Parasponia andersonii는 대마초 가족 (칸 나바세아)에 속하는 빠르게 성장하는 열대 나무이며, rhizobium와 관련하여 질소 고정 뿌리 작은 혹을 형성 할 수 있습니다. 여기에서, 우리는 Agrobacterium tumefaciens-중재된 안정한 변환 및 CRISPR/Cas9 기지를 둔 게놈 편집에 근거를 둔 P. andersonii에 있는 역유전 분석을 위한 상세한 프로토콜을 기술합니다.
파라스 포니아 앤더슨은 대마초 가족 (칸 나바 세아)에 속하는 빠르게 성장하는 열대 나무입니다. 4종의 추가 종과 함께, 리조비움과 질소 고정 결절 공생을 확립할 수 있는 유일한 알려진 비콩구종 혈통을 형성한다. 콩과 식물과 P. 앤더슨 ii 사이의 비교 연구는 뿌리 줄이 형성의 기본 유전 네트워크에 귀중한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 비교 연구를 촉진하기 위해, 우리는 최근에 P. andersonii 게놈을 시퀀싱하고 아그로박테리움 투메파시엔스-중재 된 안정적인 변환 및 CRISPR / Cas9 기반 게놈 편집을 확립했습니다. 여기에서는 P. andersonii를위해 개발된 변형 및 게놈 편집 절차에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 또한, 우리는 종자 발아 및 공생 표현형의 특성화에 대한 절차를 설명합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 안정적인 형질전환 돌연변이 라인은 2-3 개월의 기간에서 생성될 수 있다. T0 형질전환 선의 식물성 체외 전파는 A. tumefaciens 공동 재배 후 4 개월에 표현형 실험을 시작할 수 있습니다. 따라서, 이 프로토콜은 몇 가지 명확한 이점을 제공하지만, P. andersonii에사용할 수있는 일시적인 Agrobacterium 뿌리 형성-기반 루트 변환 방법보다 약간 더 오래 걸립니다. 함께, 여기에 설명 된 절차는 P. andersonii이 열대 나무의 생물학의 잠재적으로 다른 측면뿐만 아니라 공생 협회를 이해하는 것을 목표로 연구를위한 연구 모델로 사용할 수 있습니다.
파라스포니아 앤더슨은 대마초 가족 (칸 나바세아)에 속하는 열대 나무이며 파푸아 뉴기니와여러 태평양 제도 1,2,3이원산지입니다. 4개의 추가 파라스포니아 종과 함께, 그것은 뿌리 줄기와 질소 고정 결절 공생을 확립할 수 있는 유일한 비 콩구도 혈통을 나타냅니다. 이 공생은 콩과 식물 (Fabaceae) 모델 메디카고 트렁카툴라와 로터스 japonicus에서잘 연구되어 결절 형성및 기능의 분자유전적 특성에 대한 상세한 지식을 습득한 결과 4. 또한, 콩류의 뿌리 같은혹 공생이 훨씬 더 오래되고 광범위하게 관절 성 진균 공생5에 기초한다는것이 입증되었습니다. 생리학 비교는 콩류, 파라스포니아의질소 고정 결절 공생뿐만 아니라, 디아조영양 프랭키아 박테리아를 호스트 소위 actinorhizal 식물 종, 공유 진화 기원을 가지고 있음을 시사 6,7,8. 콩과 엽 결절 형성에 관여하는 것으로 확인된 유전자가 보존된 유전적 기초의 일부인지 여부를 결정하기 위해 비콩콩종 종에 대한 연구가 필수적입니다. 이를 위해, 우리는 비교 연구 모델로 P. andersonii를 사용하는 것이 제안, 콩과 식물과 함께, 근본적인 루트 결절 형성 및 기능의 핵심 유전 네트워크를 식별하기 위해.
P. 앤더슨이 화산 언덕의 경사면에서 찾을 수있는 개척자입니다. 그것은 한 달에 45cm의 성장 속도를 충족하고 10미터 9까지의 길이에 도달 할 수 있습니다. P. 앤더슨 나무는 별도의 남성과 여성의 꽃 3,10의형성에 의해 촉진되는 바람 수분된다. 우리는 최근에 P. andersonii의디플로이드 게놈(2n= 20; 560 Mb/1C)을 시퀀싱하고, 2개의 추가파라스포니아 종의 초안 게놈 서열을 조립하였다; P. 리거다와 P. 루고사6. 이 밝혀 ~35,000 P. 앤더슨 유전자 모델 >20,000 직교 그룹에서 클러스터 될 수 있는 M. 트렁카툴라에서유전자와 함께, 콩 (글리신최대), 애기장대탈리아나, 삼림 딸기 ( 프라가리아 베스카), 트레마 오리엔탈리스, 블랙 코튼 포플러(포퓰러스트리코카르파)및 유칼립투스(유칼립투스그랜디스)6. 추가적으로, M. truncatula와 P. andersonii 사이 전사체 비교는 두 종 6에 있는 결절 강화한 표현 패턴을표시하는 290 putative orthologues의 세트를 확인했습니다. 이것은 비교 연구를위한 훌륭한 자원을 제공합니다.
P. andersonii 뿌리와 결절에서 유전자 기능을 연구하기 위해, 아그로박테리움 뿌리줄기유전자-매개 뿌리 형질전환에 대한 프로토콜이11개확립되었다. 이 프로토콜을 사용하여, 형질전환 뿌리를 방위하는 복합 식물은 비교적 짧은 시간 프레임에서 생성될 수 있다. 이 방법은, 또한, 또한, 12,13,14에널리 적용된다. 그러나 이 방법의 단점은 루트만 변환되고 각 형질전환 루트가 독립적인 변환 이벤트를 나타내므로 상당한 변동이 발생한다는 것입니다. 또한 변환은 일시적이며 형질전환 선은 유지 될 수 없습니다. 이것은 A. 뿌리 줄기-기반 루트 변환CRISPR /Cas9 매개 게놈 편집에 덜 적합합니다. 또한, A. 뿌리 줄기 유전자는 식물 게놈에 그것의 뿌리를 유도 하는 궤 적 (rol) 유전자를 전송, 한 번 호르몬 항상성을 방해 표현15. 이것은 A. 뿌리 줄기-변형 된 뿌리에서 식물 호르몬의 역할을 연구하는 것이 도전적입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해, 우리는 최근 P. andersonii10의 아그로박테리움 투메파시엔-기반변환 및 CRISPR/Cas9 매개 돌연변이 유발에 대한 프로토콜을 개발했다.
여기에서는 P. andersonii를위해 개발된 A. tumefaciens-기반변환 절차 및 역유전학 파이프라인에 대한 자세한 설명을 제공합니다. 또한, 우리는 공생 상호 작용을 연구하기 위한 분석학을 포함하여 형질전환 식물의 하류 처리를 위한 프로토콜을 제공합니다. 여기에 설명된 프로토콜을 사용하여, 2-3개월 동안 다중 형질전환 라인을 생성할 수 있다. CRISPR/Cas9 매개 돌연변이 발생과 함께, 이것은 녹아웃 돌연변이 라인의 효율적인 생성을 가능하게 합니다. 이러한 돌연변이 선은 체외(10,16,17)에서식물적으로 전파될 수 있으며, 이는 변형 시술 후 4개월에 자형질 특성화를 시작하기에 충분한 물질을 생성할 수 있게 한다. 10. 함께, 절차의이 세트는 어떤 실험실이 열대 나무의 생물학의 잠재적으로 다른 측면뿐만 아니라, 비소 질 및 균체 연관이해겨냥 연구를위한 연구 모델로 P. andersonii을 채택 할 수 있어야합니다.
콩과 식물과 먼 관련 칸나바세아 속 Parasponia질소 고정 뿌리 줄기와 내인 대 관계를 설정할 수 있는 식물 종의 유일한 두 clades를 나타냅니다 및 루트 작은 혹을 형성. 두 clades의 종 사이 비교 연구 는 이 공생을 허용하는 핵심 유전 네트워크에 통찰력을 제공하기 위하여 높게 관련있습니다. 현재, 유전 연구는 주로 콩과 식물에서 이루어집니다. 특히 두 가지 모델 종 M. 트렁카툴라와 L. japonicus. 추가 실험 플랫폼을 제공하고 비 콩과 함께 비교 연구를 용이하게하기 위해, 우리는 P. andersonii에서안정적인 변환 및 역유전 분석을위한 자세한 프로토콜을 여기에 설명합니다. 제시된 프로토콜은 T0 형질전환 P. 앤더슨이 라인의 시험관 내 전파를 사용하여 A. tumefaciens 공동 재배 후 4 개월 이내에 표현형 분석을 시작할 수 있습니다. 이는 콩류(33)의 안정적인 변형을 위해 확립된현재 프로토콜보다 실질적으로 빠르다. 이것은 P. 앤더슨이 매력적인 연구 모델을 만든다.
여기에 설명된 프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 포함되어 있습니다. 첫 번째는 종자 발아와 관련이 있습니다. 발아를 위한 P. andersonii 씨앗을 준비하려면 씨앗을 열매에서 분리해야합니다. 이것은 티슈 페이퍼 또는 차 체 의 내부에 열매를 문지르는 것으로 수행됩니다. 이 절차는 종자 코트의 손상을 방지하기 위해 부드럽게 수행되어야합니다. 종자 털이 손상되면 표백제가 멸균 중에 씨앗에 들어갈 수 있어 종자 생존가능성이 줄어듭니다. 종자 휴면을 깰, 씨앗은 10 일 온도 주기를 실시한다. 그러나,이 치료에도 불구하고 발아는 완전히 동기화되지 않습니다. 일반적으로, 첫 번째 씨앗 후 복사 출현을 보여 7 일, 하지만 다른 발아 하는 데 몇 일 이상 걸릴 수 있습니다.
변환 절차의 임계점은 시작 물질의 선택과 공동 재배 단계의 지속 기간에 관한 것입니다. 효율적인 변환에 도달하기 위해, 그것은 시작 재료로 비 살균 온실 재배 식물의 건강하고 젊은 줄기 또는 petioles를 사용하는 것이 가장 좋습니다. 젊은 가지의 성장을 유도하기 위해, 파라스포니아 나무를 2-3 개월마다 손질하고 일년에 한 번 나무를 새로 고치는 것이 좋습니다. 또한 공동 재배 단계는 2 일 동안만 수행해야합니다. 장기간 공동 재배는 A. tumefaciens에 의해 조직 이식의 과잉 식민지를 촉진하고 일반적으로 변환 효율을 감소시킨다. A. tumefaciens에 의해 과잉 식민지를 방지 하기 위해 그것은 또한 정기적으로 이식 재배 하는 판을 새로 고침 하는 것이 중요 하다. 과잉 식민지가 발생하는 경우, 조직 이식은 씻어 수 (섹션 3.8 참조) A. tumefaciens 세포를 제거하기 위해. 세척에 사용되는 SH-10 용액에 표백제를 첨가하는 것이 좋습니다 (최종 농도 : ~ 2 % 하이포 염화산). 이 추가 세척 단계는 심하게 감염된 이식(그림 2B)에서작동하지 않을 수 있다는 점에 유의해야 합니다. CRISPR/Cas9 구성을 가진 변환이 제한된 수의 putatively 형질전환 된 싹을 산출하거나 특정 유전자의 돌연변이 발생이 재생에 문제를 일으킬 것으로 예상되는 경우, 빈 벡터 제어 구조를 포함하는 것이 좋습니다. 긍정적 인 제어. 마지막으로, 선택된 모든 형질전환 라인이 독립적인 T-DNA 통합 이벤트에서 발생하도록 하는 것이 중요합니다. 따라서, 우리는 이식의 각 측면에서 단 하나의 putatively-transgenic 촬영을 지시합니다. 그러나 이렇게 하면 잠재적인 회선이 줄어듭니다. 많은 라인이 요구되는 경우에, 연구원은 이 캘리 가 니 (≥2 mm)의 크기와 배양이 칼리를 독립적으로 배양 할 때 원래 의 외식에서 putatively 변형 된 칼리를 분리하기로 결정할 수 있습니다. 이러한 방식으로, 여러 라인은 잠재적 인 형질 전환 라인의 수를 제기 각 배양에서 분리 될 수있다.
현재 프로토콜에서, P. andersonii의 형질 전환 라인은 시험관 내 전파를 통해 식물적으로 전파된다. 이것의 장점은 많은 형질전환 식물이 비교적 짧은 기간에 생성될 수 있다는 것이다. 그러나 이 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 시험관 내 전파를 통한 T0 형질전환라인의 유지는 노동집약적이며 원치 않는 유전적 또는 후생유전학적 변화를 초래할 수 있다34,35. 둘째, T0 라인은 여전히 항생제 내성 카세트를 포함하는 T-DNA의 사본을 함유한다. 이렇게 하면 각 재변환에 대해 서로 다른 선택 마커가 필요하므로 가능한 재변환 횟수가 제한됩니다. 현재, 우리는 카나마이신 또는 히그로 마이신 선택을 사용하여 변형을 테스트했습니다 (데이터는 표시되지 않음). 더욱이, T0 형질전환 선에 있는 Cas9 인코딩 서열 및 sgRNAs의 존재는 보완 연구 결과를 복잡하게 합니다. 상보성 공산학은 가능하지만 sgRNA 표적 부위(들)가 보체화 구조의 유전자 편집이 방지되도록 돌연변이되어야 한다. 셋째, T0 라인으로 작업의 단점은 CRISPR / Cas9 돌연변이가 키메라 될 수 있다는 것입니다. 키메라 돌연변이 선의 표현형 분석을 방지하기 위해, 우리는 적어도 3 개의 다른 싹에 시험관 내 전파 후 지질 형질 분석반복하는 것이 좋습니다. 여기에 기재된 프로토콜을 사용하여 수득된 키메라 돌연변이체의 수는 제한적이지만, 이들은 때때로10을관찰한다. T0 라인작업의 한계를 극복하기 위해 P. andersonii 돌연변이 선은 생성적으로 전파될 수 있습니다. P. 앤더슨 나무는 디오이와 바람 수분2. 이것은 각 형질전환 선이 남성과 여성의 꽃이 한 개인에 생성되도록 조작될 필요가 있고, 이후에 교차 수분이 일어나지 않는 것과 같이 성장한다는 것을 의미합니다. P. andersonii는 빠르게 성장하는 나무이므로 열대 온실에서 상당한 양의 공간이 필요합니다 (28 °C, ~ 85 % 상대 습도). 따라서 기술적으로 가능하지만 P. andersonii 형질전환 라인의 생성 전파는 물류적으로 어렵습니다.
프로토콜 섹션에서, 우리는 P. 앤더슨의절제에 대한 3 가지 방법을 설명 . 플레이트와 파우치 시스템의 장점은 뿌리가 쉽게 접근 할 수 있다는 것입니다, 이는 박테리아의 반점 접종을 허용하고 시간이 지남에 따라 다음 적두 형성을 할 수있다. 그러나, 플레이트 시스템은 매우 노동 집약적, 대규모 끄덕임 실험에 덜 적합하게. 파우치 시스템의 단점은 곰팡이 오염을 방지하기가 어렵다는 것입니다. 파우치는 멸균되지 않으므로 주머니의 위쪽 절반에서 곰팡이 성장이 종종 관찰됩니다. 그러나, 이것은 P. andersonii 성장에 영향을 미치지 않으며, 그러므로 끄덕인 asays를 방해하지 않습니다. 또한 파우치 시스템은 모종에만 적합합니다. 여러 시도에도 불구 하 고, 우리는 파우치에 체 외 전파를 통해 얻은 식물을 성장 수 없습니다.
여기에 기술된 P. andersonii 역유전학 파이프라인은 기존 A. 근성 계근형변환 방법(11)에 비해 상당한 개선을 제공한다. 기재된 절차를 사용하여, 안정적인 형질전환 라인을 효율적으로 생성할 수 있고 시험관 내 전파를 통해 유지될 수 있다. 대조적으로, A. 뿌리 줄기 변환은 일시적이며 형질전환 뿌리의 형성만을 초래합니다. 각 형질전환 뿌리는 독립적인 형질전환에서 유래하기 때문에, A. 근위계 형질전환계 분석제는 실질적인 현상기 변화때문에 손해를 입는다. 이 변화는 시험관 내 전파도 변화의 어떤 수준을 생성하지만, 안정적인 라인의 경우 훨씬 적습니다. 이 감소된 변이 및 다중 식물이 각 안정한 선에 대해 표현될 수 있다는 사실 때문에, 안정된 선은 A. rhizogenes-형질전환된 뿌리에 비해 정량적 분석에 더 적합합니다. 부가적으로, 안정한 형질전환은 내인성 호르몬 균형에 영향을 미치는 궤적(rol)을 유도하는 A. 뿌리줄기(rol)의 도입에 의존하지 않는다15. 따라서, 안정한 선은 A. 뿌리줄기-형질전환된 뿌리에 비해 호르몬 항상성에 관여하는 유전자의 역유전적 분석에 더 적합하다. 연구 모델로서 P. andersonii의 더 일반적인 이점은 최근 전체 게놈 중복 (WGD)을 경험하지 않았다는 것입니다. 모델 콩류 를 포함하는 콩과 식물 파필리오노마데아제 서브 패밀리 M. 트렁카툴라 와 L. japonicus,뿐만 아니라 모델 트리포러스 트리코카르파 경험 WGDs ~ 65를 포함하는 살리카과 (주문 말피기알레스) 백만 년 전36,37. 이러한 WGDs에서 유래 하는 많은 paralogous 유전자 복사본 M. truncatula의게놈에 유지 됩니다., L. japonicus 와 P. trichocarpa37,38,39,생성 역유전분석을 복잡하게 할 수 있는 중복성. P. 앤더슨은 최근 WGD를 경험하지 않았기 때문에, P. andersonii에 역 유전 분석은 paralogous 유전자 사본의 중복 기능에 의해 덜 영향을 받을 수 있습니다.
종합하면, 우리는 P. andersonii에서역유전 분석을위한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 이 프로토콜을 사용하여, 단일 돌연변이 라인은 2-3 개월10의기간 내에 효율적으로 생성 될 수있다. 이 프로토콜은 다른 식물 종40,41,42에도시된 바와 같이 동시에 다른 유전자를 표적화하는 sgRNAs의 다중화를 통해 더 높은 차수돌연변이를 생성하도록 확장될 수 있다. 추가적으로, 여기에서 기술된 안정한 변환 절차는 CRISPR/Cas9 유전자 표적화에 한정되지 않습니다 그러나 또한 구조물의 그밖 모형을 소개하기 위하여 이용될 수 있었습니다 (예를 들면, 프로모터 리포터 assays, 자궁 외 발현 또는 trans를 위해- 보완)을 참조하십시오. 우리는 질소 고정 뿌리 줄기 또는 내분근 성 균류와 상호 공생을 연구하는 비교 연구 모델로 P. andersonii를 설립했다. 그러나, 여기에 설명 된 프로토콜은 또한 이 열대 나무의 생물학의 다른 측면을 연구하는 도구를 제공합니다, 이러한 나무 형성등, 이중 성적 꽃의 개발 또는 칸 나베아 과 특정 보조 대사 산물의 생합성.
The authors have nothing to disclose.
저자는 애드진 데이터베이스를 통해 골든 게이트 복제 부품을 사용할 수 있도록 마크 유레스, 소피엔 카문과 실베스트레 마릴론넷을 인정하고 싶어. 또한, 우리는 이 제임스, P. 하도바, 그리고 P. J. 히겐스 P. 앤더슨이 씨앗에 감사드립니다. 이 작품은 과학 연구를위한 네덜란드 기구에 의해 지원되었다 (NWO-VICI 교부금 865.13.001; NWO-오픈 공모전 은 819.01.007) 및 인도네시아 공화국의 연구, 기술 및 고등 교육부 (RISET-PRO 보조금 8245-ID).
Sigma-Aldrich | N0640 | NAA |
Duchefa Biochemie | M1503.0250 | MES |
Sigma-Aldrich | D134406 | Acetosyringone |
Duchefa Biochemie | X1402.1000 | X-Gal |
Merck | 101236 | For nucleic acid electrophoresis gel |
– | – | Pouches box material, hangers |
Merck | 101188 | NH4NO3 |
Sigma-Aldrich | B3408-1G | BAP |
Merck | 100156 | H3BO3 |
Thermo-Fisher | ER1011 | Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly |
Thermo-Fisher | 15561020 | Used in Golden Gate cloning assembly |
Merck | 137101 | CaCl2·2H2O |
Duchefa Biochemie | C0111.0025 | C16H16N5O7S2Na |
Thermo-Fisher | K1231 | Used for cloning the blunt-ended PCR amplicons in genotyping procedure |
Agronutrition | AP2011 | Containing Rhizophagus irregularis DAOM 197198 (1,000 spores/mL), used for mychorrization assay |
Merck | 102790 | CuSO4·5H2O |
Duchefa Biochemie | D1004.1000 | Used for plant tissue culture agar-based medium |
Merck | 105101 | K2HPO4 |
VWR Chemicals | 20302.293 | Na2·EDTA |
Duchefa Biochemie | M0803.1000 | C6H14O6 |
Thermo-Fisher | ER0291 | Used as restriction enzyme in Golden Gate cloning assembly |
Merck | 100983 | C2H5OH |
VWR Chemicals | BDH9232-500G | EDTA |
Sigma-Aldrich | Z377600-1PAK | Cellophane membrane |
Biomatters, Ltd. | R9 or higher | Bioinformatics software for in silico cloning and designing of sgRNAs |
Mega International | – | Technical information at https://mega-international.com/tech-info/ |
Sigma-Aldrich | 65882 | Used for fixating nodule tissues |
VWR Chemicals | 24385.295 | – |
Vink | 219341 | Pouches box material, bottom part |
Leica Biosystems | 14702218311 | Used as a template for plastic embedding |
Merck | 100317 | HCl |
Sigma-Aldrich | I5386-1G | IBA |
Merck | 103862 | C6H5FeO7 |
Merck | 103965 | FeSO4O·7H2O |
Duchefa Biochemie | I1401.0005 | IPTG |
Duchefa Biochemie | K0126.0010 | |
Sigma-Aldrich | L2000 | |
Merck | 105886 | MgSO4O·7H2O |
Merck | 105934 | MnCl2·4H2O |
Merck | 102786 | MnSO4O |
Duchefa Biochemie | M1002.1000 | Used for bacterial culture agar-based medium |
Manutan | 92007687 | Pouches material |
Paraxisdienst | 130774 | Elastic sealing foil |
Pull Rhenen | Agra-Perlite No.3 | Used as growing substrate in pots for nodulation assay |
VWR Chemicals | 391-0581 | Used as container for cellophane membranes |
Thermo-Fisher | F130WH | For genotyping transgenic lines |
Addgene | 50337 | Level 0 terminator, 3’UTR, 35s (Cauliflower Mosaic Virus) |
Addgene | 48017 | End-link 2 for assembling 2 level one part into a level 2 acceptor |
Addgene | 48018 | End-link 3 for assembling 3 level one part into a level 2 acceptor |
Addgene | 48001 | Level 1 acceptor. Position 5. Forward orientation |
Addgene | 48007 | Level 1 Acceptor. Position 1. Reverse orientation |
Addgene | 50268 | Level 0 promoter (0.4 kb), 35s (Cauliflower Mosaic Virus) + 5’UTR, Ω (Tobacco Mosaic Virus) |
Addgene | 46966 | Used for designing CRISPR/Cas9 module |
Addgene | 46968 | Used for designing CRISPR/Cas9 module |
Addgene | 50334 | Level 0 Kanamycin/Neomycin/Paromomycin resistance cassette |
Topzeven | – | Used as filters for washing spore suspension |
Sigma-Aldrich | 8.17003 | PEG400 |
Duchefa Biochemie | E1674.0001 | Pots to grow Parasponia plantlets/seedlings |
Merck | 104871 | KH2PO4 |
Merck | 105033 | KOH |
Merck | 105153 | K2SO4O |
Van Leusden b.v. | – | Used as growing substrate for mychorrhization assay |
Duchefa Biochemie | S0225.0050 | SH-basal salt medium |
Duchefa Biochemie | S0411.0250 | SH-vitamin mixture |
Lehle Seeds | VIS-02 | Used as non-ionic surfactant in the washing step of stable transformation |
Merck | 137017 | NaCl |
VWR Chemicals | 89230-072 | C6H11NaO7 |
Merck | 106521 | Na2MoO4·2H2O |
Merck | 106574 | Na2HPO4·7H2O |
Merck | 567549 | NaH2PO4·H2O |
Sigma-Aldrich | 239313 | Na2SO4O |
Duchefa Biochemie | S0809.5000 | C12H22O11 |
Thermo-Fisher | B69 | Used in Golden Gate cloning assembly |
Thermo-Fisher | EL0013 | Used in Golden Gate cloning assembly |
Kulzer-Mitsui Chemicals Group | 64708806 | Methyl methacrylate-based resin powder |
Kulzer-Mitsui Chemicals Group | 64709003 | HEMA (2-hydroxyethyl methacrylate)-based resin solution |
Kulzer-Mitsui Chemicals Group | 66022678 | Methyl methacrylate-based resin solution |
Merck | 1159300025 | |
Acros | 189350250 | |
VWR Chemicals | 663684B | Polysorbate 20 |
Stout Perspex | – | pouches box material, lid |
Duchefa Biochemie | Y1333.1000 | |
Merck | 108816 | ZnCl2 |
Alfa Aesar | 33399 | ZnSO4O·7H2O |