Cell divisioner kan visualiseras i realtid med hjälp av fluorescerande märkta proteiner och tidsfördröjd mikroskopi. Med hjälp av protokollet som presenteras här, kan användare analysera cell Division timing dynamik, mitotisk spindel församling, och kromosom kongression och segregering. Defekter i dessa händelser efter RNA-interferens (RNAi)-medierad genknockdown kan bedömas och kvantifieras.
Drosophila S2-celler är ett viktigt verktyg för att studera Mitos i vävnads kulturen, vilket ger molekylära insikter i denna grundläggande cellulära process på ett snabbt och högt genomflöde. S2-celler har visat sig mottagliga för både fast-och Live-cell Imaging applikationer. I synnerhet kan levande cell avbildning ge värdefull information om hur förlust eller knockdown av en gen kan påverka kinetik och dynamik av viktiga händelser under celldelningen, inklusive mitotisk spindel församling, kromosom kongression och segregering, samt övergripande cellcykelns timing. Här använder vi S2 celler stabilt transfekterade med fluorescerande märkta mcherry: α-tubulin för att markera den mitotiska spindeln och GFP: cenp-a (kallad CID-genen i Drosophila) för att markera Centromeren för att analysera effekterna av viktiga mitotiska gener på tidpunkten för cell divisioner, från profas (särskilt vid uppdelning av kärnkrafts kuvert; NEBD) till uppkomsten av Anaphase. Detta Imaging-protokollet möjliggör också visualisering av spindeln mikrotubule och kromosom dynamik i hela Mitos. Häri strävar vi efter att tillhandahålla ett enkelt men omfattande protokoll som gör det möjligt för läsarna att enkelt anpassa S2-celler för levande bild experiment. Resultat som erhålls från sådana experiment bör utvidga vår förståelse av gener som är involverade i celldelningen genom att definiera deras roll i flera samtidiga och dynamiska händelser. Observationer som gjorts i detta cellkultursystem kan valideras och undersökas ytterligare in vivo med hjälp av den imponerande verktygslåda av genetiska metoder i flugor.
Cell Division är en process som är kritisk till alla multicellulära organismer, både i deras utveckling och homeostas1. Drosophila har länge använts som modell för studiet av celldelning, med experiment i olika vävnadstyper och genetiska förhållanden som ger viktiga insikter i processen. Även om många av dessa insikter kommer från fasta cell förhållanden, är cell Division en dynamisk procedur med många rörliga delar, vilket gör visualisering av levande celler integrerad för att bedöma RNAi eller genetiska knockout effekter på många delar av celldelning, inklusive och segregering samt cytokinesi.
Många protokoll har utvecklats och utnyttjats under årens lopp för att visualisera Drosophila cell divisioner in vivo. Olika grupper har odlat tekniker till avbildar uppdelningar i båda larv imaginal disketter och larv hjärna2,3,4,5,6,7,8 . Dessa tekniker, medan användbara för avbildning i specifika vävnader, är begränsade i genomströmningen och kräver ofta generering och underhåll av genetiska bestånd för att generera fluorescerande komponenter och förändra uttrycket av gener av intresse. Odlade S2-celler från Drosophila ger ett högre genomströmnings alternativ för att snabbt testa effekterna av olika gener i celldelningen. Dessutom, med förmågan att transfect olika fluorescerande proteiner, S2-celler kan snabbt modifieras för att bestämma effekterna av RNAi knockdown på många komponenter i celldelning. Fluorescent taggade gener av intresse kan också observeras i celldelning, vilket möjliggör dynamisk karakterisering av deras funktion9.
Här ger vi ett detaljerat protokoll för levande avbildning av mitotiska S2-celler med metoder som vi nyligen beskrev10. Vår metod utnyttjar stabilt transfekterade celler med fluorescerande markörer för mikrotubuli och centromerer vars uttryck är under kontroll av en kopparinducerbar promotor (metallothionein; PMT). Denna metod kan användas för att bild spindel och kromosom dynamik i alla faser av Mitos utnyttjar en relativt enkel fluorescerande Mikroskop med grundläggande bildprogram. Det kan anpassas ytterligare för att passa enskilda forskningsbehov, med övergående transfektion och RNAi erbjuder utökade möjligheter för att bestämma rollen av kandidatgener i Mitos. På grund av protokollets relativa enkelhet kan den användas för småskaliga skärm bilds skärmar för att identifiera gener för vilka ytterligare studier in vivo skulle vara fördelaktiga, vilket möjliggör mer fokuserade insatser och effektivitet med efterföljande genetiska manipulation i flugor.
Identifiera en lämplig cell
Nyckeln till avbildning dividera S2 celler är först lokalisera rätt cell. Tid kan slösas bort Imaging celler som felaktigt tros vara redo att dela men misslyckas med att göra det inom en rimlig tidsram. Celler måste identifieras som har två distinkta och synliga centrosomes och en intakt kärna. Centrosomes måste ha mikrotubule fibrer som utgår från dem, vilket ger dem en “stjärna-liknande” utseende. En intakt Nucleus bryts ljus när du justerar fokus, och gör också den ungefärliga mitten av cellen mörkare utseende. Kärnan kommer också att innehålla GFP: CID “dots”, ett annat utmärkande drag för att hjälpa till i identifieringen. Celler med > 2 centrosomes, tubulin Auktor utan tubulin fibrer som utgår från dem, eller celler med bara en centrosom bör undvikas. Dessutom, om två centrosomes är synliga, men en kärna är inte, NEBD har redan inträffat och cellen är för långt framskriden i sin division att avbildas om en komplett M-fas analys önskas. När en lämplig cell hittas, är hastigheten i startavbildning avgörande eftersom NEBD sker snabbt (vanligtvis inom 3-5 min) och fördröja starten av Imaging kan leda till missade möjligheter. Fokusera cellen i bildprogrammet snabbt så att båda centrosomes är synliga, eller om centrosomes är ur plan med varandra, Ställ in brännpunkten mellan de två, så att varje kan fångas när Z stackar samlas över och under den definierade Center Punkt. När fokuserade, omedelbart ställa in förskjutningen mellan scenen och levande cell kammaren yta med hjälp av infraröd fokus kontroll (om tillgängligt) och börja Imaging programmet. Även om det protokoll som presenteras här är speciellt anpassad för experiment som bedömer NEBD-till-Anaphase dynamik, kan enkla modifieringar passa läsarna att studera alternativa mitotiska händelser. För NEBD-till-metafase och Anaphase-till-Telophase Imaging, föreslår vi 10 s bildfångst intervall eftersom dessa processer är mycket dynamiska och sker snabbt i S2-celler (5-10 min). Metafase-till-Anaphase Transition (vår typiska experimentella fokus) är en längre process (20-30 min) i S2-celler, och vi samlar in bilder med 30 s intervall. Slutligen, Telophase-through-cytokinesi sker ganska långsamt i S2-celler, och vi föreslår 60 s intervall ger tillräckligt med upplösning för denna ungefärliga timme långa processen.
Bibehålla fokus i hela avbildningsprogrammet
Om en enhet för IR-fokuserings kontroll inte är tillgänglig, se till att undvika att stöta på mikroskopet eller bordet den sitter på, eftersom detta kan resultera i att cellen rör sig ur fokus under avbildningsprogrammet, vilket leder till tvetydiga, un-interpretable resultat. Pre-beläggning levande cell kammaren brunnar med poly-L-lysin kan hjälpa i cell följsamhet, vilket kan bidra till att undvika cellförflyttning och är särskilt användbart för inställningar utan IR fokus kontroller. Dessutom kan inställningar inklusive stötdämpande plattformar eller luft bord ytterligare hjälpa till att undvika att celler flyttas ur fokus. Slutligen, vissa program har paus funktioner gör det möjligt för användaren att fokusera om och återuppta programmet.
Imaging flera celler
Användbart för ackumulering av data är att ofta flera celler redo att dela kan placeras inom samma synfält för avbildning. Detta kan vara särskilt användbart för experiment där celler har långa M-fas varaktigheter eller långvarig gripande (t. ex. tillstånd som inducerar aktivering av SAC). För dessa celler, vi normalt bild tills cellerna är fotoblekt (ca 2-3 h), men den fullständiga tidpunkten för arresterade celler bör vara efter bedömning av forskaren. Ibland kan flera förskiljande celler vara i olika fokalplan, i vilket fall det kan vara bra att lägga till z-stackar för att rymma alla celler. Lägga till fler z-stackar kan också bidra till att förbättra upplösningen. Försiktighet bör iakttas genom att göra detta, men eftersom det kommer att utsätta celler för mer strålning och leda till snabbare photoblekning, samt leda till stora filstorlekar på hårddisk lagringsenheter.
Undvika foto blekning och fototoxicitet
Vår metod beskriver specifika inställningar för exponeringstider, bildintervall, z-stackar och procentuell genomsläpplighet för vår LED-ljuskälla som i allmänhet fungerar för vår experimentella installation och önskade resultat. Eftersom Mikroskop och experimentella mål kan variera, vad kan fungera bra för vårt system kan leda till för tidig foto blekning eller fototoxicitet i andra. Photodamage kan utgöra en brist på spindel rörelse, mikrotubuli fragmentering, defekt mikrotubuli dynamik, och förlängd spindel kontrollpunkt aktivering. En potentiell metod för att undvika sådana fallgropar är att begränsa exponeringstiden. De flesta moderna kameror har nu breda dynamiska intervall, och histogram kan justeras för att visualisera strukturer även vid mycket låga exponeringar. En annan teknik är att öka bild intervallet (t. ex. till flera minuter mellan bilderna) så att antalet gånger en cell utsätts för ljus över ett totalt insamlingsintervall reduceras. Detta är fördelaktigt särskilt i Imaging för längre tidsperioder (många timmar), och kan dessutom bidra till att minska filstorleken på sådana experiment. Begränsa antalet z stackar kan också bidra till att minska ljus exponering, med 2 eller till och med bara 1 istället för 3. Ytterligare, justera procent transmissionen av ljus (för LED-ljuskällor), eller använda neutral densitet (ND) filter (för både halogenlampa och LED-ljuskällor) kommer att minska ljusintensiteten och i kombination med längre exponeringstider kan bevara sikten . Genom att välja celler med centrosomes redan separerade, kan den totala exponeringen begränsas i att dessa celler vanligtvis in Mitos snabbt (inom en minut eller två) efter början Imaging. Man kan också begränsa den tid som celler får avbildas före NEBD. Vårt labb ställer vanligtvis denna tid på 10 min, men en mer konservativ gräns kan lätt åläggas av användaren. Dessutom, en mer “invasiv” åtgärd vi rekommenderar är behandling med dsRNA riktade mot en del av SAC (såsom Rod eller Mad2). Om en gripandet fenotyp beror på icke-specifika cellskador (t. ex. defekt mikrotubule dynamik), är en sådan behandling mindre benägna att undertrycka gripandet jämfört med en bona fide effekt av genen av intresse i det ursprungliga experimentet.
Framtida riktningar
Den metod som beskrivs här kan utnyttjas på ett relativt enkelt epifluorescerande Mikroskop för att snabbt avbilda levande cell divisioner och kan enkelt anpassas för att passa en forskares speciella experimentella design och mål. Flera utmärkta metoder för odling, RNAi knockdown metoder, övergående transfektion och fluorescens mikroskopi har publicerats för S2 och andra Drosophila celler9,14,15, 16 , 17. vårt protokoll erbjuder ett par fördelar. (1) användningen av en dubbel stabil cellinjer (GFP: CID, mCherry: α-tubulin) markerar samtidigt två viktiga mitotiska strukturer, undviker krångel och potentiella komplikationer av övergående transfektion, och ser till att nästan alla celler kommer att uttrycka fluorescerande markörer som potentiella kandidater för avbildning. (2) anpassningen till Mitos bidrar till publicerade protokoll som undersöker cytoskeletala dynamik i motila, icke-skiljande celler och sträcker sig till att undersöka mitotiska händelser i realtid. Även om vi tror att vår är en kraftfull teknik som bidrar till repertoaren av andra, kan det alltid finnas förbättringar som gjorts. Ett särskilt område av celldelning som vi har funnit svårt att bilden är centrosom division. Detta inträffar före nebd och det är svårt att avgöra när en enda centrosom är redo att separera i två. Använda fluorescerande cell cykel markörer (Cyclin A och Cyclin B) kan hjälpa till att lösa detta problem, men kommer på bekostnad av kanaler som kan användas för att visualisera komponenter cell division. Vår bästa strategi för att försöka visualisera centrosom Division är att lägga till Multipoint förvärv till Imaging programmet (definiera olika punkter i XY planet till bild), men detta kan resultera i stora filer, och kan också kräva (beroende på antalet poäng) öka intervallet mellan Bildinsamling, minskande tidsupplösning för den resulterande filmen. En annan lösning kan vara synkronisering av celler vid en önskad cell cykel stadiet med hjälp av läkemedel som riktar cell cykel regulatorer följt av efterföljande blekt före avbildning, även om dessa metoder inte kan vara tillförlitlig i S2-celler specifikt.
Det protokoll som presenteras här ger en grund för framtida tillämpningar i levande cell avbildning samt. Med förbättrad avbildning och programvara teknik, verkligen hög genomströmning anpassningar av detta protokoll med högre kapacitet, multi-chambered plattor kan vara möjligt. Sådana innovationer skulle göra storskaliga RNAi skärmar, såsom de som redan uppnåtts i fasta preparat12,18, mer tractable i en levande cellformat. Små molekyler drog skärmar kan också vara tänkt som ett sätt att identifiera nya föreningar som riktar cell Division processer. Förbättring av fluoroforer och optiska filter kan också leda till avbildning av flera mitotiska komponenter (inte bara de två som vi beskriver), vilket möjliggör avbildning av specifika mitotiska regulatorer och deras interaktioner med DNA och/eller spindeln. Till exempel, generera celler med fluorescerande reportrar som uttrycker efter DNA-skador eller under apoptos skulle vara användbara verktyg för att identifiera nya gener inblandade i dessa processer. Liknande metoder kan användas för att undersöka cellcykelns dynamik med uttrycket av Fluorescent taggade cyclins19.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av National Institutes of Health (R01 GM108756). Vi är tacksamma mot Gary karpen (University of California, Berkeley) för generöst förse oss med en GFP: CID S2 cellinjer lager som vår GFP: CID/mCherry: αTubulin linje genererades10.
Bright-Line Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | for cell counting |
cellSens imaging software | Olympus | ||
CELLSTAR Cell Culture Flask, 50ML, 25 CM2, PS, Red Filter Screw Cap, Clear, Sterile, 10PCS/BAG | Greiner Bio-One | 690175 | |
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate, 6 well, PS, Clear, TC, Lid with condensation rings, sterile, single packed | Greiner Bio-One | 657160 | |
Centrifuge 5804 R | eppendorf | Cat. 022623508 | |
Copper(II) sulfate pentahydrate, minimum 98% | Sigma-Aldrich | C3036-250G | |
Corning Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | MT35015CV | |
Effectene Transfection Reagent 1 mL | Qiagen | 301425 | for transient transfection |
IX-83 Inverted Epifluorescent Microscope | Olympus | ||
LabTek Chambered Slide Insert | Applied Scientific Instruments | I-3016 | |
MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | For dsRNA production |
MOXI Z Mini Automated Cell Counter Kit | ORFLO | MXZ001 | for cell counting |
MS-2000 XY Flat-Top Automated Stage and Controller | Applied Scientific Instruments | ||
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (no 1.5 borosilicate glass) 8-well | Thermo Fisher Scientific | 155409 | |
Orca-Flash 4.0 LT Camera | Hammamatsu Photonics K.K. | C11440-42U | |
pMT/V5-His A Drosophila Expression Vector | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets | Labconco | 302310000 | |
Schneider's insect medium | Sigma-Aldrich | S0146-100ML | |
Spectra Tub Centrifuge Tubes | VWR | 470224-998 | |
Uner Counter BOD Incubator | Sheldon manufacturing (VWR) | 89409-346 | |
X-CITE 120 LED | ExcelitasTechnologies | Led light source | |
Z -Drift Compensator (ZDC) | Olympus | infrared focus check |