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Chemistry

Técnicas de espectrometria de massa de mobilidade de íons para determinação da estrutura e mecanismos de reconhecimento de íons metálicos e atividade redox de oligopeptídeos de ligação metálica

Published: September 7, 2019 doi: 10.3791/60102
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Chemistry, Texas A&M University-Commerce

Summary

A mobilidade do íon-espectrometria maciça e as técnicas de modelagem molecular podem caracterizar o desempenho quelante do metal seletivo de peptídeos metal-obrigatórios projetados e do methanobactin Copper-Binding do peptide. O desenvolvimento de novas classes de peptídeos quelantes metálicos ajudará a levar a terapêutica para doenças associadas ao desbalanceamento de íons metálicos.

Abstract

A ionização por electrospray (ESI) pode transferir um peptídeo de fase aquosa ou peptídeo complexo para a fase gasosa, conservando sua massa, carga global, interações de ligação metálica e forma conformacional. O acoplamento ESI com a espectrometria de massa da mobilidade do íon (im-MS) fornece uma técnica instrumental que permita a medida simultânea da massa-à-carga de um peptide (m/z) e da seção transversal da colisão (CCS) que se relacionam a sua estequiometria, estado do protonação, e forma conformacional. A carga geral de um complexo peptídeo é controlada pela protonação de 1) os sítios ácidos e básicos do peptídeo e 2) o estado de oxidação do íon metálico (s). Portanto, o estado de carga geral de um complexo é uma função do pH da solução que afeta a afinidade de ligação de íons metálicos de peptídeos. Para as análises de ESI-IM-MS, as soluções de peptídeos e íons metálicos são preparadas a partir de soluções somente aquosas, com o pH ajustado com ácido acético aquoso diluído ou hidróxido de amônio. Isso permite que a dependência de pH e a seletividade de íons metálicos sejam determinadas para um peptídeo específico. Além disso, o m/z e o CCS de um complexo do peptide podem ser usados com modelagem molecular de B3LYP/LanL2DZ para discernir locais obrigatórios da coordenação do íon do metal e da estrutura terciária do complexo. Os resultados mostram como o ESI-IM-MS pode caracterizar o desempenho quelante seletivo de um conjunto de peptídeos de metanobacttina alternativos e compará-los com o peptídeo de ligação de cobre methanobactin.

Introduction

Os íons de cobre e zinco são essenciais para os organismos vivos e cruciais para os processos, incluindo proteção oxidativa, crescimento tecidual, respiração, colesterol, metabolismo da glicose e leitura do genoma1. Para habilitar essas funções, grupos como o tiolato de Cys, imidazol de his2,3, (mais raramente) thioether de metionina, e carboxilato de Glu e ASP seletivamente incorporar metais como cofatores para os locais ativos de metaloenzimas. A similaridade destes grupos de coordenação levanta uma pergunta intrigante a respeito de como os ligantes his e de Cys incorporam seletivamente tanto o UC (I/II) ou o Zn (II) para assegurar o funcionamento correto.

A ligação seletiva é muitas vezes realizada por peptídeos de aquisição e tráfico, que controlam as concentrações de íons Zn (II) ou UC (I/II)4. O UC (I/II) é altamente reactivo e causa dano oxidativo ou ligação adventícia às enzimas, assim que sua concentração livre é regulada firmemente por chaperonas de cobre e por proteínas de regulação de cobre que o transportam com segurança aos vários locais na pilha e firmemente controle sua homeostase5,6. O rompimento do metabolismo ou da homeostase de cobre é implicado diretamente em Menkes e Wilson ' doença de s7 assim como cancros7 e desordens neural, tais como do prião8 e doença de Alzheimer9.

A doença de Wilson está associada ao aumento dos níveis de cobre nos olhos, fígado e seções do cérebro, onde as reações redox do UC (I/II) produzem espécies reativas de oxigênio, causando degeneração hepatolenticular e neurológica. As terapias existentes da quelação são o aminoácido penicilamina pequeno do tiol e o triethylenetetramine. Alternativamente, os peptídeos de aquisição de cobre metanotróficos methanobactin (MB)10,11exibem potencial terapêutico por causa de sua alta afinidade de ligação para o UC (I)12. Quando o methanobactin (MB-OB3b) do Methylosinus trichosporium OB3b foi estudado em um modelo animal de Wilson ' a doença de s, cobre foi removida eficientemente do fígado e excretada através da bilis13. Experimentos in vitro confirmaram que o MB-OB3b poderia quelato o cobre da metalotionina de cobre contida no citosol do fígado13. A ablação por laser indutivamente acoplada a espectrometria de massas de massa plasmática investigou a distribuição espacial do cobre nas amostras de fígado da doença de Wilson14,15,16e demonstrou que a MB-OB3b Remove o cobre com curtos períodos de tratamento de apenas 8 dias17.

O MB-OB3b também se associará a outros íons metálicos, incluindo AG (I), au (III), PB (II), MN (II), co (II), FE (II), Ni (II) e Zn (II)18,19. O concurso para o sítio de ligação de UC (I) fisiológico é exibido pela AG (I) porque pode deslocar o UC (I) do complexo MB-OB3b, com AG (I) e Ni (II) também mostrando ligação irreversível a MB que não pode ser deslocada pelo UC (I)19. Recentemente, uma série de oligopeptídeos alternativos de methanobactin (AMB) com o motivo de ligação 2his-2cys foram estudados20,21, e suas propriedades de ligação Zn (II) e UC (I/II) caracterizadas. Suas seqüências de aminoácidos primários são semelhantes, e todos eles contêm o motivo 2His-2Cys, pro e um N-Terminus acetilado. Eles diferem principalmente de MB-OB3b porque o motivo 2His-2Cys substitui os dois locais de ligação de oxazolona enethiol de MB-OB3b.

A ionização de electrospray acoplada com a espectrometria da mobilidade-massa do íon (ESI-IM-MS) fornece para uma técnica instrumental poderosa para determinar as propriedades metal-obrigatórias dos peptídeos porque mede sua massa-à-carga (m/z) e colisão seção transversal (CCS) ao conservar sua massa, carga, e forma conformacional da solução-fase. O m/z e CCS referem-se à estequiometria de peptídeos, estado de protonação e forma conformacional. A estequiometria é determinada porque a identidade e o número de cada elemento presente na espécie são explicitamente identificados. A carga geral do complexo peptídeo relaciona-se com o estado de protonação dos sítios ácidos e básicos e o estado de oxidação do íon metálico (s). O CCS dá a informação da forma conformacional do complexo do peptide porque mede o tamanho médio rotatório que se relaciona à estrutura terciária do complexo. O estado de carga geral do complexo também é uma função do pH e afeta a afinidade de ligação de íons metálicos do peptídeo porque os locais de base ou ácidos desprotonados como o carboxilo, his, Cys e Tyr também são os locais de ligação potenciais para o íon metálico. Para as análises, o peptídeo e o íon metálico são preparados em soluções aquosas com o pH ajustado por diluir o ácido acético aquoso ou hidróxido de amônio. Isso permite que a dependência de pH e a seletividade de íons metálicos sejam determinadas para o peptídeo. Além disso, o m/z e o CCS determinados por ESI-im-MS podem ser usados com modelagem molecular de B3LYP/LanL2DZ para descobrir o tipo de coordenação do íon do metal e a estrutura terciária do complexo. Os resultados apresentados neste artigo revelam como o ESI-IM-MS pode caracterizar o desempenho quelante seletivo de um conjunto de peptídeos AMB e compará-los com o peptídeo de ligação de cobre MB-OB3b.

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Protocol

1. preparação dos reagentes

  1. Cultura methylosinus trichosporium OB3b, isolar a UC (I)-livre MB-OB3b18,22,23, congelar-secar a amostra e armazenar em-80 ° c até o uso.
  2. Sintetizar os peptídeos AMB (> 98% de pureza para AMB1, AMB2, AMB4; > 70% de pureza para AMB7), congelar-secar as amostras, e armazená-los em-80 ° c até o uso.
  3. Comprar > 98% pureza manganês (II) cloreto, cobalto (II) cloreto, niquelar (II) cloreto, cobre (II) cloreto, cobre (II) nitrato, prata (I) nitrato, zinco (II) cloreto, ferro (III) cloreto e chumbo (II) cloreto.
  4. Adquira os polímeros poli-DL-alanina utilizados como calibrantes para medir as secções transversais de colisão das espécies AMB e HPLC ou hidróxido de amónio superior, ácido acético glacial e acetonitrila.

2. preparação da solução de ações

  1. Solução de peptídeos
    1. Pesar com precisão, usando pelo menos três figuras significativas, a massa de 10,0 – 20,0 mg do MB-OB3b ou AMB em um frasco de 1,7 mL de plástico.
      Nota: a massa pesada deve produzir 12,5 mM ou 1,25 mM, dependendo da solubilidade do peptídeo, quando se acrescenta 1, 0 mL de água desionizada (DI).
    2. Usando um Pipet, adicione 1, 0 mL de água deionizada (> 17,8 MΩ cm) à amostra de peptídeo pesado para produzir a solução de 12,5 mM ou 1,25 mM. Coloc firmemente a tampa e misture-a completamente com pelo menos 20 Inversions.
    3. A utilização de um micropipetas dispensa 50,0 μL de alíquotas da amostra de peptídeos em frascos de 1,5 mL rotulados individualmente e armazená-los a-80 ° c até o uso.
  2. Soluções de estoque de íons metálicos
    1. Pesar com precisão, usando pelo menos três figuras significativas, a massa de 10,0 – 30,0 mg do cloreto de metal ou nitrato de prata em um frasco de 1,7 mL.
      Nota: a massa pesada deve produzir 125 mM quando 1, 0 mL de água DI é adicionado.
    2. Adicione o 1, 0 mL de água DI à amostra de metal pesado no frasco para injetáveis de 1,7 mL para produzir a solução de 125 mM. Coloc firmemente a tampa e misture-a completamente com pelo menos 20 Inversions.
  3. Soluções de hidróxido de amónio: preparar uma solução de ácido acético a 1,0 M diluindo 57 μl da solução de ácido acético a 99,5% com água di para um volume final de 1, 0 ml. Prepare uma solução de hidróxido de amónio de 1,0 M diluindo 90 μL da solução de hidróxido de amónio a 21% com água DI para um volume final de 1, 0 mL. Faça duas diluições sucessivas de cada solução, tomando 100 μL das soluções 1,0 M para preparar as soluções de ácido acético 0,10 M e 0, 10 M e hidróxido de amônio.
  4. Solução de estoque de poli-DL-alanina: Prepare a poli-DL-alanina (PA) pesando 1,0 mg de PA e dissolvendo em 1,0 ml de água di para dar 1.000 ppm. Homogeneizar. Usando um micropipet, dispense 50,0 μL de alíquotas e coloque cada um em um frasco para injetáveis de 1,7 mL e armazene a-80 ° c.

3. a mobilidade do electrospray-íon-análise da espectrometria maciça

  1. Limpe o tubo de entrada ESI e a agulha capilar cuidadosamente com cerca de 500 μL de ácido acético glacial de 0,1 M, hidróxido de amônio de 0,1 M e, finalmente, água DI.
  2. Descongelar uma alíquota de 50,0 μL da solução de estoque de PA 1.000 ppm e dilui-la com 450 μL de água DI para dar um PA de 100 ppm. Pipet 100,0 μL desta solução e dilui-lo para 1, 0 mL com 500 μL de água DI e 500 μL de acetonitrila para dar solução de PA de 10 ppm.
  3. Colete os espectros de IM-MS de íons negativos e positivos da solução de PA de 10 ppm por 10 min cada um usando as condições de ESI-IM-MS nativas, conforme descrito na seção de discussão.
  4. Descongelar uma alíquota de 50,0 μL da solução de estoque de 12,5 mM ou 1,25 mM AMB e fazer diluições sucessivas com água DI para dar uma concentração final de 0,125 mM amb. Misture cuidadosamente cada diluição.
  5. Pipet 100,0 μL da solução de iões de metal de 125 mM, coloque num frasco para injetáveis de 1,7 mL e diluir para 1, 0 mL com água DI para dar um íon metálico de 12,5 mM. Repita com duas diluições sucessivas para dar uma concentração final de íons metálicos de 0,125 mM. Misture cuidadosamente cada diluição.
  6. Pipet 200,0 μL de 0,125 mM AMB num frasco para injetáveis de 1,7 mL, diluir com 500 μL de água DI e misturar a solução completamente.
  7. Ajuste o pH da amostra para 3,0 adicionando 50 μL de solução de ácido acético a 1,0 M.
  8. Adicionar 200,0 μL do íon metálico de 0,125 mM à amostra ajustada por pH. Adicione a água de DI para produzir um volume final de 1, 0 mL da amostra, misture completamente, e permita que a amostra equilibe por 10 minutos em RT.
  9. Usando uma seringa sem corte do nariz Tome 500 μL da amostra e colete os espectros negativos e positivos do íon ES-IM-MS por 5 minutos cada um. Use o restante 500 μL da amostra para registrar seu pH final usando um micro eletrodo calibrado de pH.
  10. Repita as etapas 3.6 – 3.9, enquanto modifica a etapa 3,7 para ajustar o pH para 4,0, 5,0, 6,0, 7,0, 8,0, 9,0 ou 10,0 adicionando novos volumes das soluções de hidróxido de amónio ou de ácido acético 0, 10 m, 0,10 M ou 1,0 M.
  11. Colete os espectros negativos e positivos do íon ESI-IM-MS da solução de PA de 10 ppm por 10 min cada.

4. preparação da titulação de íons metálicos de amostras AMB

  1. Siga as etapas descritas nas etapas 3.1 – 3.5.
  2. Pipet 200,0 μL de 0,125 mM AMB num frasco para injetáveis de 1,7 mL, diluir com 500,0 μL de água DI e misturar a solução completamente.
  3. Ajuste o pH da amostra para pH = 9,0 adicionando 80 μL da solução de hidróxido de amônio de 0, 10 M.
  4. Adicione 28 μL da solução do íon do metal de 0,125 milímetros para dar 0,14 equivalentes do molar do íon do metal, adicionam a água do DI para fazer o volume final da amostra 1, 0 mL, misturam-se completamente, e permitem que a amostra equilibe por 10 minutos em RT.
  5. Usando uma seringa sem corte do nariz Tome 500 μL da amostra e colete os espectros negativos e positivos do íon ESI-IM-MS por 5 minutos cada um. Use o restante 500 μL da amostra para registrar seu pH final usando um micro eletrodo calibrado de pH.
  6. Repita as etapas 4.2 – 4.5, enquanto modifica a etapa 4,3 para adicionar um volume apropriado da solução de íons metálicos de 0,125 mM para dar 0,28, 0,42, 0,56, 0,70, 0,84, 0,98, 1,12, 1,26 ou 1,40 equivalentes molar.
  7. Colete os espectros negativos e positivos do íon IM-MS da solução do PA de 10 ppm por 10 minutos cada um.

5. análise dos dados de titulação de pH ESI-IM-MS

  1. A partir dos espectros IM-MS identificam quais espécies carregadas de ambs estão presentes combinando-as com seus padrões teóricos de isótopos m/z.
    1. Abra o MassLynx e clique em cromatograma para abrir a janela cromatograma.
    2. Vá para o menu arquivo e abra para localizar e abra o arquivo de dados im-MS.
    3. Extraia o espectro de IM-MS clicando com o botão direito do mouse e arrastando através do cromatograma e liberando. A janela do espectro abrirá mostrando o espectro IM-MS.
    4. Na janela de espectro, clique em ferramentas e modelo isotópica. Na janela de modelagem de isótopos, insira a fórmula molecular da espécie AMB, marque a caixa de íon carregada show e insira o estado da carga. Clique em OK.
    5. Repita para identificar todas as espécies no espectro IM-MS e gravar a sua gama de isótopos m/z.
  2. Para cada espécie AMB, separe qualquer espécie de m/z coincidente e extraia suas distribuições de tempo de chegada (ATD) usando seus padrões de isótopos m/z para identificá-los.
    1. Em MassLynx clique em Driftscope para abrir o programa. Em DriftScope clique em arquivo e abrir para localizar e abrir o arquivo de dados im-MS.
    2. Use o mouse e clique com o botão esquerdo para ampliar o padrão de isótopos m/z da espécie amb.
    3. Use a ferramenta de seleção e o botão esquerdo do mouse para selecionar o padrão de isótopos. Clique no botão aceitar seleção atual .
    4. Para separar qualquer espécie de m/z coincidente use a ferramenta de seleção e o botão esquerdo do mouse para selecionar o tempo de ATD alinhado com o padrão isotópico da espécie amb. Clique no botão aceitar seleção atual .
    5. Para exportar o ATD, vá para arquivo | Exportar para MassLynx, em seguida, selecione reter tempo de deriva e salvar o arquivo na pasta apropriada.
  3. Determine o centroide do ATD e integre a área a curva ATD como uma medida da população de espécies.
    1. Na janela cromatograma do MassLynx, abra o arquivo exportado salvo. Clique em processo | Integre a partir do menu. Verifique a caixa de integração de pico de ApexTrack e clique em OK.
    2. Registre o centroide ATD(t a) e a área integrada, conforme mostrado na janela do cromatograma . Repita para todos os arquivos de dados salvos AMB e PA IM-MS.
  4. Use o ATD integrado para todas as espécies de AMB extraídas de íons positivos ou negativos em cada ponto de titulação para normalizar a uma escala de porcentagem relativa.
    1. Insira as identidades das espécies AMB e seu ATD integrado em cada pH em uma planilha.
    2. Para cada pH, use a soma dos ATDs integrados para normalizar o ATD do AMB individual para uma escala percentual.
    3. Plotar as intensidades percentuais de cada espécie AMB versus pH em um gráfico para mostrar como a população de cada espécie varia em função do pH.

6. secções transversais de colisão

  1. Usando uma planilha, converta o CCSS (ω) de PA negativa25,26 e positivo27 íons medidos em ele gás tampão28 para corrigido CCS (ωc) usando a equação 1 abaixo, onde: z = carga de íons; e carga de c = Electron (1.602 × 10-19 c); m N 2 = massa de N2 gás (da); e mIon = Ion massa. 29. º

Equation 1

  1. Converta os tempos médios de chegada (ta) das calibrantes PA e das espécies AMB em tempos de deriva (tD) usando a equação 2 abaixo, onde: c = o coeficiente de retardo do ciclo de trabalho aprimorado (1,41) e m/z é a massa-a-carga do íon peptídeo.

Equation 2

  1. Plotar os calibrantes PA ' tD vs. seus Ωc. Em seguida, usando um ajuste de regressão de mínimos quadrados da equação 3 mostrada abaixo, determine os valores a ' e B, onde: a ' é a correção para os parâmetros de temperatura, pressão e campo elétrico; e B compensa o efeito não linear do dispositivo IM.

Equation 3

  1. Usando esses valores A ' e B eo valor de t de centroide do ATD dos ambs determinam seus ωc usando a equação 3 e seus ω usando a equação 1. Este método fornece CCSS para as espécies de peptídeos com erros absolutos estimados de cerca de 2%25,26,27.

7. métodos computacionais

  1. Use o nível B3LYP/LanL2DZ da teoria, compreendendo dos funcionais híbridos do Becke 3-parâmetro30 e a base de advertência ajustou31 e os potenciais do núcleo de elétron32,33,34 para encontrar conformadores otimizados em geometria para todos os tipos possíveis de coordenações da espécie m/z amb observada35.
    Observação: para obter detalhes sobre como compilar e enviar cálculos, consulte o uso de GaussView no arquivo suplementar.
  2. Compare a energia livre prevista de cada um dos conformadores e calcule seus CCSs teóricos usando o método Lennard-Jones (LJ) em escala de íons do programa Sigma36.
  3. A partir dos mais baixos conformadores de energia livre determinar qual conformer exibe o LJ CCS que concorda com o IM-MS medido CCS para identificar a estrutura terciária e tipo de coordenação para os conformadores observados no experimento.

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Representative Results

Emperramento do metal de AMB1
O estudo IM-MS20 da AMB1 (Figura 1a) mostrou que os íons cobre e zinco vinculados à AMB1 de forma dependente do pH (Figura 2). No entanto, cobre e zinco vinculados à AMB1 através de diferentes mecanismos de reação em diferentes locais de coordenação. Por exemplo, a adição de UC (II) a AMB1 resultou na oxidação da AMB1 (AMB1ox) pela formação de pontes de dissulfeto, e em um pH de > 6, formou-se o íon [AMB1OX− 3h + UC (II)]− (Figura 2a). Isto indicou o deprotonação de dois imidazoliums, grupo carboxyl, e dois locais adicionais que coordenaram o UC (II).

A modelagem molecular do íon [AMB1ox− 3h + UC (II)]− utilizando B3LYP/LanL2DZ determinou que o menor complexo energético foi o UC (II) coordenado via imidazol Δn de his1 e os nitrogênios desprotonados dos grupos de Amida da espinha dorsal de Cys2 e Gly3. No entanto, abaixo de um pH de 6, a adição de UC (II) à AMB1 formou um padrão isotópico m/z que só poderia ser contabilizado pela Associação de UC (i), formando o [AMB1ox+ UC (i)]+ Ion (Figura 2B). Por outro lado, um pH maior que 6 causou o padrão isotópico m/z para diminuir 1 m/z, contabilizado pela carga positiva [AMB1ox− H + UC (II)]+ íon. A adição de Zn (II) não oxidou o AMB1, e a associação de Zn (II) foi observada em um pH de >,6, formando principalmente o íon [AMB1− 3h + Zn (II)]− (Figura 2C). Isto indicou o deprotonação dos grupos dos imidazoliums, do Thiol, e do carboxyl. A modelagem molecular do íon [AMB1-3h + Zn (II)]− determinou que os menores conformadores de energia fossem a coordenação tetraédrica de Zn (II) via 2his-2Cys ou his-2cys e o carboxilato do C-Terminus.

Ligação múltipla de UC (I) de AMB2
As reações redox entre a UC (II) e a AMB2 (Figura 1B) resultaram em associação de UC (I). Este foi estudado mais detalhadamente utilizando IM-MS, espectrofotometria UV-VIS e modelagem molecular B3LYP37. Os principais produtos da titulação de AMB2 em um pH de 5 foram a oxidação de AMB2 (através da formação de pontes de dissulfeto) e as espécies não oxidadas AMB2 coordenando três íons de UC (I).

Uma pesquisa utilizando o método B3LYP/LanL2DZ localizou dois complexos de baixa energia que disputam a espécie coordenada 3Uc (I). O primeiro foi o complexo mostrado na Figura 3a, onde os íons 3uc (I) foram coordenados por meio dos grupos de tiolato de ponte38 de Cys2 e Cys6 (de seu1), bem como Δn1 e Δn5 (de seus5 ). O segundo complexo (3c) tem uma ponte de sal entre o protonados seu grupo de1 lado e grupo do carboxilato do C-terminal. Estes resultados sugerem que, em um pH de 3,0 – 6,0, o principal AMB2+ 3uc (I) complexo é a estrutura com ponte de sal, que pode ser transferida com sucesso de solução para fase gasosa com apenas um rearranjo estrutural mínimo.

O teórico LJ CCS de 209 ± 6 Å2, calculado utilizando o programa Sigma36 para o complexo 3C, concordou com o im-MS medido CCS, indicando que 3C representa [AMB2− 2h + 3uc (I)]+ conformação em pH 3,0-6,0. Entretanto, em um pH de >,6, este complexo não foi observado por im-MS, provavelmente porque um deprotonação mais adicional de his1 (pKa= 6,0) conduz a um complexo neutro total. Uma vez que o grupo de imidazóleo de seu1 é deprotonated, 3uc (I) a coordenação pode converter-se aos grupos heme da ponte de Cys2 e de Cys6 as well as Δn1 e Δn5 de his1 e seu5, respectivamente (3a).

A dependência de pH da atividade de ligação e redox AMB4 UC (I/II)
As técnicas de im-MS e B3LYP têm sido utilizadas para investigar as titulações de UC (II) e pH de AMB4 (Figura 1C) e os complexos de monômero, dímero, trímero e tetrâmero identificados de AMB4 contendo até três íons (I) ou dois UC (II ) para cada subunidade de monômero39. Os complexos também continham vários números de pontes de dissulfeto, e esses produtos foram produzidos se ou não as reações de UC (II) com AMB4 foram conduzidas em soluções aquosas anaeróbias ou aeróbias.

Utilizando-se a técnica de IM-MS, verificou-se que essas espécies individuais poderiam ser separadas e quantificadas mesmo que tivessem padrões isotópicos sobrepostos devido às diferenças no tempo de chegada (Figura 4). A identificação e quantificação dessas espécies intimamente relacionadas é uma tarefa que nenhuma outra técnica instrumental ou analítica pode alcançar. Estes estudos de im-MS fornecem a introspecção considerável nas reações redox pH-dependentes e identificaram exatamente os números de pontes do dissulfeto inter-ou intra-molecular, o número de íons do UC (I) ou do UC (II), e o número de locais do deprotonação em cada um dos complexos ( Figura 5).

Além disso, a mensuração dos complexos CCS também permitiu a determinação de cada uma das espécies individuais de tamanho conformacional, que foi utilizada com uma extensa pesquisa B3LYP/LanL2DZ para localizar conformadores com estruturas que concordaram tanto com a correta molecular estequiometria e CCS medidos por IM-MS. Através desse método, identificou-se a coordenação de UC (I/II) dos diversos complexos. As reações entre a UC (II) e a AMB4 incluíram a formação de dímeros, trimers e tetrâmeros coordenando tanto a UC (I) quanto a UC (II), dependendo do pH da solução.

Por exemplo, em soluções que eram levemente ácidas (pH = 3,0 – 6,0), eles principalmente amarraram íons de UC (I) e foram não oxidados, enquanto que em soluções que eram levemente básicas (pH = 8,0 – 11,0), eles principalmente amarraram íons de UC (II) e foram oxidados por todos os Cys formando dissulfeto títulos (Figura 6). O B3LYP/LanL2DZ determinou que os íons de UC (I) eram lineares e foram interligados pelos grupos tiolato e imidazol, enquanto os íons de UC (II) foram quelados por meio de geometrias planas em forma de T ou quadrada distorcidas por um imidazol, bem como os nitrogênios desprotonados da espinha dorsal de grupos de Amida.

Análise de IM-MS de MB-OB3b
Os estudos de im-MS 19,40 de MB-OB3b (Figura 1D) mostraram que na fase de gás, o MB-OB3b livre de UC (I) existe como três espécies carregadas negativamente: [MB-OB3b – H]–, [MB-OB3b – 2h]2 –, e [MB-OB3b – 3h] 3 –, consistente com o comportamento esperado da fase da solução. As titulações individuais do íon do metal foram executadas19 para determinar a seletividade do íon do metal de MB-OB3b. A Figura 7 mostra os resultados das titulações de íons metálicos selecionados e mostra que a selectividade de ligação aparente do MB-OB3b pode ser categorizada como três grandes grupos: 1) UC (i) e AG (i); 2) Ni (II), Zn (II) e co (II); e 3) Pb (II), FE (II) e Mn (II). Esta ordem de seletividade vinculativa mostrou-se em concordância geral com a encontrada por experimentos de têmpera por fluorescência19 e calorimetria de Titulação Isotérmica18.

Comparação de MB-OB3b e AMB 7 anos de selectividade de encadernação metálica
A seletividade de ligação aparente de MB-OB3b foi comparada com a seletividade de ligação da AMB7 a um pH de 7. O AMB7 foi projetado com a mesma seqüência de aminoácidos como MB-OB3b, mas com os dois grupos de oxazolona enethiol substituídos por dois grupos his-Cys. O AMB7 (Figura 1e) tem uma única ligação dissulfeto entre Cys6 e Cys12. Os resultados da formação de complexos de carga negativa (Figura 8) mostraram que a AMB7 preferiu a seletividade vinculativa para Ni (II) e Zn (II) (60%), seguida de co (II) e PB (II) (40%). Além disso, houve cerca de 20% de vinculação de UC (II). Havia qualquer traço ou nenhum enlace de AMB7 do AG (I), do MN (II), ou do FE (II). Isso comparado com a seletividade de vinculação preferencial de MB-OB3b's de mais de 90% para a vinculação de UC (I) e AG (I).

Figure 1
Figura 1: estruturas primárias dos peptídeos alternativos de methanobactina (AMB) e methanobactin (MB-OB3b). (A) acetil-seu1-Cys2-Gly3-pro4-his5-Cys6 (AMB1); (B) acetil-seu1-Cys2-Tyr3-pro4-his5-Cys6 (AMB2); (C) acetil-seu1-Cys2-Gly3-ser4-Tyr5-pro6-his7-Cys8-ser9 (AMB4); (D) 1-(N-[mercapto-(5-oxo-2-(3-metilbutanoil) Oxazol-(Z) -4-ylidene) metil]-Gly1– ser2– Cys3– Tyr4)-pirrolidin-2-yl-(mercapto-[5-oxo-Oxazol-(Z) -4-ylidene] metil) – ser5 – Cys6– Met7 (MB-OB3b); e (e) acetil-leu1-seu2-Cys3-Gly4-ser5-Cys6-Tyr7-pro8-his9-Cys10-ser11-Cys12-Met 13 (AMB7). Sombreamento mostra o: 2His-2Cys ou enethiol-oxazolone Binding sites (Icon); dobradiças de prolina ou pirrolidinaIcon(); grupo acetil ou metilbutanol N-Terminus (Icon); e tirosina, que pode estabilizar a coordenação do íon metálico através de uma segunda interação do Shell de solvataçãoIconπ – cation (). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: intensidades relativas médias do methanobactin alternativo (AMB1) acetil-seu1-Cys2-Gly3-pro4-his5-Cys6 e metal-limite complexo (AMB1+X) (onde X = UC ou Zn). As observações foram feitas durante análises de espectrometria de massa do íon negativo e positivo da solução da relação do molar 1:1 de AMB:XCL2 sobre a escala do pH de 3.0 – 11.0. As barras de erro mostram desvios padrão dos meios da intensidade relativa e do pH de três experimentos de titulação de pH replicam. A solução 1:1 molar de AMB: o cubo2 resultou na oxidação de AMB (AMBOx) com Cys2 e Cys6, formando uma ponte de dissulfeto. (A) análise do íon negativo de AMB:2 mostrando o [AMBOx− H]− e [AMBOx− 3h + UC (II)]−. (B) análise de íons positivos de AMB:2 mostrando [AMBOx]+ e [AMBOx+ UC (I/II)]+; o estado de oxidação do UC no complexo foi dependente do pH, sendo [AMBOx+ UC (I)]+;  abaixo de um pH de 8 e [AMBOx− H + UC (II)]+; acima de um pH de 8. (C) análise de íons negativos da AMB: ZnCl2 mostrando [AMB]n − e [AMB + Zn (II)]n −. (D) análise do íon positivo de AMB: ZnCl2 mostrando [AMB]n + e [AMB + Zn (II)]n +. Este número foi adaptado de uma publicação anterior20. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: estruturas propostas de [AMB2+ 3uc (I)]+ utilizando as mais baixas estruturas de energia e geometria otimizadas localizadas a partir do nível de teoria B3LYP/LanL2DZ. (A) 3 c (I) coordenação via Δn1Δn5 de his1 e His5 e heme que Bridging grupos heme de Cys2 e de Cys6 com uma seção transversal teórica de 217 ± 6 Å2. (B) ilustração da coordenação do Δn1Δn5 e do heme. (C) estrutura em ponte de sal que mostra a coordenação de 3 UC (I) através do terminal do carboxilato (CYS6), do Δn5, e do heme que Bridging com uma seção transversal teórica de 209 ± 6 Å2. (D) ilustração do terminal de carboxilato, Δn5e coordenação de ponte tiolada. As distâncias de ligação A, B, C, D, e e F são mostradas na unidade de Å. Este número foi adaptado de uma publicação anterior37. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: análise de IM-MS de produtos da mistura 1:1 de AMB4: UC (II) em pH = 4,4.  (A) padrões isotópicos extraídos para o [AMB4− 2h + 3uc (i)] +, [Diamb4− 4h + 6uc (i)]2 +, [triamb4− 6h + 9uc (i)]3 + e [tetraamb4− 8h + 12uc (i)]4 + espécies. (B) integração dos tempos de chegada extraídos de [AMB4− 2h + 3uc (i)]+, [Diamb4− 4h + 6uc (i)]2 +, [triamb4− 6h + 9uc (i)]3 + e [tetraamb4− 8h + 12uc (i)]4 + foram utilizados para calcular suas intensidades relativas. Para calcular a porcentagem de intensidades relativas, a somatória da área integrada para todas as espécies extraídas para cada ponto de titulação foi utilizada para normalizar a escala percentual. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 5
Figura 5: alteração do padrão isotópico para o n isoladamente (I/II) vinculado AMB4 observado durante a titulação de pH de equivalentes molares de UC (II): AMB4 em ph = 4, 4, 6, 2 e 9,98. No pH = 4, 4, o resultado experimental corresponde principalmente ao modelo isotópico para [AMB4+ UC (I)]+. No pH = 6, 2, há uma mudança de-2 m/z, significando a formação da ponte de dissulfeto (mostrada como oxidação de AMB4ox) e concordância com o padrão isotópico para [AMB4ox+ UC (I)]+. No pH = 9,98, há uma mudança adicional de-1 m/z, significando o emperramento do UC (II) e a remoção de um próton para manter o estado da carga + 1, que combina então o teste padrão do isótopo para [AMB4ox− H + UC (II)]+. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: alteração das intensidades relativas das identidades dos complexos de UC (I/II) do monómero, dímero e trimer de AMB4 sobre a faixa de pH de 3,0 – 11,0.  (A) monômero com um íon (i/II), (B) dímero com 2 íons de UC (i/II) e (C) TRIMER com 3 íons (i/II). As legendas observam quantos títulos de dissulfeto estavam presentes no complexo. Este número foi adaptado de uma publicação anterior39. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 7
Figura 7: percentual de formação de complexos de metanobacttina (i), AG (i), Zn (II), Ni (II), co (II), MN (II), PB (II) ou FE ( II); Observadas durante as titulações individuais de íons metálicos de methanobactin. Deve-se notar que a associação de UC (I) resultou da adição de uma ligação de UC (II) e Fe (II) a partir da adição de Fe (III). Este número foi adaptado de uma publicação anterior19. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 8
Figura 8: comparação entre a percentagem de i/II, AG (i), Zn (II), Ni (II), co (II), MN (II), PB (II) ou FE (II) quelação por MB-OB3b e AMB7 em pH = 7. A comparação é para a formação de íons carregados negativamente. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Supplementary File
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Discussion

Etapas críticas: conservando os comportamentos da solução-fase para o exame através de ESI-IM-MS
As configurações instrumentais do ESI nativo devem ser usadas para conservar os peptídeos estequiometria, estado de carga e estrutura conformacional. Para condições nativas, as condições da fonte ESI, como as tensões do cone, as temperaturas e os fluxos de gás, devem ser otimizadas. Além disso, as pressões e tensões na fonte, armadilha, mobilidade de íons e ondas de viagem de transferência (especialmente o viés de armadilha DC que controla a tensão de injeção na célula de IM) devem ser verificados por suas influências nas distribuições de mobilidade de íons e estado de carga.

A seguir estão as condições de operação típicas que foram usadas neste trabalho. As amostras de peptídeos aquosos foram injetadas usando uma seringa sem corte de 1,0 mL usando uma vazão de 10 μL Min− 1 , tensão capilar de 2,0 kV para íons positivos (+) ou − 1,8 KV para íons negativos (-), temperatura da fonte de 130 ° c, desolvação de 250 ° c, cone de amostragem de 20 V e 4,0 v cone de extração. A seção de im foi operada com a tensão de entrada de 6,0 V à pilha da armadilha com uma pressão do argônio de 2,25 x 10− 2 mbar usando uma taxa de fluxo de 1,5 ml/min. A tensão para injetar íons (desvio da C.C. da armadilha) na pilha IM foi ajustada em 12 V para evitar a dissociação dos íons como colidiram inicialmente com o gás do amortecedor do nitrogênio. A pilha de IM separou os íons baseados em seus carga e seção transversal da colisão e utilizou uma pressão do nitrogênio de 0,52 mbar e 20,0 mL min− 1 taxa de fluxo. O IM foi operado com as alturas de onda de viagem de 12,0 a 20,0 V (+) ou 8,0 – 30,0 V (−) e ramped 800 – 1500 m s− 1 (+) ou 250 – 1000 m s− 1 (−) velocidades para cada varredura através da célula da onda de viagem im. A pilha de transferência foi operada com a mesma pressão do argônio que a pilha da armadilha e guiou os íons resolvidos im ao analisador da massa-à-carga do tempo--vôo ortogonal. Os espectros da mobilidade-massa do íon foram adquiridos sincronizando a liberação gated dos íons na pilha de IM com o analisador da massa-à-carga do tempo--vôo.

Usando as condições de ESI nativas, as propriedades da solução-fase tais como o estado da carga e o estado conformacional são conservadas durante as análises im-MS. Por exemplo, os Estados de carga de MB-OB3b e ambs observados durante as análises de im-MS20,37 estavam intimamente relacionados com os Estados de cobrança esperados na fase de solução40. O peptídeo MB-OB3b é tetraprótico e forma apenas íons carregados negativamente durante a análise de IM-MS40, se o (i)-Bound ou o UC (i)-livre, porque contém o C-Terminus (pka < 1,7), dois grupos de oxazolona enethiol (pka = 5,0 e 9,7) e grupo Tyr (pKa = 11,0)42. Os ambs em sua forma totalmente protonada terá uma carga global de + 2 por causa do C-Terminus (pka ≈ 2), dois his (pka = 6,0), dois Cys (pka = 8,3), e Tyr (pka = 11,0) sites19,41. Assim, eles geralmente formam íons carregados positivamente a um pH de < 6 e íons carregados negativamente a um pH de > 6.

Os ambs também mostraram um comportamento vinculativo de UC (I/II) de pH dependente e atividade redox em que o UC (I)-emperramento a um pH baixo transitou para a ligação de UC (II) a um pH mais elevado. As reações de UC (I/II) incluíram a formação de espécies de AMB oxidadas (AMBOx) que continham ligações de dissulfeto e vários multiméteres e múltiplos de ligação de UC (i/II) (Figura 5 e Figura 6). Essas reações redox são dependentes do tempo e mostrou-se que quanto maior o intervalo de tempo (até 210 min) entre a preparação da amostra e as análises de IM-MS, os produtos mais oxidados foram observados37. Conseqüentemente, a consideração cuidadosa da dependência do tempo de reação na observação dos produtos é exigida igualmente.

Limitações: IM-MS e Cross-seções teóricas da colisão identificam que tipo de coordenação cada íon do metal prefere
Para ajudar a interpretar os dados de IM-MS m/z e CCS, realizou-se uma extensa pesquisa utilizando o nível de teoria B3LYP/LanL2DZ. Os confôrmeros geometria-aperfeiçoados com locais diferentes da coordenação foram comparados entre sua energia livre prevista e a concordância com o CCS medido por im-MS. a modelagem molecular desses peptídeos e seus complexos é limitada pelo tipo de cálculos de estrutura que podem ser aplicados a esses sistemas relativamente grandes. Outros métodos que foram estudados ou recomendados incluem o trabalho de Truhlar et al.43, que constatou que M05-2x foi o melhor DFT funcional e PM7 e MNDO/d foram bons métodos semiempíricos nddo para Zn (II)-contendo compostos44. Estes peptídeos têm um grande espaço conformacional e investigação minuciosa para localizar os mais baixos conformadores de energia deve incluir a comparação entre os vários locais quelantes metálicos, várias ligações cis-e trans-peptídeos, sal-pontes, ligação de hidrogênio, e π-cation interação entre o grupo lateral Tyr aromático e a cátion metálica.

Significância em relação aos métodos existentes: UC (I/II) e outra ligação de íons metálicos selecionados em comparação entre MB-OB3b e ambs
A cristalografia do raio X e a espectroscopia de RMN são as técnicas as mais comuns usadas para determinar a definição atômica da estrutura terciária dos peptídeos. No entanto, estudos de cristalografia de raios-X de metalopeptídeos são escassos devido a problemas com a cristalização desses complexos45. A RMN também não é adequada para a interpretação de uma amostra em que espécies de oligopeptídeos individuais intimamente relacionadas estão presentes46. Portanto, im-MS e DFT modelagem molecular são técnicas alternativas para o estudo de reações peptídicas, especialmente aqueles que resultam de reações complexas redox e UC (I/II)-ligação20,37,40, 47. a força de im-MS é que ele pode resolver cada um dos produtos e identificar a sua composição molecular, medindo simultaneamente o seu m/z e tempos de chegada que se relacionam com a estequiometria, estado protonação, e estrutura conformacional.

Por exemplo, o MB-OB3b irá quelate uma variedade de íons metálicos, e sua seletividade para cada íon foi exibida pelas titulações de íons metálicos IM-MS (Figura 7). Os resultados mostraram a preferência MB-OB3b para a vinculação de UC (I) e AG (I), comparando os resultados com um pH de 7 com AMB7. A Figura 8 mostra AMB7 preferencialmente quelatos Zn (II) e Ni (II). Em geral, os estudos da AMB mostraram que a substituição dos dois enethiol-oxazolonas por 2His-2Cys não excluem a associação de UC (I/II), mas resultou em múltipla ligação de UC (I) através da coordenação linear-ponte (Figura 3) em oposição ao mononucleares UC (i) ligação da coordenação tetraédrica MB-OB3b's48. A redução de UC (II) também foi mediada pela oxidação de tiol e pela formação de pontes de dissulfeto em contraste com a ponte de dissulfeto existente em Apo-MB-OB3b e o alto potencial de redução para o MB-OB3b carregado de cobre, que suporta a forte preferência por UC (I)49 .

Aplicações futuras
Mais estudos de IM-MS de peptídeos AMB estão em andamento, em que sua seqüência primária é modificada substituindo o his ou Cys com Gly ou ASP, enquanto o resíduo Tyr é substituído por Gly ou PHE. Estes estudos também estão sendo conduzidos em acetato de amônio 10,0 mM, com o pH modificado com hidróxido de amônio (para pH = 7, 8 e 9) para manter a força total iônica constante para cada amostra. Estes resultados serão publicados em breve.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este material é baseado no trabalho apoiado pela Fundação Nacional da ciência 1764436, sustentação do instrumento do NSF (MRI-0821247), Fundação de Welch (T-0014), e recursos computando do departamento de energia (TX-W-20090427-0004-50) e comunicações L3 . Agradecemos ao grupo Bower da Universidade da Califórnia-Santa Barbara por compartilhar o programa Sigma e Ayobami Ilesanmi para demonstrar a técnica no vídeo.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acetonitrile HPLC-grade Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A998SK-4
ammonium hydroxide (trace metal grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A512-P500
cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 255599-5G
copper(II) chloride 99.999% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203149-10G
copper(II) nitrate hydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 229636-5G
designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides Neo BioLab (neobiolab.com) designed peptides were synthized by order
designed amb5B,C,D,E,F peptides PepmicCo (www.pepmic.com) designed peptides were synthized by order
Driftscope 2.1 software program Waters (www.waters.com) software analysis program
Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce)
glacial acetic acid (Optima grade) Fisher Scientific (www.Fishersci.com) A465-250
Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 12357-09
lead(II) nitrate ACS grade Avantor (www.avantormaterials.com) 128545-50G
manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203734-5G
MassLynx 4.1 Waters (www.waters.com) software analysis program
nickel chloride hexahydrate 99.99% Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) 203866-5G
poly-DL-alanine Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) P9003-25MG
silver nitrate 99.9%+ Alfa Aesar (www.alfa.com) 11414-06
Waters Synapt G1 HDMS Waters (www.waters.com) quadrupole - ion mobility- time-of-flight mass spectrometer
zinc chloride anhydrous Alfa Aesar (www.alfa.com) A16281

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References

  1. Dudev, T., Lim, C. Competition among Metal Ions for Protein Binding Sites: Determinants of Metal Ion Selectivity in Proteins. Chemical Reviews. 114 (1), 538-556 (2014).
  2. Sovago, I., Kallay, C., Varnagy, K. Peptides as complexing agents: Factors influencing the structure and thermodynamic stability of peptide complexes. Coordination Chemistry Reviews. 256 (19-20), 2225-2233 (2012).
  3. Sóvágó, I., Várnagy, K., Lihi, N., Grenács, Á Coordinating properties of peptides containing histidyl residues. Coordination Chemistry Reviews. 327, 43-54 (2016).
  4. Rubino, J. T., Franz, K. J. Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function. Journal of Inorganic Biochemistry. 107 (1), 129-143 (2012).
  5. Robinson, N. J., Winge, D. R. Copper Metallochaperones . Annual Review of Biochemistry. 79, 537-562 (2010).
  6. Scheiber, I. F., Mercer, J. F. B., Dringen, R. Metabolism and functions of copper in brain. Progress in Neurobiology. 116 (0), 33-57 (2014).
  7. Tisato, F., Marzano, C., Porchia, M., Pellei, M., Santini, C. Copper in Diseases and Treatments, and Copper-Based Anticancer Strategies. Medicinal Research Reviews. 30 (4), 708-749 (2010).
  8. Millhauser, G. L. Copper and the prion protein: Methods, structures, function, and disease. Annual Review of Physical Chemistry. 58, 299-320 (2007).
  9. Arena, G., Pappalardo, G., Sovago, I., Rizzarelli, E. Copper(II) interaction with amyloid-beta: Affinity and speciation. Coordination Chemistry Reviews. 256 (1-2), 3-12 (2012).
  10. Kim, H. J., et al. Methanobactin, a copper-acquisition compound from methane-oxidizing bacteria. Science. 305 (5690), 1612-1615 (2004).
  11. Di Spirito, A. A., et al. Methanobactin and the link between copper and bacterial methane oxidation. Microbiology Molecular Biology Reviews. 80 (2), 387-409 (2016).
  12. Kenney, G. E., Rosenzweig, A. C. Chemistry and biology of the copper chelator methanobactin. ACS Chemical Biology. 7 (2), 260-268 (2012).
  13. Summer, K. H., et al. The biogenic methanobactin is an effective chelator for copper in a rat model for Wilson disease. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 25 (1), 36-41 (2011).
  14. Hachmoeller, O., et al. Investigating the influence of standard staining procedures on the copper distribution and concentration in Wilson's disease liver samples by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 71-75 (2017).
  15. Hachmoeller, O., et al. Spatial investigation of the elemental distribution in Wilson's disease liver after D-penicillamine treatment by LA-ICP-MS. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 44, 26-31 (2017).
  16. Hachmoeller, O., et al. Element bioimaging of liver needle biopsy specimens from patients with Wilson's disease by laser ablation-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 35, 97-102 (2016).
  17. Mueller, J. C., Lichtmannegger, J., Zischka, H., Sperling, M., Karst, U. High spatial resolution LA-ICP-MS demonstrates massive liver copper depletion in Wilson disease rats upon Methanobactin treatment. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology. 49, 119-127 (2018).
  18. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of Ag(I), Au(III), Cd(II), Co(II), Fe(III), Hg(II), Mn(II), Ni(II), Pb(II), U(IV), and Zn(II) binding by methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b. Journal of Inorganic Biochemistry. 100, 2150-2161 (2006).
  19. McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Binding Selectivity of Methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b for Copper(I), Silver(I), Zinc(II), Nickel(II), Cobalt(II), Manganese(II), Lead(II), and Iron(II). Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 28, 2588-2601 (2017).
  20. Sesham, R., et al. The pH dependent Cu(II) and Zn(II) binding behavior of an analog methanobactin peptide. European Journal of Mass Spectrometry. 19 (6), 463-473 (2013).
  21. Wagoner, S. M., et al. The multiple conformational charge states of zinc(II) coordination by 2His-2Cys oligopeptide investigated by ion mobility - mass spectrometry, density functional theory and theoretical collision cross sections. Journal of Mass Spectrom. 51 (12), 1120-1129 (2016).
  22. Bandow, N. L., et al. Isolation of methanobactin from the spent media of methane-oxidizing bacteria. Methods in Enzymology. 495, 259-269 (2011).
  23. Choi, D. W., et al. Spectral and thermodynamic properties of methanobactin from γ-proteobacterial methane oxidizing bacteria: a case for copper competition on a molecular level. Journal of Inorganic Biochemistry. 104 (12), 1240-1247 (2010).
  24. Pringle, S. D., et al. An investigation of the mobility separation of some peptide and protein ions using a new hybrid quadrupole/travelling wave IMS/oa-ToF instrument. International Journal of Mass Spectrometry. 261 (1), 1-12 (2007).
  25. Forsythe, J. G., et al. Collision cross section calibrants for negative ion mode traveling wave ion mobility-mass spectrometry. Analyst. 14 (20), 6853-6861 (2015).
  26. Allen, S. J., Giles, K., Gilbert, T., Bush, M. F. Ion mobility mass spectrometry of peptide, protein, and protein complex ions using a radio-frequency confining drift cell. Analyst. 141 (3), 884-891 (2016).
  27. Bush, M. F., Campuzano, I. D. G., Robinson, C. V. Ion Mobility Mass Spectrometry of Peptide Ions: Effects of Drift Gas and Calibration Strategies. Analytical Chemistry. 84 (16), 7124-7130 (2012).
  28. Salbo, R., et al. Traveling-wave ion mobility mass spectrometry of protein complexes: accurate calibrated collision cross-sections of human insulin oligomers. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1181-1193 (2012).
  29. Smith, D. P., et al. Deciphering drift time measurements from travelling wave ion mobility spectrometry-mass spectrometry studies. European Journal of Mass Spectrometry. 15 (2), 113-130 (2009).
  30. Becke, A. D. Density-functional thermochemistry. III. The role of exact exchange. Journal of Chemical Physics. 98 (7), 5648-5652 (1993).
  31. Dunning, T. H., Hay, P. J. Gaussian basis sets for molecular calculations. Modern Theoretical Chemistry. 3, 1-27 (1977).
  32. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for potassium to gold including the outermost core orbitals. Journal of Chemical Physics. 82 (1), 299-310 (1985).
  33. Hay, P. J., Wadt, W. R. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for the transition metal atoms scandium to mercury. Journal of Chemical Physics. 82 (1), 270-283 (1985).
  34. Wadt, W. R., Hay, P. J. Ab initio effective core potentials for molecular calculations. Potentials for main group elements sodium to bismuth. Journal of Chemical Physics. 82 (1), 284-298 (1985).
  35. Gaussian 09, Revision C.01. Gaussian, Inc. , Wallingford CT. (2012).
  36. Wyttenbach, T., von Helden, G., Batka, J. J., Carlat, D., Bowers, M. T. Effect of the long-range potential on ion mobility measurements. Journal of the American Society of Mass Spectrometry. 8 (3), 275-282 (1997).
  37. Choi, D., et al. Redox activity and multiple copper(I) coordination of 2His-2Cys oligopeptide. Journal of Mass Spectrometry. 50 (2), 316-325 (2015).
  38. Rigo, A., et al. Interaction of copper with cysteine: stability of cuprous complexes and catalytic role of cupric ions in anaerobic thiol oxidation. Journal of Inorganic Biochemistry. 98 (9), 1495-1501 (2004).
  39. Vytla, Y., Angel, L. A. Applying Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Explicitly Identifying the Products of Cu(II) Reactions of 2His-2Cys Motif Peptides. Analytical Chemistry. 88 (22), 10925-10932 (2016).
  40. Choi, D., Sesham, R., Kim, Y., Angel, L. A. Analysis of methanobactin from Methylosinus trichosporium OB3b via ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 18 (6), 509-520 (2012).
  41. Martell, A. E., Motekaitis, R. J. NIST Standard Reference Database 46. Institute of Standards and Technology. , Gaithersburg, MD. (2001).
  42. Pesch, M. L., Christl, I., Hoffmann, M., Kraemer, S. M., Kretzschmar, R. Copper complexation of methanobactin isolated from Methylosinus trichosporium OB3b: pH-dependent speciation and modeling. Journal of Inorganic Biochemistry. 116, 55-62 (2012).
  43. Amin, E. A., Truhlar, D. G. Zn Coordination Chemistry: Development of Benchmark Suites for Geometries, Dipole Moments, and Bond Dissociation Energies and Their Use To Test and Validate Density Functionals and Molecular Orbital Theory. Journal of Chemical Theory and Computation. 4 (1), 75-85 (2008).
  44. Sorkin, A., Truhlar, D. G., Amin, E. A. Energies, Geometries, and Charge Distributions of Zn Molecules, Clusters, and Biocenters from Coupled Cluster, Density Functional, and Neglect of Diatomic Differential Overlap Models. Journal of Chemical Theory and Computation. 5 (5), 1254-1265 (2009).
  45. Lillo, V., Galan-Mascaros, J. R. Transition metal complexes with oligopeptides: single crystals and crystal structures. Dalton Transactions. 43 (26), 9821-9833 (2014).
  46. Choutko, A., van Gunsteren, W. F. Conformational Preferences of a beta-Octapeptide as Function of Solvent and Force-Field Parameters. Helvetica Chimica Acta. 96 (2), 189-200 (2013).
  47. Angel, L. A. Study of metal ion labeling of the conformational and charge states of lysozyme by ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 17 (3), 207-215 (2011).
  48. Kelso, C., Rojas, J. D., Furlan, R. L. A., Padilla, G., Beck, J. L. Characterisation of anthracyclines from a cosmomycin D-producing species of Streptomyces by collisionally-activated dissociation and ion mobility mass spectrometry. European Journal of Mass Spectrometry. 15 (2), 73-81 (2009).
  49. El Ghazouani, A., et al. Copper-binding properties and structures of methanobactins from Methylosinus trichosporium OB3b. Inorganic Chemistry. 50 (4), 1378-1391 (2011).

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Química edição 151 motivo 2his-2cys methanobactin estrutura terciária do peptide estado da carga do histidina estado da carga do cisteína Salt-Bridge B3LYP/LanL2DZ tamanho do íon escalado Lennard-Jones Cross-Sections da colisão
Técnicas de espectrometria de massa de mobilidade de íons para determinação da estrutura e mecanismos de reconhecimento de íons metálicos e atividade redox de oligopeptídeos de ligação metálica
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Yousef, E. N., Sesham, R., McCabe,… More

Yousef, E. N., Sesham, R., McCabe, J. W., Vangala, R., Angel, L. A. Ion Mobility-Mass Spectrometry Techniques for Determining the Structure and Mechanisms of Metal Ion Recognition and Redox Activity of Metal Binding Oligopeptides. J. Vis. Exp. (151), e60102, doi:10.3791/60102 (2019).

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