt for narkotika funn og sykdoms modellering.
The authors have nothing to disclose.
Ingen
Accutase | Sigma Aldrich | A6964-100ML | cell dissociation solution |
Acquisition software | Multichannel Systems | Multiwell-Screen v 1.9.2.0 | |
B27 Supplement | ThermoFisher | 17504-044 | CM media supplement |
Converter software | Multichannel Systems | MultiChannel DataManager | |
DMEM/F12 | ThermoFisher | 11330-032 | |
D-PBS | ThermoFisher | 14190-250 | |
FBS | Fisher Scientific | SH3007103HI | |
Fibronectin | Sigma Aldrich | F1141-5MG | |
Geltrex | ThermoFisher | A1413202 | coating substrate |
Interface board | Multichannel Systems | MCS-IFB 3.0 Multiboot Interface Board | |
Multiwell MEA Plate | Multichannel Systems | 24W300/30G-288 | |
RPMI 1640 | ThermoFisher | 11875-093 | CM base medium |
Terg-a-zyme | Sigma Aldrich | Z273287-1EA | enzymatic detergent |
Transfer pipettes, individually wrapped | Fisher Scientific | 1371148 | |
Trypan Blue | Sigma Aldrich | T8154-100ML | |
Ultrapure sterile water | ThermoFisher | 10977-023 | |
6-well tissue-culture treated plates | Fisher Scientific | 08-772-1B |