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Genetics

Uso de células de Drosophila S2 para imagens ao vivo da divisão celular

doi: 10.3791/60049 Published: August 23, 2019

Summary

As divisões celulares podem ser visualizadas em tempo real usando proteínas marcadas com cDNAs e microscopia de lapso temporal. Usando o protocolo apresentado aqui, os usuários podem analisar a dinâmica de sincronismo da divisão celular, o conjunto do eixo mitótico, e o cromossomos e a segregação do cromossoma. Os defeitos nestes eventos que seguem a interferência do RNA (RNAi)-knockdown do gene negociado podem ser avaliados e quantificados.

Abstract

Drosophila As células S2 são uma ferramenta importante no estudo da mitose na cultura do tecido, proporcionando insights moleculares sobre este processo celular fundamental de forma rápida e de alta taxa de transferência. As pilhas S2 provaram o passíveis às aplicações da imagem latente do fixo-e da vivo-pilha. Notavelmente, a imagem latente da vivo-pilha pode render a informação valiosa sobre como a perda ou o knockdown de um gene podem afetar a cinética e a dinâmica de eventos chaves durante a divisão da pilha, incluindo o conjunto mitotic do eixo, o congression do cromossoma, e a segregação, assim como tempo geral do ciclo celular. Aqui nós utilizamos células S2 estavelmente transfected com cDNAs Tagged mcherry: α-tubulin para marcar o eixo mitótico e GFP: CENP-a (referido como ' CID ' gene na Drosophila) para marcar o Centrómero para analisar os efeitos dos genes mitóticos chave sobre o tempo de divisões celulares, de prófase (especificamente na avaria nuclear do envelope; NEBD) ao início da anaphase. Este protocolo da imagem latente igualmente permite a visualização do microtubule do eixo e da dinâmica do cromossoma durante todo o mitosis. Nisto, nós apontamos fornecer um protocolo simples contudo detalhado que permita que os leitores adaptem facilmente pilhas S2 para experiências vivos da imagem latente. Os resultados obtidos de tais experimentos devem ampliar nossa compreensão dos genes envolvidos na divisão celular, definindo seu papel em vários eventos simultâneos e dinâmicos. As observações feitas neste sistema da cultura da pilha podem ser validadas e investigadas mais mais in vivo usando o Toolkit impressive de aproximações genéticas nas moscas.

Introduction

A divisão celular é um processo crítico para todos os organismos multicelulares, tanto no desenvolvimento como na homeostase1. A Drosophila tem sido usada por muito tempo como um modelo para o estudo da divisão celular, com experimentos em vários tipos de tecidos e condições genéticas que fornecem insights importantes sobre o processo. Enquanto muitos desses insights vêm de condições de células fixas, divisão celular é um procedimento dinâmico com muitas partes móveis, tornando a visualização de células ao vivo integral para avaliar RNAi ou efeitos genéticos Knockout em inúmeras partes da divisão celular, incluindo formação do eixo, do Congresso e segregação do cromossoma, e cytokinesis.

Muitos protocolos foram desenvolvidos e utilizados ao longo dos anos para visualizar as divisões de células de Drosophila in vivo. Vários grupos têm cultivado técnicas para divisões de imagem em ambos os discos de imaginal larval e cérebros larval2,3,4,5,6,7,8 . Estas técnicas, embora úteis para a imagem latente em tecidos específicos, são limitadas na taxa de transferência e exigem frequentemente a geração e a manutenção de estoques genéticos para gerar componentes fluorescentes e para alterar a expressão dos genes do interesse. As células S2 cultivadas da Drosophila fornecem uma alternativa de throughput mais alta para testar rapidamente os efeitos de vários genes na divisão celular. Além disso, com a habilidade de transfecção várias proteínas fluorescentes, as pilhas S2 podem rapidamente ser modificadas para determinar os efeitos do knockdown de RNAi em componentes numerosos da divisão da pilha. Genes marcados fluorescently de interesse também podem ser observados na divisão celular, permitindo a caracterização dinâmica de sua função9.

Aqui nós fornecemos um protocolo detalhado para a imagem latente viva de pilhas de S2 mitotic usando métodos que nós descrevemos recentemente10. Nosso método utiliza pilhas estàvel transfected com os marcadores fluorescentes para microtúbulos e centrómeros cuja a expressão está o controle de um promotor cobre-inducible (Metallothionein; PMT). Esta metodologia pode ser usada para a dinâmica do eixo e do cromossoma da imagem em todas as fases do mitose que utiliza um microscópio fluorescente relativamente simples com software básico da imagem latente. Pode ser mais personalizado para atender às necessidades individuais de pesquisa, com transfecção transitória e RNAi oferecendo possibilidades expandidas para determinar o papel dos genes candidatos em mitose. Devido à relativa simplicidade do protocolo, ele pode ser usado para telas de perda de função de pequena escala para identificar genes para os quais o estudo in vivo seria benéfico, permitindo esforços mais focados e eficiência com a subsequente genética manipulação em moscas.

Protocol

1. preparação de células S2 para tratamento com RNAi

  1. De uma cultura de estoque de pMT confluente: GFP: CID e pMT: mCherry: α-tubulin estàvel transfected as pilhas S2 (~ 80% viáveis; crescido em 24-28 ° c), as pilhas de semente em uma placa de cultura 6 bem estéril em uma densidade de 1 x 106 Cells/ml no soro bovino fresco, aquecido, de 10% FETAL (FBS) a mídia de insetos da Schneider (SIM).
    Nota:
    as células S2 estavelmente transfectadas podem ser geradas seguindo um protocolo do centro de triagem Drosophila RNAI (drsc) (https://DGRC.bio.indiana.edu/Protocols?Tab=Cells). Embora a linha S2 estável específica usada nisto utilize GFP e mCherry, as alternativas numerosas existem ambos dentro destes espectros fluorescentes assim como outro. Uma discussão detalhada destas proteínas fluorescentes está além do alcance deste protocolo, mas suas propriedades e vantagens/desvantagens potenciais foram revistas habilmente em outros lugares 11.
    1. Usando um contador de células ou Hemocytometer, determinar a densidade do estoque de células confluentes.
    2. Determine o volume de suspensão de células confluentes necessário para atingir 1 x 106 células/ml em um volume total de 4 ml (por exemplo, ~ 4 x 106 células totais). Adicione este volume do estoque da pilha a um volume de SIM fresco para fazer o volume total de 4 mL/well. Determine a densidade do estoque da pilha (Cells/ml) diluindo 100 μl das pilhas diretamente do frasco do estoque com 100 μl dos meios e contando esta diluição 1:2 manualmente com um hemocitômetro ou com um contador automático da pilha se disponível.
      Nota: Se utilizar células S2 não estavelmente transfectadas, pode ser realizado um ensaio de transfecção transitória com etiquetada fluorescentamente (GFP, mCherry, etc.) α-ou β-tubulina, e um marcador de DNA (CENP-A, histona H2B, etc.). Mais, as linhas de pilha estàvel transfected com vário eixo mitotic e os marcadores do ADN estão disponíveis do centro do recurso da genética de Drosophila que pode melhor serir as necessidades experimentais exatas do usuário (https://DGRC.bio.indiana.edu/Cells/Catalog).
    3. Coloc pilhas recentemente semeadas na incubadora de 24-28 ° c para 36-48 h.

2. tratamento de células semeadas com dsRNA contra gene (s) de interesse

Nota: O exemplo a seguir e a seção de resultados usarão shortstop (tiro), um agente de reticulação de actina-microtubule como o gene de interesse. Use um tratamento simulado sem dsRNA ou com dsRNA dirigida contra um gene irrelevante (por exemplo, beta-galactosidase, lacZ) como um controle negativo.

  1. A mídia de insetos do warm Schneider não suplementada com a FBS (mídia livre de soro; SFM) na incubadora de 24-28 ° c.
  2. Transfira as células do poço previamente semeado (da etapa 1.1.2) para um tubo estéril de 15 mL, observando o volume total de células transferidas.
    1. Manter um pequeno volume de células (~ 100 μL) para a contagem em um contador de células ou Hemocytometer.
  3. Gentilmente pellet células por centrifugação em 1.000 x g por 3 min à temperatura ambiente.
    1. Enquanto as células de centrifugação, determinar a concentração de células por mL usando um contador de células ou Hemocytometer. Multiplique esse número pelo volume total sendo centrifugado (observado em 1.2.2.) para obter o número total de células.
  4. Aspirar o sobrenadante das células peletizadas.
  5. Re-suspender as células em SFM aquecido para obter uma concentração de 3 x 106 células/ml.
    1. Transfira 1 mL das células reressuscitadas para um poço novo numa placa de 6 poços.
  6. Adicionar 10-50 μg de dsRNA (diluído em 100 μL de água livre de RNAase) contra shot (ou o gene alvo de interesse) diretamente para as células e agitar a placa para misturar. Incubar a placa durante 1 h na incubadora de 24-28 ° c para permitir a captação direta de dsRNA em células.
  7. Durante a incubação de 1 h, aqueça os 10% FBS suplementados SIM na incubadora de 24-28 ° c.
  8. Após a incubação de células com dsRNA por 1 h, adicionar 2 mL de 10% FBS suplementado SIM diretamente para o poço sem remover o 1 mL de mídia.
  9. Coloc pilhas na incubadora do ° c 24-28 por 3-7 dias.
    Nota: Tal como com a concentração de dsRNA, o tempo total de tratamento pode necessitar de ser otimizado para o gene alvo pretendido. Para avaliar a eficácia de RNAi, realize um borrão ocidental em os lysates inteiros da pilha usando um anticorpo de encontro ao gene do alvo. Se a sequência de destino dsRNA inicial revelar-se ineficaz, projetando dsRNAs alternativos direcionados a sequências exclusivas dentro do gene alvo.

3. indução de expressão de proteínas fluorescentes e preparação de células para imagens

  1. Se as pilhas estàvel transfected foram geradas usando o plasmídeo de PMT (que contem um promotor induzível do metalotioneína) como descrito aqui, induzem a expressão de proteínas fluorescentes tratando pilhas com o sulfato de cobre (CuSO4) em uma concentração final de 500 μM para 24-36 h antes da imagem latente e 4 dias após o tratamento de RNAi. O uso de plasmís de expressão constitutiva, como o pacto, não requer indução de cobre.
  2. Preparar células para imagens
    1. Aqueça o SIM suplementado de 10% FBS na incubadora de 24-28 ° c por 1 h.
    2. Transfira as células para um tubo estéril de 15 mL, observando o volume total de células transferidas.
      1. Manter um pequeno volume de células (~ 100 μL) para a contagem em um contador de células ou Hemocytometer.
    3. Gentilmente pellet células por centrifugação em 1.000 x g por 3 min à temperatura ambiente.
      1. Enquanto as células de centrifugação, determinar a concentração (células/mL) usando um contador de células ou Hemocytometer. Multiplique esse número pelo volume total sendo centrifugado (observado em 2.2.2.) para obter o número total de células.
    4. Aspirar o sobrenadante das células peletizadas.
    5. Ressuscitem as células em fresco, aquecido 10% FBS suplementado SIM para obter uma concentração de 2 x 106 células/ml. Adicione uma quantidade apropriada de CuSO4 para manter a concentração de 500 μm.
    6. Transfira 200-500 μL de pilhas re-suspendidas a um poço de uma câmara viva do multi-poço da pilha e coloc no microscópio fluorescente invertido. Permita que as células se instalem na câmara por 15-30 min antes dos experimentos de imagem.
      Nota: Os poços de câmara de células ao vivo podem ser pré-revestidos com poli-L-lisina para adesão adicional.

4. configurar um programa de imagens de células ao vivo

Nota: A imagem latente viva da pilha neste experimento foi executada usando um sistema invertido da imagem latente e seu software associado (por exemplo, Olympus IX83 com o pacote de software das dimensões de cellSens). Os detalhes diferirão pelo fabricante do microscópio e pelo pacote de software; assim, as diretrizes e operações gerais estão listadas abaixo.

  1. Usando o software que executa o microscópio fluorescente invertido, prepare um programa para a imagem latente uma pilha (ou pilhas) sobre o tempo.
    1. Abra o software clicando duas vezes no ícone do desktop do software.
    2. Crie um novo arquivo experimental clicando em arquivo, em seguida, novo arquivo experimental.
    3. Primeiro, insira um loop de lapso de tempo sobre o qual as imagens serão tiradas. Faça isso clicando no ícone do cronômetro (íconeTime-Lapse loop ) na barra de ícones. Defina o intervalo em s na guia Gerenciador de experimentos e, em seguida, defina o número de ciclos na mesma guia dividindo o comprimento de experimento geral desejado (em s) pelo intervalo. Permita que o loop repita sobre o período de tempo total desejado.
      Nota: Normalmente, as imagens são tomadas a cada 30-60 s durante um período de 3-4 h.
    4. Dentro da camada de loop de lapso de tempo, insira uma verificação de foco infravermelho para manter o foco do objetivo (se disponível). Para fazer isso, adicione uma etapa Z-Drift Compensation (ZDC) dentro da camada Time-Lapse loop clicando no quadrado com ícone de duas setas (mover ícone XY) e selecionando z-Drift Compensation no menu suspenso.
      Nota: O termo verificação de foco infravermelho refere-se a um sistema pelo qual um pulso infravermelho é usado para manter uma distância constante entre o objetivo e a câmara de slide/imagem. Muitos microscópios têm tal sistema, cada um com sua própria nomenclatura proprietária. Os leitores devem consultar seu manual de operação ou representante para detalhes de nomeação específicos.
    5. Após a verificação de foco infravermelho, adicione uma etapa no programa para tirar uma imagem multicanal (por exemplo, FITC para GFP e TRITC para mCherry) sobre um 3-5 z-Stacks inserindo primeiro uma etapa de pilha z, em seguida, especificando o canal. Faça isso adicionando uma camada de grupo multicanal dentro da camada de loop de lapso de tempo clicando no ícone de roda de cores (ícone degrupo multicanal ). Em seguida, adicione uma camada Z-Stack loop dentro da camada de grupo multicanal clicando no ícone de 3 camadas (íconede loop de pilha z ). Defina o tamanho da etapa desejada e o número de fatias na guia Gerenciador de experimentos e defina a exposição de cada canal o mais baixo possível para minimizar o fotobranqueamento.
      Nota: O intervalo de pilha z, o tempo de exposição e a transmitância de porcentagem para LEDs podem variar. Típico nestas experiências, use três pilhas z tomadas sobre uma escala de 3 μm, dando um intervalo de 1 μm entre cada pilha. Definir o centro da célula em vez de superior e inferior tende a levar aos melhores resultados. As imagens são coletadas para cada canal (s) em uma exposição de 50 ms e por cento de transmitância de 50% sem filtro de densidade neutra (ND) acoplado.

5. imagem dividindo células usando Live Cell Imaging Program

Nota: As células S2 não necessitam de CO2 e crescem optimamente a 23-27 ° c. Toda a imagem latente foi executada na temperatura ambiental em um quarto bem controlado.

  1. Usando os oculars, encontrar o canto superior (ou inferior) do poço e concentrar o objetivo (40-60x imersão a óleo) para as células usando o mCherry (α-tubulin) canal.
  2. Digitalizar ao longo da parte superior (ou inferior) do poço para afastar-se do divisor de poço vertical.
    Nota: A imagem latente demasiado próxima aos divisores do poço pode interferir com verificações infravermelhas do foco.
  3. Encontre uma célula (ou células) que estejam no G2 tardio ou na fase M precoce (prófase).
    Nota: Essas células podem ser melhor identificadas pela existência de exatamente duas estruturas microtubulares "semelhantes a estrelas" (centrosomas) e um núcleo intacto (indicado por uma região circular de luz refratada dentro da célula), ambos facilmente distinguidos usando o α-tubulin (vermelho) filtro de excitação. A seleção de células na interfase anterior, notável por um ou zero centrosomas facilmente visíveis, pode resultar em desperdício de tempo devido a um atraso na progressão G2/M. Inversamente, a seleção das pilhas após NEBD impedirá o cálculo exato do sincronismo mitotic e da imagem latente do conjunto adiantado do eixo e da dinâmica do cromossoma. Além disso, as células S2 geralmente contêm > 2 centrosomas. Embora estes aglomeram tipicamente em um eixo bipolar12, recomenda-se que os usuários que evitam estas pilhas a menos que desejado de outra maneira para o projeto experimental. Imagens e discussão de células apropriadas para selecionar podem ser encontradas na seção de resultados representativos .
  4. Clique no botão Visualização ao vivo para começar a visualizar as células na tela do software. Usando o botão de foco fino do microscópio, concentrar a célula (ou células) de interesse. Defina a verificação de foco infravermelho clicando no botão definir foco .
  5. Inicie o programa de imagem de lapso de tempo clicando no botão Iniciar . Ajuste os histogramas conforme necessário selecionando o canal desejado e ajustando as intensidades médias de pixel para ver claramente a célula (ou células) de interesse.
  6. Permitir que o programa para executar, verificando a célula após 15-20 min para garantir a avaria do envelope nuclear (NEBD) ocorreu, que é determinado pelo desaparecimento do escuro rodada, um ponto refratado perto do centro de células.
  7. Continue permitindo que o programa seja executado, verificando intermitentemente (a cada 15-20 min) para determinar uma vez que o início da anaphase ocorreu. Pare o programa neste ponto se houver mais tempo restante no período de tempo total e salve o arquivo. Alternativamente, se os eventos durante o telófase e o citocinese forem do interesse, permita que o programa funcione uma hora suficiente a fim imagem estes processos também.
  8. Realize a análise de NEBD ao sincronismo do início do anaphase anotando o tempo de NEBD (tnebd) no minuto e o tempo da separação inicial do cromossoma (início do anaphasedo t) no minuto e subtraindo tnebd doinício do anaphase do t para obter o NEBD ao tempo de início da anaphase para uma determinada célula.
    1. Faça isso clicando no botão de quadro e observando os quadros onde ocorrem NEBD e anaphase início, subtraindo-os para determinar o número total de quadros decorrido e multiplicando - o pelo intervalo de tempo entre quadros de imagem.
  9. Continue a digitalização para células de pré-divisão para obter múltiplos n ' s para uma determinada condição. As pilhas podem ser imaged no poço vivo da câmara da pilha para até 12 h após seu estabelecimento inicial.

Representative Results

Os métodos que descrevemos acima resultará na identificação e imagem de células da Drosophila S2 submetidas à divisão celular. As células que estão prestes a se dividir (ou seja, antes de entrar na fase M) podem ser direcionadas pela presença de dois centrosomas e um núcleo intacto indicado pela luz refratada e um ponto mais escuro dentro da célula quando visualizado no canal α-tubulina (Figura 1, esquerda-a maioria dos painéis, canal vermelho; seta na Figura 1a). Estimamos que aproximadamente 2-5% das células caem nesta categoria, e entre experimentos de imagem, normalmente gastamos um máximo de 2-3 minutos de digitalização para outra célula qualificada. O NEBD pode ser visualizado através do desaparecimento deste ponto escuro, resultando na coloração uniforme do citoplasma (Figura 1, painéis marcados como "00:00", vermelho). Depois que nebd, o tempo cada pilha toma para dar forma ao eixo, os cromossomas do Congress, e os cromossomas do segregar podem ser medidos simplesmente anotando os pontos do tempo destes eventos relativos a nebd.

Nós utilizamos estas divisões para avaliar o sincronismo mitotic, especificamente de NEBD ao início do anaphase, anotando o ponto em que os cromossomas começam a se separar. A maioria (~ 90%) de pilhas cobre-induzidas, expressaram ambos mCherry: α-tubulin e GFP: CID. Uma pequena percentagem de células (~ 10%) expressa apenas um marcador ou nenhum. Estas pilhas foram evitadas durante a seleção da pilha. Tipicamente, as células S2 exibem o NEBD para o tempo de início da anaphase entre 20-30 minutos (Figura 1a, controle). Nós células tratadas em seguida com o dsRNA alvejado de encontro ao shortstop (tiro), uma proteína de reticulação do Actin-microtubule nós suspeitamos pode afetar a dinâmica do ciclo de pilha. De fato, após as células knockdown de shot exibiu um atraso mitótico significativo (Figura 1b, atraso de shotrnai), com muitas células prendendo a metafase e nunca em transição para a anaphase durante toda a experiência de imagem de 2-3 horas (Figura 1D, Prisão de ShotRNAi). Nós raciocinamos que este phenotype do atraso/apreensão poderia provavelmente ser devido à ativação do ponto de verificação do conjunto do eixo (isto é o Checkpoint da M-fase). Para testar diretamente esta hipótese, nós cotratamos pilhas com o dsRNA de encontro ao tiro e ao negócio áspero (Rod), um componente importante deste ponto de verificação13. Isto conduziu a uma supressão do phenotype da apreensão, tendo por resultado o NEBD às épocas do anaphase similares ao controle (Figura 1C, shotrnai + rodrnai). Assim, este protocolo de imagem latente vivo permitiu que nós concluam que o tiro é exigido para a progressão oportuna da M-fase e que sua perda conduz à ativação do ponto de verificação que atrasa ou prende pilhas mitotic.

Figure 1
Figura 1: a imagem latente viva revela defeitos do ciclo de pilha devido à ativação mitotic do ponto de verificação em pilhas S2.
Em todas as condições, a imagem latente da vivo-pilha foi conduzida em pilhas S2 cotransfected estàvel com GFP induzível: CID e mcherry: αtubulin como descrito nisto. (A) os desenhos animados ilustram marcos importantes durante a mitose, e as imagens correspondentes são mostradas de filmes representativos de genótipos indicados com pontos temporais relativos a nebd (t = 00:00) indicado. As células de controle normalmente progridem para a anaphase dentro de 20-30 min. as células tratadas com ShotRNAi apresentam retardo de NEBD-anaphase (B) e freqüentemente passam por prisão de metafase, nunca entrando em anaphase no experimento de imagem (D). O cotratamento de células com ShotRNAi e RodRNAi, um componente do ponto de verificação do conjunto do eixo, suprime o fenótipo shot levando à cinética de início da anaphase semelhante às células de controle (C). As setasem (a) indicam as estruturas do centrosome ' estrela-like ', e a grande ponta de seta indica o núcleo. Cada barra de escala representa 5 mícrons. Este número é adaptado e republicado com permissão de10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Vídeo 1: Time-Lapse filme de ' Control ' S2 divisão celular. Vídeo mostra um filme representativo da divisão de células S2 no genótipo ' Control '. Este filme corresponde à Figura 1a. Este vídeo é adaptado e republicado com permissão de10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 2: Time-Lapse filme de atrasada ' ShotRNAi ' S2 divisão celular. O vídeo mostra um filme representativo da divisão celular S2 no genótipo ' ShotRNAi ' que leva a um atraso mitótico fenotípico. Este filme corresponde à Figura 1b. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 3: Time-Lapse filme de ' ShotRNAi + RodRNAi ' S2 Cell Division. Vídeo mostra um filme representativo da divisão de células S2 no genótipo ' ShotRNAi + RodRNAi '. Este filme corresponde à Figura 1C. Este vídeo é adaptado e republicado com permissão de10 (https://www.molbiolcell.org/info-for-authors). Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.

Vídeo 4: Time-Lapse filme de preso ' ShotRNAi ' S2 divisão celular. Vídeo mostra um filme representativo de S2 divisão celular em ' ShotRNAi ' genótipo que leva a uma prisão mitótica fenotípica. Este filme corresponde à Figura 1D. Por favor, clique aqui para baixar este vídeo.

Discussion

Identificando uma célula apropriada

A chave à imagem que divide as pilhas S2 está localizando primeiramente a pilha apropriada. O tempo pode ser desperdiçado células de imagem que são erroneamente pensado para estar pronto para dividir, mas não conseguem fazê-lo em um prazo razoável. As células devem ser identificadas com dois centrosomas distintos e visíveis e um núcleo intacto. Os centrosomes devem ter as fibras do microtubule que emanam delas, dando lhes uma aparência "Star-like". Um núcleo intacto refrata a luz ao ajustar o foco, e também torna o centro aproximado da célula mais escura na aparência. O núcleo também conterá o GFP: CID "dots", outra característica distintiva para ajudar na sua identificação. Células com > 2 centrosomas, tubulina puncta sem fibras tubulina emanando deles, ou células com apenas um centrosome devem ser evitadas. Adicionalmente, se dois centrossomos são visíveis, mas um núcleo não é, nebd tem ocorrido já e a pilha é avançada demasiado distante em sua divisão a ser imaged se uma análise completa da M-fase é desejada. Uma vez que uma célula apropriada é encontrada, a velocidade na imagem inicial é crucial, pois o NEBD ocorre rapidamente (tipicamente dentro de 3-5 min) e atrasar o início da imagem pode levar a oportunidades perdidas. Concentre a célula no software de imagem rapidamente, de forma que ambos os centrômeros estejam visíveis, ou se os centrosomas estiverem fora de plano uns com os outros, defina o ponto focal entre os dois, de forma que cada um possa ser capturado quando as pilhas Z forem coletadas acima e abaixo do centro definido Ponto. Uma vez focado, defina imediatamente o deslocamento entre o palco e a superfície da câmara de células ao vivo usando a verificação de foco infravermelho (se disponível) e inicie o programa de imagem. Embora o protocolo apresentado aqui seja especificamente adaptado para experimentos avaliando a dinâmica NEBD-anaphase, modificações simples poderiam atender os leitores estudando eventos mitóticos alternativos. Para a imagem latente do NEBD-à-metafase e do anaphase-à-telophase, nós sugerimos 10 s intervalos da captação da imagem porque estes processos são altamente dinâmicos e ocorrem rapidamente em pilhas S2 (5-10 minutos). A transição metafase-à-anaphase (nosso foco experimental típico) é um processo mais longo (20-30 min) em pilhas S2, e nós coletamos imagens em intervalos de 30 s. Por fim, a teloftalase através da citocinese ocorre bastante lentamente em células S2, e sugerimos intervalos de 60 s que fornecem resolução suficiente para este processo aproximado de hora.

Mantendo o foco em todo o programa de imagem

Se um dispositivo infravermelho da verificação do foco não está disponível, seja certo evitar colidir o microscópio ou a tabela que se senta em cima, porque este pode conduzir à pilha que move fora do foco durante o programa da imagem latente, conduzindo aos resultados ambíguos, un-interpretable. Pre-Coating os poços vivos da câmara da pilha com poli-L-lysine pode ajudar na adesão da pilha, que pode ajudar a evitar o movimento da pilha e é especial útil para configurações sem verificações infravermelhas do foco. Adicionalmente, as configurações que incluem plataformas de absorção de choque ou as tabelas de ar podem ajudar mais a evitar as pilhas que movem fora do foco. Por fim, alguns programas de software têm funções de pausa que permitem ao usuário refocar e retomar o programa.

Células múltiplas de imagem

Útil para a acumulação de dados é que muitas vezes várias células prontas para dividir podem ser colocadas dentro do mesmo campo de visão para imagem. Isto pode ser especialmente útil para experimentos em que as células têm longas durações de fase M ou prisão prolongada (por exemplo, condições que induzem a ativação do SAC). Para estas células, nós tipicamente imagem até que as células são fotobleached (aproximadamente 2-3 h), mas o tempo completo de células presas deve ser a critério do pesquisador. Às vezes, as múltiplas células de pré-divisão podem estar em diferentes planos focais, caso em que pode ser útil adicionar pilhas z para acomodar todas as células. Adicionar mais pilhas z também pode ajudar a melhorar a resolução. Cuidado deve ser tomado em fazer isso, no entanto, como ele irá expor as células a mais radiação e levar a fotobranqueamento mais rápido, bem como levar a grandes tamanhos de arquivo em dispositivos de armazenamento de disco rígido.

Evitando fotobranqueamento e fototoxicidade

Nosso método descreve configurações específicas para tempos de exposição, intervalos de imagem, pilhas z e transmitância por cento para a nossa fonte de luz LED que geralmente funcionam para a nossa configuração experimental e os resultados desejados. Como microscópios e objetivos experimentais podem variar, o que pode funcionar bem para o nosso sistema pode levar a fotobranqueamento prematuro ou fototoxicidade em outros. Photodamage pode apresentar uma falta do movimento do eixo, da fragmentação do microtubule, da dinâmica defeituosa do microtubule, e da ativação prolongada do ponto de verificação do eixo. Um método potencial para evitar tais armadilhas é limitar o tempo de exposição. A maioria das câmeras modernas agora possuem amplas faixas dinâmicas, e os histogramas podem ser ajustados para visualizar estruturas mesmo em exposições muito baixas. Outra técnica é aumentar o intervalo de imagem (por exemplo, para vários minutos entre as imagens), de forma que o número de vezes que uma célula é exposta à luz sobre um intervalo de coleta total é reduzida. Isto é vantajoso particularmente na imagem latente por uns períodos de tempo mais longos (muitas horas), e pode adicionalmente ajudar em diminuir o tamanho de lima de tais experiências. Limitar o número de pilhas z tomadas também pode ajudar a reduzir a exposição à luz, usando 2 ou mesmo apenas 1 em vez de 3. Além disso, ajustando o percentual de transmitância de luz (para fontes de luz LED), ou utilizando filtros de densidade neutra (ND) (para a lâmpada de halogéneo e fontes de luz LED) diminuirá a intensidade da luz e acoplado com tempos de exposição mais longos pode preservar a visibilidade . Escolhendo as pilhas com os centrossomos separados já, a exposição total pode ser limitada que estas pilhas entram geralmente o mitose rapidamente (dentro de um minuto ou dois) após a imagem latente do começo. Um pode igualmente limitar o tempo que as pilhas podem ser imaged antes de NEBD. Nosso laboratório normalmente define esse tempo em 10 min, mas um limite mais conservador pode ser facilmente imposta pelo usuário. Adicionalmente, uma medida mais ' invasiva ' que recomendamos é o tratamento com dsRNA direcionado contra um componente do SAC (como Rod ou Mad2). Se um fenótipo de detenção é devido a danos celulares não específicos (por exemplo, dinâmica microtúnicas defeituosa), esse tratamento é menos provável de suprimir a prisão em comparação com um efeito bona fide do gene de interesse no experimento original.

Direções futuras

O método descrito aqui pode ser utilizado em um microscópio epifluorescente relativamente simples para rapidamente a imagem de divisões de células ao vivo e pode ser facilmente adaptado para se adequar ao projeto experimental e objetivos específicos de um pesquisador. Diversos métodos excelentes para a cultura, as aproximações do knockdown de RNAi, o transfection transiente, e a microscopia de fluorescência foram publicados para S2 eoutras pilhas9,14,15de Drosophila , 16 anos de , 17. nosso protocolo oferece um par de vantagens. (1) o uso de uma linha celular estável dupla (GFP: CID, mCherry: α-tubulin) simultaneamente marca duas estruturas mitóticas chave, evita o incômodo e as complicações potenciais do transfection transiente, e assegura-se de que quase todas as pilhas expressem marcadores fluorescentes como candidatos potenciais para a imagem latente. (2) a adaptação ao mitose adiciona aos protocolos publicados que examinam a dinâmica cytoesquelética em pilhas motile, não-dividindo e estende a examinar eventos mitotic no tempo real. Embora acreditemos que a nossa é uma técnica poderosa que contribui para o repertório de outros, sempre pode haver melhorias feitas. Uma área particular da divisão celular que temos encontrado difícil de imagem é a divisão centrosome. Isto ocorre antes de NEBD e é difícil determinar quando um único centrosome está pronto para separar em dois. Usando marcadores de ciclo de células fluorescentes (cyclin A e cyclin B) poderia ajudar a resolver esse problema, mas vem à custa de canais que poderiam ser usados para visualizar componentes de divisão celular. Nossa melhor estratégia para a tentativa de visualizar a divisão centrosome é adicionar aquisição multiponto para o programa de imagem (definindo diferentes pontos no plano XY para a imagem), mas isso pode resultar em arquivos grandes, e também pode exigir (dependendo do número de pontos) aumentando o intervalo entre a coleção de imagens, diminuindo a resolução de tempo do filme resultante. Outra solução poderia ser a sincronização de células em um estágio de ciclo celular desejado usando drogas que visam reguladores do ciclo celular seguido de washout subsequente antes da imagem, embora esses métodos podem não ser confiáveis em células S2 especificamente.

O protocolo apresentado aqui fornece uma base para aplicações futuras na imagem latente viva da pilha também. Com a tecnologia melhorada da imagem latente e do software, as adaptações verdadeiramente elevadas da taxa de transferência deste protocolo usando a capacidade mais elevada, placas multi-chambered podiam ser possíveis. Tais inovações fariam telas em grande escala de RNAi, tais como aquelas já alcançadas em preparações fixas12,18, mais tratável em um formato de célula ao vivo. As telas pequenas da droga da molécula podiam igualmente ser imaginado como meios de identificar os compostos novos que alvejam processos da divisão de pilha. A melhoria de fluoróforos e de filtros óticos poderia igualmente conduzir à imagem latente de componentes mitotic múltiplos (não apenas os dois nós descrevemos), permitindo a imagem latente de reguladores mitotic específicos e suas interações com ADN e/ou o eixo. Por exemplo, a geração de células com repórteres fluorescentes que expressam após o dano de DNA ou durante a apoptose seriam ferramentas úteis para identificar novos genes envolvidos nesses processos. As aproximações similares podiam ser usadas para examinar a dinâmica do ciclo de pilha usando a expressão de ciclinas cDNAs etiquetados19.

Disclosures

Os autores não têm nada a declarar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelos institutos nacionais de saúde (R01 GM108756). Estamos gratos a Gary Karpen (Universidade da Califórnia, Berkeley) por generosamente nos fornecer um GFP: CID S2 linha de célula de estoque a partir do qual o nosso GFP: CID/mCherry: αTubulin linha foi gerada10.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Bright-Line Hemacytometer Sigma-Aldrich Z359629-1EA for cell counting
cellSens imaging software Olympus
CELLSTAR Cell Culture Flask, 50 mL, 25 CM2, PS, Red Filter Screw Cap, Clear, Sterile, 10 PCS/BAG Greiner Bio-One 690175
CELLSTAR Cell Culture Multiwell Plate, 6 well, PS, Clear, TC, Lid with condensation rings, sterile, single packed Greiner Bio-One 657160
Centrifuge 5804 R eppendorf Cat. 022623508
Copper(II) sulfate pentahydrate, minimum 98% Sigma-Aldrich C3036-250G
Corning Fetal Bovine Serum Fisher Scientific MT35015CV
Effectene Transfection Reagent 1 mL Qiagen 301425 for transient transfection
IX-83 Inverted Epifluorescent Microscope Olympus
LabTek Chambered Slide Insert Applied Scientific Instruments I-3016
MEGAscript T7 Transcription Kit Thermo Fisher Scientific AM1334 For dsRNA production
MOXI Z Mini Automated Cell Counter Kit ORFLO MXZ001 for cell counting
MS-2000 XY Flat-Top Automated Stage and Controller Applied Scientific Instruments
Nunc Lab-Tek II Chambered Coverglass (no 1.5 borosilicate glass) 8-well Thermo Fisher Scientific 155409
Orca-Flash 4.0 LT Camera Hammamatsu Photonics K.K. C11440-42U
pMT/V5-His A Drosophila Expression Vector Thermo Fisher Scientific V412020
Poly-L-Lysine Cultrex 3438-100-01
Purifier Logic+ Class II, Type A2 Biosafety Cabinets Labconco 302310000
Schneider's insect medium Sigma-Aldrich S0146-100ML
Spectra Tub Centrifuge Tubes VWR 470224-998
Uner Counter BOD Incubator Sheldon manufacturing (VWR) 89409-346
X-CITE 120 LED ExcelitasTechnologies Led light source
Z -Drift Compensator (ZDC) Olympus infrared focus check

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References

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Uso de células de <em>Drosophila</em> S2 para imagens ao vivo da divisão celular
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Dewey, E. B., Parra, A. S., Johnston, C. A. Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division. J. Vis. Exp. (150), e60049, doi:10.3791/60049 (2019).More

Dewey, E. B., Parra, A. S., Johnston, C. A. Use of Drosophila S2 Cells for Live Imaging of Cell Division. J. Vis. Exp. (150), e60049, doi:10.3791/60049 (2019).

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