Detta manuskript beskriver ett protokoll för att avgöra om exponering för ozon, ett kriterium luftförorening, försämrar alveolära makrofage efferocytos in vivo. Detta protokoll använder vanliga reagenser och tekniker och kan anpassas till flera modeller av lungskada för att fastställa effekter på alveolära makrofagen efferocytos.
Ozon (O3) är ett kriterium luftförorening som förvärar och ökar incidensen av kroniska lungsjukdomar. O3 exponering är känd för att framkalla lunginflammation, men lite är känt om hur exponeringen förändrar processer som är viktiga för upplösningen av inflammation. Efferocytosis är en resolution process, varvid makrofager fagocytize apoptotiska celler. Syftet med detta protokoll är att mäta alveolära makrofage efferocytos efter O3-inducerad lungskada och inflammation. Flera metoder har beskrivits för att mäta efferocytos; emellertid, de flesta kräver ex vivo manipulationer. Beskrivs i detalj här är ett protokoll för att mäta in vivo alveolära makrofage efferocytosis 24 h efter O3 exponering, som undviker ex vivo manipulation av makrofager och fungerar som en enkel teknik som kan användas för att korrekt representera störningar i Denna resolutions process. Protokollet är en tekniskt icke-intensiv och relativt billig metod som involverar hela kroppen O3 inandning följt av orofaryngeal aspiration av apoptotiska celler (dvs., Jurkat T-celler) medan under narkos. Alveolära makrofagefferocytos mäts sedan genom ljusmikroskopi utvärdering av makrofager som samlats in från bronkoalveolär (BAL) sköljning. Efferocytosis mäts slutligen genom att beräkna ett efferocytic index. Kollektivt, de beskrivna metoderna kvantifiera efferocytic aktivitet i lungan in vivo och samtidigt tjänar till att analysera de negativa hälsoeffekterna av O3 eller andra inhalerade förolämpningar.
Lungan utsätts ständigt för miljömässiga förolämpningar, inklusive luft partiklar, virus, bakterier, och oxidationsmedel gaser som utlöser lunginflammation1,2,3. Dessa förolämpningar kan äventyra gasutbyte och framkalla irreversibel vävnadsskada4,5. Alveolära makrofager, som utgör cirka 95% av de immunceller som finns i murin och mänskliga lungor vid homeostas, är kritiska regulatorer av pulmonell inflammation efter miljö förolämpningar1,2, 3,4,5. Alveolära makrofager är viktiga under värd försvaret av fagocyterande och eliminera patogener. Nyligen, alveolära makrofager har visat sig främja vävnad homeostas och upplösning av inflammation genom efferocytosis6,7. Efferocytosis är en fagocytisk process där makrofager uppslukar och eliminera apoptotiska celler8,9,10. Efferocytosis resulterar också i produktion av medlare (i.e., Il-10, TGF-β, PGE2, och kväveoxid) att ytterligare öka processen, vilket resulterar i upplösning av inflammation9,10,11 ,12,16,18. Denna process är nödvändig för att förhindra sekundär nekros och främja vävnad homeostas12,13,14. Flera studier har kopplat nedsatt efferocytos med olika kroniska lungsjukdomar, inklusive astma, kronisk obstruktiv lungsjukdom, och idiopatisk pulmonell fibros8,9,15, 16,17.
O3 är ett kriterium luftförorening som förvärar och ökar incidensen av kroniska lungsjukdomar19,20,21. O3 inducerar lunginflammation och skada och är känt för att försämra alveolära makrofagocytos av bakteriella patogener22,23. Emellertid, det är okänt om O3 försämrar alveolära makrofagen efferocytos. Utreda O3-inducerad förändringar i alveolär makrofagefferocytos kommer att ge potentiell insikt i hur exponeringen kan leda till kronisk lungsjukdom incidens och exacerbation. Beskrivs nedan är en enkel metod för att utvärdera alveolära makrofage efferocytosis i lungorna av kvinnliga möss efter akut O3 exponering.
Metoden som beskrivs har flera fördelar jämfört med andra efferocytosis-protokoll som vanligen används inom området genom att eliminera användningen av kostsamma fluorescerande färgämnen, omfattande flödescytometrimätningar och ex vivo-manipulation av alveolära makrofager24 ,25. Dessutom, detta protokoll åtgärder alveolära makrofage efferocytos i samband med lung mikromiljön, som kan påverka makrofagfunktion.
Efferocytosis är en anti-inflammatorisk process där makrofager tydliga apoptotiska celler och skräp samt producera flera anti-inflammatoriska mediatorer9,10,11,12,16 ,18. Flera modeller av efferocytosis har gett insikt i hur makrofage är en kritisk cell i resolutionen av inflammation6,<…
The authors have nothing to disclose.
Denna studie finansieras av hälsoeffekter Institute Walter A. Rosenblith Award och NIEHS R01ES028829 (till K. M. G). Vi vill tacka Dr Dianne Walters (Institutionen för fysiologi, ECU) för hennes hjälp med att få representativa bilder av alveolära makrofager.
Annexin V-FITC Kit | Trevigen | 4830-250-K | The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry. |
BCL2 Jurkat T Cells | ATCC | ATCC CRL-2899 | The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. |
Countess II Automated Cell Counter | Thermofisher | AMQAX1000 | It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use. |
Cytospin 4 Cytocentrifuge | Thermofisher | A78300003 | Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid. |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | Thermofisher | 16140071 | Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. |
Kwik-Diff Reagent 2, Eosin | Thermofisher | 9990706 | Eosin staining that stains cytoplasm. |
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative | Thermofisher | 9990705 | Fixes cells to be stained by H&E. |
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue | Thermofisher | 9990707 | Methylene Blue staining that stains the nucleus. |
Penicillin-Streptomycin | Sigma/Aldrich | P0781-100ML | Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture. |
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermofisher | 61870036 | RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently. |
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker | Cambridge Scientific | 16659 | The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes. |
Teledyne T400 ultraviolet light photometer | Teledyne API | T400 | The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air. |
Teledyne T703 Ozone calibrator | Teledyne API | T703 | Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output. |