Celle inddelinger kan visualiseres i realtid ved hjælp af fluorescently mærkede proteiner og tidsforskudt mikroskopi. Ved hjælp af protokollen præsenteres her, kan brugerne analysere celle division timing dynamik, mitotisk spindel samling, og kromosom kongresssion og adskillelse. Defekter i disse hændelser efter RNA-interferens (RNAi)-medieret gen-Knockdown kan vurderes og kvantificeres.
Drosophila S2-celler er et vigtigt redskab til at studere mitose i vævs kulturen, hvilket giver Molekylær indsigt i denne grundlæggende cellulære proces i en hurtig og høj gennemløb måde. S2-celler har vist sig at være modtagelige for både faste og levende celle billedbehandlings applikationer. Især kan Live-Cell Imaging give værdifulde oplysninger om, hvordan tab eller Knockdown af et gen kan påvirke kinetikken og dynamikken i vigtige begivenheder under celledeling, herunder mitotisk spindel samling, kromosom kongresssion, og adskillelse, samt samlede celle cyklus timing. Her bruger vi S2 celler stabilt transficeret med fluorescently Tagged mcherry: α-Tubulin at markere mitotiske spindel og gfp: cenp-A (benævnt ‘ CID ‘ gen i Drosophila) at markere centromer at analysere virkningerne af centrale mitotiske gener på timingen af celle inddelinger, fra prophase (specifikt ved opdeling af nukleare konvolutter; NEBD) til indtræden af anaphase. Denne billeddannelses protokol giver også mulighed for visualisering af spindel mikrotubulen og kromosom dynamik i hele mitosis. Heri sigter vi mod at levere en enkel, men omfattende protokol, der gør det muligt for læserne nemt at tilpasse S2-celler til eksperimenter med levende billeddannelse. Resultater opnået fra sådanne eksperimenter bør udvide vores forståelse af gener involveret i celledelingen ved at definere deres rolle i flere samtidige og dynamiske begivenheder. Observationer foretaget i dette cellekultursystem kan valideres og yderligere undersøges in vivo ved hjælp af den imponerende værktøjskasse af genetiske tilgange i fluer.
Celledeling er en proces, der er kritisk for alle flercellede organismer, både i deres udvikling og homøostase1. Drosophila har længe været brugt som model for studiet af celledeling, med eksperimenter i forskellige vævstyper og genetiske tilstande, der giver vigtig indsigt i processen. Mens mange af disse indsigter kommer fra faste celle forhold, er celledeling en dynamisk procedure med mange bevægelige dele, hvilket gør visualisering af levende celler integreret i vurderingen af RNAi eller genetiske knockout effekter på mange dele af celledeling, herunder spindel dannelse, kromosom Kongressens og segregation, og Cytokinesis.
Mange protokoller er blevet udviklet og udnyttet i årenes løb til at visualisere Drosophila celle divisioner in vivo. Forskellige grupper har dyrket teknikker til billed inddelinger i både larve imaginal skiver og larve hjerner2,3,4,5,6,7,8 . Disse teknikker, som er nyttige til billeddannelse i specifikke væv, er begrænsede i gennemløb og kræver ofte generering og vedligeholdelse af genetiske bestande for at generere fluorescerende komponenter og ændre udtryk for gener af interesse. Kulturperler S2 celler fra Drosophila giver en højere gennemløb alternativ til hurtigt at teste virkningerne af forskellige gener i celledeling. Desuden, med evnen til at transficere forskellige fluorescerende proteiner, kan S2 celler hurtigt ændres for at bestemme virkningerne af RNAi Knockdown på talrige komponenter i celledeling. Fluorescently mærkede gener af interesse kan også observeres i celledeling, giver mulighed for dynamisk karakterisering af deres funktion9.
Her giver vi en detaljeret protokol for levende billeddannelse af mitotiske S2-celler ved hjælp af metoder, vi for nylig beskrev10. Vores metode udnytter stabilt transficeret celler med fluorescerende markører for microtubuler og centromeres, hvis udtryk er under kontrol af en kobber-inducerbar promotor (metallothionein; PMT). Denne metode kan bruges til at billed spindel og kromosom dynamik i alle faser af mitose udnytte en relativt simpel fluorescerende mikroskop med grundlæggende imaging software. Det kan tilpasses yderligere til at passe individuelle forskningsbehov, med forbigående transfektering og RNAi tilbyder udvidede muligheder for at bestemme rollen af kandidat gener i mitose. På grund af protokollens relative enkelhed kan den anvendes til mindre tabs-of-Function-skærme for at identificere gener, for hvilke yderligere undersøgelse in vivo ville være gavnlig, hvilket giver mulighed for en mere fokuseret indsats og effektivitet med efterfølgende genetiske manipulation i fluer.
Identifikation af en passende celle
Nøglen til Imaging dividere S2 celler er først at finde den rigtige celle. Tid kan være spildt billed celler, der fejlagtigt menes at være klar til at opdele, men undlader at gøre det inden for en rimelig tidsramme. Celler skal identificeres, der har to forskellige og synlige centrosomer og en intakt kerne. Centrosomes skal have mikrotubulus fibre stammer fra dem, hvilket giver dem et “stjerne-lignende” udseende. En intakt Nucleus indfaldende afbøjes lys, når du justerer fokus, og gør også den omtrentlige midten af cellen mørkere i udseende. Kernen vil også indeholde GFP: CID “dots”, en anden karakteristisk funktion til at hjælpe i sin identifikation. Celler med > 2 centrosomer, Tubulin punkta uden Tubulin fibre stammer fra dem, eller celler med kun én centrosomes bør undgås. Derudover, hvis to centrosomer er synlige, men en kerne er ikke, er nebd allerede sket, og cellen er for langt fremme i sin division, der skal afbildet, hvis en komplet M-fase analyse ønskes. Når en passende celle er fundet, hastighed i at starte Imaging er afgørende, da NEBD opstår hurtigt (typisk inden for 3-5 min) og forsinke starten af Imaging kan føre til mistede muligheder. Fokuser cellen i billedbehandlings softwaren hurtigt sådan, at begge centrosomer er synlige, eller hvis centrosomer er ude af flyet med hinanden, sæt omdrejningspunktet mellem de to, således at hver kan fanges, når Z stakke indsamles over og under det definerede Center Punkt. Når fokuseret, straks indstille forskydningen mellem scenen og levende celle kammer overflade ved hjælp af infrarød fokus kontrol (hvis tilgængelig) og begynde Imaging program. Selv om protokollen præsenteres her er specielt skræddersyet til eksperimenter vurdere NEBD-til-anaphase dynamik, enkle modifikationer kunne passe læsere studere alternative mitotiske begivenheder. For NEBD-to-metaphase og anaphase-to-telophase Imaging, foreslår vi 10 s billed optagelses intervaller, da disse processer er meget dynamiske og forekommer hurtigt i S2-celler (5-10 min). Metaphase-to-anaphase Transition (vores typiske eksperimentelle fokus) er en længere proces (20-30 min) i S2-celler, og vi samler billeder med 30 s intervaller. Endelig, telophase-through-Cytokinesis forekommer ganske langsomt i S2-celler, og vi foreslår 60 s intervaller giver nok opløsning til denne omtrentlige time lange proces.
Opretholde fokus i hele billedbehandlingsprogrammet
Hvis en infrarød fokus kontrolenhed ikke er tilgængelig, skal du sørge for at undgå at støde mikroskopet eller bordet det sidder på, da dette kan resultere i cellen bevæger sig ud af fokus under Imaging program, hvilket fører til tvetydige, un-interpretable resultater. Pre-coating den levende celle kammer brønde med poly-L-lysin kan hjælpe i celle tilslutning, som kan hjælpe med at undgå celle bevægelse og er især nyttigt for opsætninger uden infrarød fokus kontrol. Derudover kan opsætninger, herunder stødabsorberende platforme eller luft borde, hjælpe med at undgå, at celler bevæger sig ud af fokus. Til sidst, noget programmel planer nyde pause funktioner tillade den bruger hen til koncentrere og genoptage den plan.
Imaging flere celler
Nyttigt at ophobning af data er, at ofte flere celler klar til at opdele kan placeres inden for samme synsfelt til Imaging. Dette kan især være nyttigt for eksperimenter, hvor cellerne har lange M-fases varigheder eller længerevarende anholdelse (f. eks. tilstande, der inducerer at aktivere SAC). For disse celler, vi typisk billede, indtil cellerne er fotoblegede (ca. 2-3 h), men den fulde timing af arresterede celler bør være på skøn af forskeren. Nogle gange kan de flere præ-dividere celler være i forskellige brændfly, i hvilket tilfælde det kan være nyttigt at tilføje z-stakke for at rumme alle celler. Tilføjelse af flere z-stakke kan også hjælpe med at forbedre opløsningen. Der bør dog udvises forsigtighed ved at gøre dette, da det vil udsætte cellerne for mere stråling og føre til hurtigere foto blegning, samt føre til store filstørrelser på harddisk lagringsenheder.
Undgå foto blegning og fototoksicitet
Vores metode beskriver specifikke indstillinger for eksponeringstider, billedbehandlings intervaller, z-stakke og procent transmittering for vores LED-lyskilde, der generelt arbejder for vores eksperimentelle opsætning og ønskede resultater. Som mikroskoper og eksperimentelle mål kan variere, hvad der kan fungere godt for vores system kan føre til for tidlig foto blegning eller fototoksicitet i andre. Foto skader kan medføre mangel på spindel bevægelse, fragmentering af mikrotubulen, defekt mikrotubulær dynamik og forlænget spindel kontrolpunkts aktivering. En potentiel metode til at undgå sådanne faldgruber er at begrænse eksponeringstid. De fleste moderne kameraer nu besidder brede dynamiske intervaller, og histogrammer kan justeres til at visualisere strukturer selv ved meget lav eksponering. En anden teknik er at øge billedbehandlings intervallet (f. eks. til flere minutter mellem billeder), således at antallet af gange, en celle udsættes for lys over et samlet indsamlings interval, reduceres. Dette er fordelagtigt især i Imaging i længere perioder (mange timer), og kan desuden hjælpe med at mindske filstørrelsen af sådanne eksperimenter. Begrænsning af antallet af z stakke taget kan også bidrage til at reducere lys eksponering, ved hjælp af 2 eller endda bare 1 i stedet for 3. Yderligere, justering af procent transmittans af lys (for LED lyskilder), eller udnytte neutrale tæthed (ND) filtre (for både halogen lampe og LED lyskilder) vil mindske lysintensiteten og kombineret med længere eksponeringstider kan bevare synlighed . Ved at vælge celler med centrosomes allerede adskilt, kan den samlede eksponering begrænses ved, at disse celler normalt indtaster mitose hurtigt (inden for et minut eller to) efter påbegyndelse af billeddannelse. Man kan også begrænse den tid, celler får lov til at blive afbildet før nebd. Vores laboratorium typisk sætter denne gang på 10 min, men en mere konservativ grænse kan nemt pålægges af brugeren. Derudover, en mere “invasiv” foranstaltning, vi anbefaler, er behandling med dsRNA målrettet mod en komponent af SAC (såsom stang eller Mad2). Hvis en arrestation af fænotype skyldes ikke-specifik celle skade (f. eks. defekt mikrotubulær dynamik), er en sådan behandling mindre tilbøjelig til at undertrykke anholdelsen sammenlignet med en bona fide -effekt af det pågældende gen af interesse i det oprindelige eksperiment.
Fremtidige retninger
Den metode, der er beskrevet her, kan udnyttes på et relativt simpelt epifluorescerende mikroskop til hurtigt at billed levende celle divisioner og kan nemt tilpasses til en forskers særlige eksperimentelle design og mål. Flere fremragende metoder til dyrkning, RNAi-Knockdown-tilgange, forbigående transfection og Fluorescens mikroskopi er blevet offentliggjort for S2 og andre Drosophila -celler9,14,15, 16 , 17. vores protokol giver et par fordele. (1) brugen af en dobbelt stabil cellelinje (GFP: CID, mCherry: α-Tubulin) markerer samtidig to centrale mitotiske strukturer, undgår besværet og potentielle komplikationer ved forbigående transfection og sikrer, at næsten alle celler vil udtrykke fluorescerende markører som potentielle kandidater til billeddannelse. (2) tilpasningen til mitose tilføjer til offentliggjorte protokoller undersøger cytoskelet dynamik i motile, ikke-dividere celler og strækker sig til at undersøge mitotiske hændelser i realtid. Mens vi mener, at vores er en kraftfuld teknik, der tilføjer til repertoiret af andre, kan der altid være forbedringer lavet. Et bestemt område af celledeling, som vi har fundet svært at billedet er centrosome division. Dette sker før NEBD, og det er svært at afgøre, hvornår en enkelt centrosome er klar til at adskille i to. Brug af fluorescerende celle cyklus markører (cyclin A og cyclin B) kan hjælpe med at løse dette problem, men kommer på bekostning af kanaler, der kan bruges til at visualisere celledeling komponenter. Vores bedste strategi for at forsøge at visualisere centrosome division er at tilføje multipoint erhvervelse til Imaging program (definere forskellige punkter i XY flyet til billedet), men dette kan resultere i store filer, og kan også kræve (afhængigt af antallet af point) forøgelse af intervallet mellem billedsamling, faldende tidsopløsning af den resulterende film. En anden løsning kunne være synkronisering af celler på en ønsket celle cyklus fase ved hjælp af lægemidler, der er målrettet celle cyklus regulatorer efterfulgt af efterfølgende udskylning forud for Imaging, selv om disse metoder ikke kan være pålidelige i S2 celler specifikt.
Protokollen præsenteres her giver et fundament for fremtidige applikationer i live Cell Imaging samt. Med forbedret billeddannelse og software teknologi, virkelig høj gennemløb tilpasninger af denne protokol ved hjælp af højere kapacitet, multi-Chambered plader kunne være muligt. Sådanne innovationer ville gøre store RNAi-skærme, såsom dem, der allerede er opnået i faste præparater12,18, mere Tractable i et live Cell-format. Små molekyle stof skærme kunne også forestilles som et middel til at identificere nye forbindelser målretning celle division processer. Forbedring af fluorophorer og optiske filtre kan også føre til billeddannelse af flere mitotiske komponenter (ikke kun de to, vi beskriver), hvilket muliggør billeddannelse af specifikke mitotiske regulatorer og deres interaktioner med DNA og/eller spindlen. For eksempel vil generering af celler med fluorescerende reportere, der udtrykker efter DNA-skaden eller under apoptose, være nyttige værktøjer til at identificere nye gener involveret i disse processer. Lignende tilgange kan anvendes til at undersøge celle cyklus dynamik ved hjælp af udtrykket fluorescently Tagged cyclins19.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev finansieret af National Institutes of Health (R01 GM108756). Vi er taknemmelige for Gary karpen (University of California, Berkeley) for generøst at give os en GFP: CID S2 cellelinje bestand, hvorfra vores GFP: CID/mCherry: αTubulin linje blev genereret10.
Bright-Line Hemacytometer | Sigma-Aldrich | Z359629-1EA | for cell counting |
cellSens imaging software | Olympus | ||
CELLSTAR Cell Culture Flask, 50ML, 25 CM2, PS, Red Filter Screw Cap, Clear, Sterile, 10PCS/BAG | Greiner Bio-One | 690175 | |
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate, 6 well, PS, Clear, TC, Lid with condensation rings, sterile, single packed | Greiner Bio-One | 657160 | |
Centrifuge 5804 R | eppendorf | Cat. 022623508 | |
Copper(II) sulfate pentahydrate, minimum 98% | Sigma-Aldrich | C3036-250G | |
Corning Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | MT35015CV | |
Effectene Transfection Reagent 1 mL | Qiagen | 301425 | for transient transfection |
IX-83 Inverted Epifluorescent Microscope | Olympus | ||
LabTek Chambered Slide Insert | Applied Scientific Instruments | I-3016 | |
MEGAscript T7 Transcription Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1334 | For dsRNA production |
MOXI Z Mini Automated Cell Counter Kit | ORFLO | MXZ001 | for cell counting |
MS-2000 XY Flat-Top Automated Stage and Controller | Applied Scientific Instruments | ||
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (no 1.5 borosilicate glass) 8-well | Thermo Fisher Scientific | 155409 | |
Orca-Flash 4.0 LT Camera | Hammamatsu Photonics K.K. | C11440-42U | |
pMT/V5-His A Drosophila Expression Vector | Thermo Fisher Scientific | V412020 | |
Poly-L-Lysine | Cultrex | 3438-100-01 | |
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets | Labconco | 302310000 | |
Schneider's insect medium | Sigma-Aldrich | S0146-100ML | |
Spectra Tub Centrifuge Tubes | VWR | 470224-998 | |
Uner Counter BOD Incubator | Sheldon manufacturing (VWR) | 89409-346 | |
X-CITE 120 LED | ExcelitasTechnologies | Led light source | |
Z -Drift Compensator (ZDC) | Olympus | infrared focus check |