आयन गतिशीलता-मास स्पेक्ट्रोमेट्री और आणविक मॉडलिंग तकनीक डिजाइन धातु बाध्यकारी पेप्टाइड्स और तांबे बाध्यकारी पेप्टाइड्स methanobactin के चयनात्मक धातु chelating प्रदर्शन की विशेषता कर सकते हैं. धातु chelating पेप्टाइड्स के नए वर्गों का विकास धातु आयन misbalance के साथ जुड़े रोगों के लिए चिकित्सकीय करने के लिए नेतृत्व में मदद मिलेगी.
Electrospray आयनन (ESI) गैस चरण के लिए एक जलीय चरण पेप्टाइड या पेप्टाइड जटिल हस्तांतरण कर सकते हैं, जबकि इसके द्रव्यमान संरक्षण, समग्र प्रभारी, धातु बाध्यकारी बातचीत, और conformational आकार. आयन गतिशीलता-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईएम-एमएस) के साथ ईएसआई युग्मन एक सहायक तकनीक है कि एक पेप्टाइड के बड़े पैमाने पर चार्ज (m/z) और टकराव पार अनुभाग (सीसीएस) है कि अपनी stoichimetry, प्रोटोनेशन राज्य से संबंधित के एक साथ माप के लिए अनुमति देता है प्रदान करता है, और अनुरूपआकार आकार. पेप्टाइड परिसर के समग्र प्रभारी के प्रोटोनेशन द्वारा नियंत्रित किया जाता है 1) पेप्टाइड अम्लीय और बुनियादी साइटों और 2) धातु आयन (ओं) के ऑक्सीकरण राज्य). इसलिए, एक जटिल के समग्र प्रभारी स्थिति पेप्टाइड्स धातु आयन बंधन समानता को प्रभावित करता है कि समाधान के पीएच का एक समारोह है. ईएसआई-आईएम-एमएस विश्लेषण के लिए, पेप्टाइड और धातु आयनों समाधान जलीय केवल समाधान से तैयार कर रहे हैं, पीएच के साथ समायोजित तनु जलीय एसिटिक एसिड या अमोनियम हाइड्रॉक्साइड के साथ समायोजित. यह पीएच निर्भरता और धातु आयन चयनात्मकता के लिए एक विशिष्ट पेप्टाइड के लिए निर्धारित किया जा करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, एक पेप्टाइड परिसर के m/z और सीसीएस B3LYP/LanL2D] आणविक मॉडलिंग के साथ इस्तेमाल किया जा सकता धातु आयन समन्वय और जटिल के तृतीयक संरचना के बाध्यकारी स्थलों को समझने के लिए. परिणाम बताते हैं कि कैसे ईएसआई-आईएम-एमएस वैकल्पिक methanobactin पेप्टाइड्स के एक सेट के चयनात्मक chelating प्रदर्शन की विशेषता और उन्हें तांबे बाध्यकारी पेप्टाइड methanobactin की तुलना कर सकते हैं.
कॉपर और जिंक आयनों जीवों के लिए आवश्यक हैं और ऑक्सीडेटिव संरक्षण, ऊतक विकास, श्वसन, कोलेस्ट्रॉल, ग्लूकोज चयापचय, और जीनोम पढ़ने1सहित प्रक्रियाओं के लिए महत्वपूर्ण हैं। इन कार्यों को सक्षम करने के लिए, Cys के thiolate जैसे समूहों, उसके2के imidazole,3, (अधिक शायद ही कभी) methionine के thioether, और ग्लू और Asp के carboxylate के रूप में धातुओं को शामिल करने के सक्रिय साइटों में cofactors के रूप में धातुएंजाइम। इन समन्वय समूहों की समानता इस बारे में एक पेचीदा प्रश्न उठाती है कि सही कार्यकरण सुनिश्चित करने के लिए उनके और साइस लिगंड्स को चुनिंदा रूप से क्यू (I/II) या n(II) को कैसे शामिल किया जाता है।
चयनात्मक बंधन अक्सर अधिग्रहण और तस्करी पेप्टाइड्स द्वारा पूरा किया जाता है, जो नियंत्रण n(II) या Cu(I/II) आयन सांद्रता4. Cu (I/II) अत्यधिक प्रतिक्रियाशील है और ऑक्सीडेटिव क्षति या एंजाइमों के लिए आकस्मिक बंधन का कारण बनता है, इसलिए इसकी मुक्त एकाग्रता कसकर तांबे chaperones और तांबे विनियमन प्रोटीन है कि यह सुरक्षित रूप से सेल में विभिन्न स्थानों के लिए परिवहन और कसकर द्वारा विनियमित है अपने homeostasis5,6पर नियंत्रण . तांबे के चयापचय या homeostasis के विघटन सीधे Menkes और विल्सन रोग7 के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कैंसर7 और तंत्रिका विकारों, जैसे prion8 और अल्जाइमर रोग9में फंसा हुआ है.
विल्सन की बीमारी आंखों में तांबे के स्तर में वृद्धि के साथ जुड़ा हुआ है, जिगर और मस्तिष्क के वर्गों, जहां Cu (मैं /II) के redox प्रतिक्रियाओं reactive ऑक्सीजन प्रजातियों का उत्पादन, hepatolenticular और तंत्रिका संबंधी अध: पतन के कारण. मौजूदा chelation चिकित्सा छोटे थायोल एमिनो एसिड penicillamine और triethylenetetramine हैं. वैकल्पिक रूप से, methanotrophic तांबा-अधिग्रहण पेप्टाइड्स methanobactin (एमबी)10,11 प्रदर्शन चिकित्सीय क्षमता Cu(I) के लिए अपने उच्च बंधन संबंध की वजह से12. जब मेथिलोसिनस ट्राइकोस्पोरियम ओबी 3 बी से मेथानोबैक्टिन (एमबी-ओबी3बी) विल्सन की बीमारी के एक पशु मॉडल में अध्ययन किया गया था, तांबे कुशलतापूर्वक जिगर से हटा दिया गया था और पित्त13के माध्यम से उत्सर्जित किया गया था। इन विट्रो प्रयोगों में इस बात की पुष्टि की गई है कि एमबी-ओबी3बी यकृत साइटोसोल13में निहित कॉपर धातुलोथीओनिन से तांबे को चीला दे सकता है। लेजर अपक्षरण आगमन आगमनात्मक युग्मित प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री इमेजिंग तकनीक विल्सन रोग जिगर के नमूने में तांबे के स्थानिक वितरण की जांच की है14,15,16 और पता चला है कि एमबी-OB3b तांबे को केवल 8 दिन17की कम उपचार अवधि के साथ हटा देता है .
एमबी-OB3b भी एजी (I), Au(III), Pb(II), Mn(II), सह(II), Fe(II), Ni(II), और n(II)18,19सहित अन्य धातु आयनों के साथ बाध्य करेगा। शारीरिक Cu (I) बाध्यकारी साइट के लिए प्रतियोगिता एजी (I) द्वारा प्रदर्शित किया जाता है क्योंकि यह एमबी-OB3b परिसर से Cu(I) विस्थापित कर सकते हैं, दोनों एजी (I) और Ni(II) के साथ भी एमबी के लिए अपरिवर्तनीय बाध्यकारी दिखा रहा है जो Cu(I)19द्वारा विस्थापित नहीं किया जा सकता है। हाल ही में, 2His-2Cys बाध्यकारी आकृति के साथ वैकल्पिक methanobactin (एम्ब) ओलिगोपेप्टाइड की एक श्रृंखला का अध्ययन किया गया है20,21, और उनके n (II) और Cu (I/II) बाध्यकारी गुण विशेषता. उनकी प्राथमिक एमिनो एसिड दृश्यों समान हैं, और वे सभी 2His-2Cys आकृति, प्रो और एक एसिटाइलेटी एन-टर्मिनस होते हैं। वे मुख्य रूप से एमबी-OB3b से अलग है क्योंकि 2His-2Cys आकृति एमबी-OB3b के दो enethiol oxazolone बाध्यकारी साइटों की जगह.
इलेक्ट्रोस्प्रे आयननीकरण आयन गतिशीलता-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (ईएसआई-आईएम-एमएस) के साथ मिलकर पेप्टाइड्स के धातु-बाध्यकारी गुणों का निर्धारण करने के लिए एक शक्तिशाली वाद्य तकनीक प्रदान करता है क्योंकि यह उनके द्रव्यमान-से-चार्ज के उपाय करता है (m/ अनुप्रस्थ अनुभाग (सीसीएस) जबकि समाधान चरण से उनके द्रव्यमान, प्रभारी, और conformational आकार संरक्षण. m/z और सीसीएस पेप्टाइड्स स्टोइकियोमेट्री, प्रोटोनेशन राज्य, और अनुरूपता आकार से संबंधित हैं। Stoichimetry निर्धारित किया जाता है क्योंकि पहचान और प्रजातियों में मौजूद प्रत्येक तत्व की संख्या स्पष्ट रूप से पहचान की है. पेप्टाइड परिसर के समग्र प्रभारी अम्लीय और बुनियादी साइटों के प्रोटोनेशन राज्य और धातु आयन (ओं) के ऑक्सीकरण राज्य से संबंधित है. सीसीएस पेप्टाइड परिसर के अनुरूप आकार की जानकारी देता है क्योंकि यह घूर्णन औसत आकार को मापता है जो जटिल की तृतीयक संरचना से संबंधित है। परिसर के समग्र प्रभारी राज्य भी पीएच का एक समारोह है और पेप्टाइड धातु आयन बाध्यकारी संबंध को प्रभावित करता है क्योंकि deprotonated बुनियादी या अम्लीय साइटों जैसे carboxyl, उसके, Cys और Tyr भी धातु आयन के लिए संभावित बाध्यकारी साइटों रहे हैं. विश्लेषण के लिए पेप्टाइड और धातु आयन जलीय समाधानों में तैयार किए जाते हैं जिन्हें तनु जलीय एसिटिक एसिड या अमोनियम हाइड्रॉक्साइड द्वारा समायोजित किया जाता है। यह पीएच निर्भरता और धातु आयन चयनात्मकता पेप्टाइड के लिए निर्धारित किया जा करने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, ईएसआई-आईएम-एमएस द्वारा निर्धारित m/z और सीसीएस का उपयोग B3LYP/LanL2D] आणविक मॉडलिंग के साथ किया जा सकता है ताकि परिसर की धातु आयन समन्वय और तृतीयक संरचना के प्रकार की खोज की जा सके। इस लेख में दिखाए गए परिणामों से पता चलता है कि कैसे ESI-IM-MS amb पेप्टाइड्स के एक सेट के चयनात्मक chelating प्रदर्शन की विशेषता और उन्हें तांबे बाध्यकारी पेप्टाइड एमबी-OB3b के लिए तुलना कर सकते हैं.
महत्वपूर्ण कदम: ईएसआई-आईएम-एमएस के माध्यम से परीक्षा के लिए समाधान चरण व्यवहार का संरक्षण
देशी ईएसआई वाद्य सेटिंग्स का उपयोग किया जाना चाहिए जो पेप्टाइड्स स्टोइकियोमिति, चार्ज राज्य, और अनुरू?…
The authors have nothing to disclose.
यह सामग्री 1764436 के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित काम पर आधारित है, NSF साधन समर्थन (MRI-0821247), वेल्च फाउंडेशन (टी-0014), और ऊर्जा विभाग से कंप्यूटिंग संसाधनों (TX-W-20090427-0004-50) और L3 संचार . हम कैलिफोर्निया विश्वविद्यालय के Bower समूह धन्यवाद – सांता बारबरा सिग्मा कार्यक्रम और Ayobami Ilesanmi वीडियो में तकनीक का प्रदर्शन करने के लिए साझा करने के लिए.
acetonitrile HPLC-grade | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A998SK-4 | |
ammonium hydroxide (trace metal grade) | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A512-P500 | |
cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 255599-5G | |
copper(II) chloride 99.999% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 203149-10G | |
copper(II) nitrate hydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 229636-5G | |
designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides | Neo BioLab (neobiolab.com) | designed peptides were synthized by order | |
designed amb5B,C,D,E,F peptides | PepmicCo (www.pepmic.com) | designed peptides were synthized by order | |
Driftscope 2.1 software program | Waters (www.waters.com) | software analysis program | |
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lead(II) nitrate ACS grade | Avantor (www.avantormaterials.com) | 128545-50G | |
manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 203734-5G | |
MassLynx 4.1 | Waters (www.waters.com) | software analysis program | |
nickel chloride hexahydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 203866-5G | |
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silver nitrate 99.9%+ | Alfa Aesar (www.alfa.com) | 11414-06 | |
Waters Synapt G1 HDMS | Waters (www.waters.com) | quadrupole – ion mobility- time-of-flight mass spectrometer | |
zinc chloride anhydrous | Alfa Aesar (www.alfa.com) | A16281 |