Jon mobilitet-masspektrometri och molekylära modelleringstekniker kan karakterisera den selektiva metallkelaterande prestandan hos designade metallbindande peptider och den kopparbindande peptiden methanobactin. Utveckla nya klasser av metallkelerande peptider kommer att bidra till att leda till Therapeutics för sjukdomar som förknippas med metall Jon obalans.
Elektrospray jonisering (ESI) kan överföra en vatten-fas peptid eller peptid komplex till gas-fas samtidigt bevara sin massa, total laddning, metall-bindande interaktioner, och kon Formations form. Koppling ESI med Jon mobilitet-masspektrometri (im-MS) ger en instrumentell teknik som möjliggör samtidig mätning av en peptid Mass-to-Charge (m/z) och kollision tvärsnitt (CCS) som relaterar till dess stökiometri, protonering tillstånd, och kon Formations form. Den totala laddningen av en peptid komplex styrs av protonationen av 1) peptidens sura och grundläggande platser och 2) oxidationstillståndet hos metall Jon (er). Därför, den totala laddningsstatus för ett komplex är en funktion av pH i lösningen som påverkar peptider metall jonbindning tillhörighet. För ESI-IM-MS-analyser bereds lösningar av peptid-och metalljoner från vattenlösningar med pH-värdet justerat med utspädd, vattenbaserad ättiksyra eller ammoniumhydroxid. Detta möjliggör pH beroende och metall Jon selektivitet fastställas för en specifik peptid. Dessutom kan m/z och CCS av en peptid komplex användas med B3LYP/LanL2DZ molekylär modellering för att urskilja bindningsställen av metall Jon koordination och tertiärstruktur av komplexet. Resultaten visar hur ESI-IM-MS kan karakterisera selektiv kelatbildningsprestanda för en uppsättning alternativa methanobactin peptider och jämföra dem med kopparbindande peptid methanobactin.
Koppar och zink joner är viktiga för levande organismer och avgörande för processer inklusive oxidativ skydd, vävnad tillväxt, andning, kolesterol, glukosmetabolism, och genomläsning1. För att möjliggöra dessa funktioner, grupper som thiolate av CYS, Imidazol av hans2,3, (mer sällan) tioeterlänken av metionin, och karboxylat av GLU och ASP införliva selektivt metaller som kofaktorer i den aktiva platser av metalloenzymer. Likheten mellan dessa samordningsgrupper väcker en spännande fråga om hur hans och CYS ligander selektivt införliva antingen Cu (I/II) eller Zn (II) för att säkerställa korrekt funktion.
Selektiv bindning sker ofta genom förvärv och människohandel peptider, som kontrollerar Zn (II) eller Cu (I/II) jonkoncentrationer4. Cu (I/II) är mycket reaktiv och orsakar oxidativ skada eller oavsiktlig bindning till enzymer, så dess fria koncentration är tätt reglerad av koppar Chaperones och koppar reglerande proteiner som transporterar det säkert till olika platser i cellen och tätt kontrollera dess homeostas5,6. Störningar av kopparmetabolism eller homeostas är direkt inblandad i Menkes och Wilsons sjukdom7 samt cancer7 och neurala sjukdomar, såsom prionsjukdomar8 och Alzheimers sjukdom9.
Wilsons sjukdom är förknippad med ökade koppar nivåer i ögonen, levern och delar av hjärnan, där redoxreaktionerna av Cu (I/II) producerar reaktiva syreradikaler, orsakar hepatolentikulär och neurologiska degeneration. Befintliga kelering terapier är den lilla tiol aminosyran penicillamin och trietylenetetramine. Alternativt, den methanotrophic koppar-förvärv peptider methanobactin (MB)10,11 uppvisar terapeutisk potential på grund av deras hög bindning affinitet för Cu (I)12. När methanobactin (MB-OB3b) från Methylosinus trichosporium OB3b studerades i ett djurmodell av Wilsons sjukdom, koppar effektivt bort från levern och utsöndras genom galla13. In vitro-experiment bekräftade att MB-OB3b kunde kelat koppar från kopparmetallothionein som finns i levern Cytosol13. Laser ablation induktivt kopplade plasma masspektrometri Imaging tekniker har undersökt den rumsliga distributionen av koppar i Wilsons sjukdom leverprover14,15,16 och visade att MB-OB3b tar bort koppar med korta behandlingsperioder på endast 8 dagar17.
Den MB-OB3b kommer också att binda med andra metalljoner, inklusive AG (I), au (III), PB (II), mn (II), Co (II), Fe (II), ni (II), och Zn (II)18,19. Konkurrensen om den fysiologiska Cu (I) bindningsstället ställs ut av AG (I) eftersom den kan tränga undan Cu (I) från MB-OB3b-komplexet, med både AG (I) och ni (II) som också visar oåterkallelig bindning till MB som inte kan förskjutas av Cu (I)19. Nyligen har en rad alternativa methanobactin (amb) oligopeptider med 2his-2cys bindande motiv har studerats20,21, och deras Zn (II) och Cu (I/II) bindningsegenskaper kännetecknas. Deras primära aminosyresekvenser är likartade, och alla innehåller 2His-2Cys motiv, Pro och en Acetylerad N-Terminus. De skiljer sig främst från MB-OB3b eftersom 2His-2Cys motiv ersätter de två enethiol oxazolon bindningsställen av MB-OB3b.
Elektrospray jonisering tillsammans med Jon Mobility-masspektrometri (ESI-IM-MS) ger en kraftfull instrumentell teknik för att bestämma metallbindande egenskaper peptider eftersom det mäter deras massa-till-laddning (m/z) och kollision tvärsnitt (CCS) samtidigt som de bevara sin massa, laddning och kon Formations form från lösningsfasen. M/z och CCS relaterar till peptider stoichiometry, protonering State, och kon Formations form. Stökiometrin bestäms på grund av att identiteten och numret för varje beståndsdel som finns i arten är tydligt identifierade. Den totala laddningen av peptidkomplexet relaterar till protonationstillståndet för de sura och grundläggande platserna och oxidationstillståndet hos metall Jon (s). CCS ger information om den kon Formations form av peptid komplex eftersom den mäter den rotations genomsnittliga storleken som hänför sig till den tertiära strukturen av komplexet. Den totala laddningstillstånd av komplexet är också en funktion av pH och påverkar peptiden metall jonbindning tillhörighet eftersom deprotonerade grundläggande eller sura områden såsom karboxyl, hans, Cys och Tyr är också de potentiella bindningsställen för metall Jon. För analyserna bereds peptiden och metall Jon lösningen i vattenlösningar med pH-värdet justerat genom utspädd vatten ättiksyra eller ammoniumhydroxid. Detta gör det möjligt för pH beroende och metall Jon selektivitet fastställas för peptiden. Dessutom, m/z och CCS bestäms av ESI-im-MS kan användas med B3LYP/LanL2DZ molekylär modellering för att upptäcka vilken typ av metall Jon koordination och tertiärstruktur av komplexet. De resultat som visas i denna artikel avslöjar hur ESI-IM-MS kan karakterisera selektiv kelatbildningsprestanda för en uppsättning av amb peptider och jämföra dem med kopparbindande peptid MB-OB3b.
Kritiska steg: bevara lösnings fas beteenden för undersökning via ESI-IM-MS
Native ESI instrumentella inställningar måste användas som bevarar peptiderna stoichiometry, laddningstillstånd, och överensstämde struktur. För inhemska förhållanden måste villkoren i ESI-källan såsom kon spänningar, temperaturer och gasflöden optimeras. Också, trycket och spänningar i källan, fälla, Jon rörlighet, och överföra resande vågor (särskilt DC trap bias som styr insprutnings spänningen i …
The authors have nothing to disclose.
Detta material är baserat på arbete som stöds av National Science Foundation under 1764436, NSF instrument support (MRI-0821247), Welch Foundation (T-0014), och datorresurser från Department of Energy (TX-W-20090427-0004-50) och L3 Communications . Vi tackar Bower grupp University of California-Santa Barbara för att dela Sigma-programmet och Ayobami Ilesanmi för att demonstrera tekniken i videon.
acetonitrile HPLC-grade | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A998SK-4 | |
ammonium hydroxide (trace metal grade) | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A512-P500 | |
cobalt(II) chloride hexahydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 255599-5G | |
copper(II) chloride 99.999% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 203149-10G | |
copper(II) nitrate hydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 229636-5G | |
designed amb1,2,3,4,5,6,7 peptides | Neo BioLab (neobiolab.com) | designed peptides were synthized by order | |
designed amb5B,C,D,E,F peptides | PepmicCo (www.pepmic.com) | designed peptides were synthized by order | |
Driftscope 2.1 software program | Waters (www.waters.com) | software analysis program | |
Freeze-dried, purified, Cu(I)-free mb-OB3b | cultured and isolated in the lab of Dr. DongWon Choi (Biology Department, Texas A&M-Commerce) | ||
glacial acetic acid (Optima grade) | Fisher Scientific (www.Fishersci.com) | A465-250 | |
Iron(III) Chloride Anhydrous 98%+ | Alfa Aesar (www.alfa.com) | 12357-09 | |
lead(II) nitrate ACS grade | Avantor (www.avantormaterials.com) | 128545-50G | |
manganese(II) chloride tetrahydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 203734-5G | |
MassLynx 4.1 | Waters (www.waters.com) | software analysis program | |
nickel chloride hexahydrate 99.99% | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 203866-5G | |
poly-DL-alanine | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | P9003-25MG | |
silver nitrate 99.9%+ | Alfa Aesar (www.alfa.com) | 11414-06 | |
Waters Synapt G1 HDMS | Waters (www.waters.com) | quadrupole – ion mobility- time-of-flight mass spectrometer | |
zinc chloride anhydrous | Alfa Aesar (www.alfa.com) | A16281 |