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Immunology and Infection

In vivo avaliação da Efferocitose de macrófago alveolar após exposição ao ozônio

Published: October 22, 2019 doi: 10.3791/60109
Automatic Translation
1, 1, 2, 1
1Department of Pharmacology and Toxicology, East Carolina University, 2Research Triangle Park, National Institute of Environmental Health and Sciences

Summary

Este manuscrito descreve um protocolo para determinar se a exposição ao ozônio, um critério poluente aéreo, prejudica a efferocitose alveolar do macrófago in vivo. Este protocolo utiliza reagentes e técnicas comumente usados e pode ser adaptado a vários modelos de lesão pulmonar para determinar os efeitos sobre a efferocitose do macrófago alveolar.

Abstract

O ozônio (O3) é um critério poluente aéreo que exacerba e aumenta a incidência de doenças pulmonares crônicas. O3 exposição é conhecida por induzir a inflamação pulmonar, mas pouco se sabe sobre como a exposição altera os processos importantes para a resolução da inflamação. A eferocitose é um processo de resolução, pelo qual os macrófagos fagocitizam células apoptóticas. A finalidade deste protocolo é medir o macrófagos alveolar do macrófago que segue ferimento e inflamação do pulmão de O3-induced. Vários métodos foram descritos para medir a eferocitose; no entanto, a maioria exige manipulações ex vivo. Descrito em detalhes aqui é um protocolo para medir a efferocitose alveolar in vivo do macrófago 24 h após a exposição O3 , que evita a manipulação ex vivo de macrófagos e serve como uma técnica simples que pode ser usada para representar com precisão as perturbações em Este processo de resolução. O protocolo é um método tecnicamente não intensivo e relativamente barato que envolve O corpo inteiro O3 inalação seguido por aspiração orofaríngea de células apoptóticas (i.e., células de Jurkat T) enquanto anestesia geral. A efferocitose do macrófago alveolar é então medida pela avaliação da microscopia de luz dos macrófagos coletados do lavado broncoalveolar (BAL). A eferocitose é finalmente medida calculando-se um índice eferocítico. Coletivamente, os métodos delineados quantificam a atividade efferocítica no pulmão in vivo ao mesmo tempo que servem para analisar os efeitos negativos da saúde de O3 ou outros insultos inalados.

Introduction

O pulmão está constantemente exposto a insultos ambientais, incluindo partículas de ar, vírus, bactérias e gases oxidantes que desencadeiam a inflamaçãopulmonar 1,2,3. Esses insultos podem comprometer a troca gasosa e induzir lesão tecidual irreversível4,5. Macrófagos alveolares, queconstituem aproximadamente 95% das células imunes encontradas em pulmões murino e humano na homeostase, são reguladores críticos da inflamação pulmonar após insultos ambientais1,2, 3,4,5. Os macrófagos alveolares são essenciais durante a defesa do hospedeiro por fagocitizar e eliminar patógenos. Recentemente, os macrófagos alveolares têm demonstrado promover a homeostase tecidual e a resolução da inflamação através da efferocitose6,7. A eferocitose é um processo fagocitítico no qual os macrófagos engolem e eliminam as células apoptóticas8,9,10. A eferocitose também resulta na produção de mediadores (i.e., IL-10, TGF-β, PGE2e óxido nítrico) que aumentam ainda mais o processo, resultando na resolução da inflamação9,10,11 ,12,16,18. Esse processo é necessário para prevenir a necrose secundária e promover a homeostase tecidual12,13,14. Vários estudos têm ligado a efferocitose prejudicada com várias doenças pulmonares crônicas, incluindo asma, doença pulmonar obstrutiva crônica, e fibrose pulmonar idiopática8,9,15, 16,17.

O3 é um critério poluente aéreo que exacerba e aumenta a incidência de doenças pulmonares crônicas19,20,21. O3 induz inflamação e lesão pulmonar e é conhecido por prejudicar a fagocitose alveolar de macrófagos de patógenos bacterianos22,23. No entanto, não se sabe se O3 prejudica a efferocitose alveolar do macrófago. Investigar as alterações induzidas pelo3na efferocitose de macrófago alveolar fornecerá uma visão potencial de como a exposição pode levar à incidência e exacerbação da doença pulmonar crônica. Descrito abaixo é um método simples para avaliar a efferocitose alveolar de macrófago nos pulmões de camundongos fêmeas após a exposição aguda O3 .

O método delineado possui várias vantagens sobre outros protocolos de eferocitose comumente utilizados no campo, eliminando o uso de corantes fluorescentes dispendiosos, medições extensas de citometria de fluxo e manipulação ex vivo de macrófagos alveolares24 ,25. Adicionalmente, este protocolo mede a efferocitose alveolar do macrófago no contexto do microambiente do pulmão, que pode influenciar a função do macrófago.

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Protocol

Todos os métodos foram aprovados pelo Comitê institucional de cuidados e uso de animais (IACUC) da Universidade da Carolina do leste.

1. ozônio (O3) e exposições filtradas do ar (dia 1)

  1. Coloque um máximo de 12 camundongos C57BL/6J fêmeas, 8-12 semanas de idade, em uma gaiola de aço (com 12 compartimentos separados) com tampas de malha de arame em uma câmara de exposição O3 .
  2. Coloque o termômetro na câmara de exposição com a gaiola para gravar com precisão a temperatura e umidade.
  3. Gire sobre a luz do oxigênio e do ultravioleta (UV) que é unida ao instrumento.
    Nota: o fluxo de ar regulado (> 30 Air Changes/h) com temperatura controlada (22-23 ° c) e umidade relativa (45%-50%) é obtido pelo aparelho o3 . O3 é gerado pelo sistema na câmara de exposição dirigindo 100% de oxigênio através de um gerador de luz UV, em seguida, misturando com um suprimento de ar filtrado.
  4. Ajustar a concentração de O3 a 1 ppm e gravar regularmente o3 níveis a cada 10 min para 3 h. Monitore continuamente a temperatura e a umidade do ar da câmara, como é a concentração de o3 com um fotômetro de luz UV.
    Nota: as exposições de ar filtrada são executadas em um aparelho semelhante, com apenas um suprimento de ar filtrado que flui através da câmara de exposição.
  5. Devolva os animais às respectivas gaiolas com roupa de cama, comida e água ad libitum após 3 h de O3/exposição ao ar filtrado.

2. preparação da linha celular Jurkat T (dia 2)

Nota: todos os procedimentos devem ser conduzidos em um armário de segurança biológico da classe II.

  1. Cultura de células de Jurkat T em 24 mL de meio de cultura de células basais + 10% FBS + 5% de penicilina/estreptomicina a 37 ° c + 5% CO2 (tabela de material). As pilhas de Jurkat T são uma linha de pilha da suspensão que possa ser mantida com o de 1:6-1:8 em meios de cultivo pre-warmed cada 3 dias. Não agite.
  2. Para preparar células apoptóticas, cresça-as para 90% de confluência em cada frasco (que leva 3-4 dias para atingir após o passaging). Para este estudo, use células de cinco frascos de T75 para obter o número suficiente de células utilizadas neste protocolo.
    Nota: um balão confluente contém cerca de 20-24 milhões de células.
  3. Pipetam as células (que é o balão inteiro) de cada frasco (aproximadamente 24 mL) e transferem células para um tubo cônico estéril de 50 mL utilizando uma pipeta serológica. Use vários tubos cônicos para frascos múltiplos.
  4. Células de contagem, removendo uma alíquota de 11 μL de células do tubo cônico 50 mL e misture com 11 μL de mancha azul de Tripan e pipetar 11 μL para lâminas de hemociômetro.
  5. Insira o slide em um contador de células automatizado e registre o número de células ao vivo para calcular a contagem total de células em cada balão multiplicando o número de células ao vivo por 24, pois cada balão contém 24 mL de mídia.
  6. Centrifugue a suspensão da pilha em 271 x g por 5 minutos na temperatura ambiente (RT) às pilhas da pelota.
  7. Descarte o sobrenadante por aspiração e ressuscite o pellet celular em mídia para obter 3,0 x 106 células por ml.
  8. Alíquota 5 mL de células em 100 mm x 20 mm de pratos de cultura de tecidos (aproximadamente nove pratos serão usados; a quantidade total de células em cada prato deve ser ~ 15 x 106).
  9. Use um prato para controle/não exposto, e os pratos restantes serão expostos a UV.
  10. Definir o chapéu cabeado UV para o nível de energia correto, pressione o botão de energia, e digite "600" usando o teclado numérico, que a máquina vai ler como 600 μj/cm2 x 100.
    Nota: unidades de energia de chapéu cabeado UV está em μj/cm2 x 100; Portanto, para alcançar 60 millijoules/cm2, converta unidades para coincidir com o CROSSLINKER UV.
  11. Irradiar todos os pratos com células, não incluindo o controle, em 60 milijoules (mJ)/cm2 usando o CROSSLINKER UV. Remova a tampa superior dos pratos da cultura do tecido durante a exposição UV, porque a luz UV não penetrará a tampa plástica.
  12. Incubar todos os pratos em uma incubadora da cultura de pilha, incluindo o controle não exposto, em 37 ° c em 5% CO2 para 4 h.
  13. Confirme a apoptose por citometria de fluxo usando um kit de detecção de apoptose contendo anexina V e iodeto de propiídio (PI) (marcadores para apoptose e necrose, respectivamente) após 4 h de incubação, de acordo com as instruções do fabricante26, a 27.
    Nota: irradiando células de Jurkat T no chapéu cabeado UV em um nível de energia de 600 μj/cm2, depois que uma incubação de 4 h conduzirá a ≥ 75% de pilhas apoptóticas (ambas cedo e tarde) que têm um phenotype apoptóticas mais adiantado do que o phenotype apoptóticas atrasado. Isto facilita para os macrófagos alveolares reconhecê-los e engolir como suas membranas são uncompromised, ao contrário das pilhas apoptóticas atrasadas, conduzindo a um índice efferocytic mais elevado e a uma imagem latente mais exata da macrófagos alveolar do macrófago neste estudo.
    1. Piscina 333 μL (1 x 106 células) de células de Jurkat T de vários pratos (ambos "não UV" e "UV-Exposed") juntos para usar para tubos de análise de compensação.
    2. Alíquota 333 μL de células de Jurkat T em uma mancha não manchada, anexina V única, mancha única PI, sem controle UV, e 600 μJ/cm2 UV-expostos rotulados tubos de citometria de fluxo.
    3. Tubos de centrifugação a 188 x g durante 5 min em RT e decantar o sobrenadante.
    4. Células de lavagem por ressuscita em 500 μL de frio, 1x tampão fosfato salina (PBS).
    5. Centrifugador e pilhas da pelota em 188 x g por 5 minutos em RT. descarte o sobrenadante após a centrifugação.
    6. Prepare 400 μL de tampão de ligação 1x por tubo de fluxo diluindo o tampão de ligação 10x com água destilada, enquanto as células são centrifugação.
    7. Prepare o reagente de incubação de anexina V e PI (100 μL por amostra/tubo) de acordo com as instruções do fabricante.
    8. Decantar o sobrenadante após a centrifugação e resuspender suavemente todos os tubos em 400 μL de tampão de ligação 1x e, em seguida, adicionar 100 μL de reagente de incubação de anexina V a cada tubo de amostragem. Por último, adicionar 100 μL de anexina V única mancha e PI única mancha para seus respectivos tubos, mas não acrescentar nada além do tampão de ligação 1x para o tubo não manchado.
    9. Incubar tubos no escuro por 15 min em RT.
    10. Centrifugue todas as células a 188 x g durante 5 min em RT e sobrenadante decante.
    11. Reressuscitem as células em 400 μL de tampão de ligação 1x, em seguida, analisar amostras de apoptose por citometria de fluxo. Colete pelo menos 10.000 eventos por o tubo para permitir a respresentação exata da mancha.
  14. Combine todas as células irradiadas de pratos em um tubo cônico de 50 mL e células da pelota por centrifugação a 271 x g por 5 min em RT.
  15. Descarte o sobrenadante do tubo por aspiração e resuspender as células em 24 mL de soro fisiológico tamponado (PBS) e células da pelota por centrifugação a 271 x g por 5 min à temperatura ambiente.
  16. Descarte o sobrenadante do tubo por aspiração e reressuscitem as células na quantidade de PBS usada para dosagem de camundongos aprovados pelo IACUC. A dose utilizada é entre 5-10 x 106 células/50 μL por rato; Portanto, para 10 camundongos, ressuscita em 500 μL (o número de células em cada dose varia dependendo de quantas células são cultivadas para irradiação).
    Nota: maquiagem, pelo menos, duas doses adicionais para dar conta de qualquer líquido que pode furar para os lados da ponta da pipeta, resultando na perda de células.

3. instilação orofaríngea Murina de células apoptóticas (dia 2)

  1. Prepare o inóculo de dosagem de células apoptóticas usando uma pipeta P200 antes de anestesiar camundongos para agilizar o procedimento. De acordo com as diretrizes institucionais, um volume de 50 μL contendo aproximadamente 5-10 x 106 células é utilizado para a instilação orofaríngea (op) para garantir melhores resultados.
  2. Anestesiar camundongos em uma câmara clara com isoflurano a 2% a uma vazão de 1 L/min ou de acordo com as diretrizes institucionais. Anestesie um a dois camundongos de cada vez; o número é determinado pelo nível de conforto do experimentador. Observe o padrão respiratório e confirme que as respiras profundas são visíveis com 2 – 3 contagens de s entre respirs. Verifique a profundidade da anestesia pela falta de resposta à pinça do dedo do pé.
  3. Posicione o rato numa posição supina semirecumbente. Use uma corda cirúrgica amarrada entre Pegs em uma placa de folha acrílica inclinada para suspender pelos incisivos Maxillary.
  4. Usando um par de fórceps não-ridged sem corte, agarre levemente e puxe a lingüeta do rato. Incuser as células apoptóticas na cavidade oral com uma pipeta P200. A dosagem é bem sucedida quando os ratos fazem um barulho de crepitante 1 – 2 s depois de dar a dose.
    Nota: Tome cuidado para evitar induzir o trauma ou para a língua ou orofaringe antes da instilação da célula apoptótica.
  5. Com um dedo enluvado, obstrua delicadamente o nariz até que o rato inales quando a lingüeta for retraído. Cubra o nariz até que nenhum líquido seja visível na cavidade oral e o rato tenha tomado duas ou mais inalações.
    Nota: como os ratos são obrigados respiradores do nariz, cobrindo o nariz ajuda a garantir que o mouse irá inalar as células apoptóticas para os pulmões.
  6. Retire o rato da placa de inoculação e devolva-o à gaiola para permitir a recuperação da anestesia. Coloque o mouse sobre as costas para evitar que as roupas de cama ou detritos bloqueiem as narinas durante a revogação.
  7. Aguarde 90 min depois que o mouse se recupera da anestesia para permitir que os macrófagos alveolares engolem o influxo de células apoptóticas depois que todos os camundongos despertem da anestesia. Tipicamente, o despertar após a anestesia levará 1 – 2 min, o que não deve afetar o desfecho/tempo de instilação.

4. coleta e processamento de fluido de lavagem broncoalveolar (dia 2)

  1. Eutanizar cada rato por directrizes institucionais 90 min depois que o rato acordou da anestesia da dosagem com pilhas apoptóticas. Aqui, uma injeção letal de cetamina e xilazina é usada (90 mg/kg e 10 mg/kg, respectivamente) seguido por excisão o diafragma.
    Nota: este ponto de tempo permite tempo suficiente para os macrófagos alveolares a sentir e engolfo células apoptóticas38.
  2. Pesar todos os camundongos (g) em uma escala e pesos de registro. Use o peso corporal para calcular o volume BAL (26,25 mL/kg de peso corporal).
  3. Coloc ratos em suas partes traseiras e pulverize o etanol 70% para esterilizar a área da caixa e da garganta.
  4. Faça um corte longitudinal de 2 "logo abaixo do esterno ao longo de todo o lado ventral com tesouras cirúrgicas, e segurando o esterno com fórceps, entalhe o diafragma para permitir que os pulmões caiam de volta na cavidade torácica.
  5. Corte lateralmente ao longo dos lados da caixa torácica para permitir que os pulmões mais espaço para expandir quando lavaging, em seguida, dobre a cavidade torácica para trás com fórceps.
  6. Faça um 1 "vertical cortado ao longo da vasculatura através do pescoço para expor a traquéia.
  7. Use dois fórceps para puxar o músculo e o tecido fora da traquéia e expô-lo. Evite sangramento potencial adicional e cortando a traquéia, uma vez que é cercado por vasculatura, músculos longitudinais e tecido conjuntivo.
  8. Use uma agulha para fazer uma fenda na traquéia (cerca de um quarto da distância para baixo da cabeça) e insira uma cânula (18 G x 1,25 ") com uma seringa pré-carregada com 1X PBS (26,25 ml/kg de peso corporal, ~ 0,7-1,0 ml em um 8-10 semana de idade fêmea C57Bl/6J mouse) caudalmente no Trac Hea.
  9. Empurre o volume de PBS para os pulmões lentamente para permitir que os pulmões para inflar, em seguida, puxe o volume de volta para a seringa. Repita este processo um total de 3 vezes.
  10. Colete o fluido de lavagem em pool de cada mouse específico em um tubo de 15 mL.
  11. Centrifugue o lavado broncoalveolar a 610 x g durante 6 min a 4 ° c e colete o sobrenadante num tubo de 1,5 ml e congele a-80 ° c. A pelota representa as células do espaço broncoalveolar.
  12. Remova os glóbulos vermelhos residuais no líquido coletado do BAL adicionando 1 mL do amortecedor do lysis de ACK RBC ao pellet de pilha, a seguir vórtice bem e lyse por 1 minuto no gelo. Depois, adicione 4 mL de PBS para interromper a reação de Lise.
  13. Células da pelota por centrifugação em 610 x g por 6 min a 4 ° c e aspirar o sobrenadante com um aspirador a vácuo.
  14. Reressuscitem as células em 1 mL de 1X PBS + 10% de FBS para cada tubo de amostra de LBA. Células da contagem em um hemocitômetro para a quantificação de pilhas totais do espaço aéreo de cada amostra (nenhum azul do Tripan). Centrifugue 120 μL de cada amostra em lâminas a 56 x g durante 3 min, utilizando uma aceleração média e um citocentrifugador. Seque os slides durante a noite.

5. cálculo do índice eferocítico do macrófago alveolar (dia 3)

  1. Manchar as lâminas com hematoxilina e eosina para permitir o cálculo de ambas as contagens de células eferocíticas e diferenciais, com pelo menos 200 células contados de cada slide.
  2. Ver slides uma configuração de campo brilhante em um microscópio biológico (um objetivo de 20x ou 40x funcionará melhor).
  3. Calcule o índice efferocytic baseado na relação do número de macrófagos alveolares que fagocitados células de Jurkat T do apoptóticas aos macrófagos alveolares sem captação apoptóticas da pilha fora de um total 200 macrófagos em uma corrediça do diferencial da pilha. Converta a proporção em uma porcentagem para a entrada de dados. Use a seguinte equação:

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Representative Results

O3 a exposição é conhecida por induzir inflamação e lesão pulmonar, e a eferocitose é necessária para manter a homeostase tecidual. Camundongos fêmeas C57BL/6J foram expostos ao ar filtrado (FA) ou 1 ppm O3 para 3 h e necropsiados 24 h pós-exposição para examinar a inflamação e lesão pulmonar. O camundongos expostos a3exibiu um aumento significativo nos macrófagos e neutrófilos no espaço aéreo em relação ao grupo controle FA (Figura 1a, B). Adicionalmente, os camundongos3expostos apresentaram aumento significativo da proteína Bal, marcador de disfunção da barreira epitelial alveolar 24 h pós-exposição (Figura 1C).

Para determinar se a inflamação pulmonar induzida por O3está associada a defeitos na efferocitose de macrófago alveolar in vivo, camundongos fêmeas C57Bl/6J foram instilado com células de T de Jurkat apoptóticas via aspiração orofaríngea 24 h pós-FA ou pós-O3 exposição. A apoptose nas células T de Jurkat foi confirmada por citometria de fluxo antes da dosagem, e houve aumento significativo nas células apoptóticas precoces (anexina V+ PI e tardia (anexina v+ e PI+) (Figura 2a, B). O nível de exposição e o tempo de incubação resultaram em resultados repetitivos de ~ 75% de células de Jurkat T de apoptótica. Uma imagem ampliada do que foi identificado como um macrófago eferocítico é mostrada na Figura 3A. Macrófagos eferocíticos foram identificados como macrófagos que haviam engolfado uma célula T de Jurkat (indicada por setas pretas), em comparação com os macrófagos alveolares regulares (indicados por setas brancas) (Figura 3B). Quando a eferocitose de macrófago alveolar foi avaliada utilizando o protocolo, houve uma diminuição estatisticamente significante no índice eferocítico do grupo O3exposto em relação aos controles de FA (Figura 3B, C). Esses dados indicam que a inflamação pulmonar induzida por O3está associada à diminuição da depuração de células apoptóticas, O que pode prolongar a lesão pulmonar e a inflamação.

Figure 1
Figura 1: O3 exposição induz inflamação e lesão pulmonar. Camundongos fêmeas C57BL/6J foram expostos ao ar filtrado (FA) ou 1 ppm O3 por 3 h. 24 h após a exposição, camundongos foram necropsiados para análise de inflamação e lesão pulmonar (n = 6 por grupo). (A) foram calculados os diferenciais da célula de lavagem broncoalveolar (LBA), então epitelial (EPI), eosinófilos (EOS), linfócitos (linfa), macrófagos (Mɸ) e neutrófilos (PMN) com pelo menos 200 células contados de cada lâmina. (B) uma imagem representativa de diferenciais celulares. (C) proteína total no líquido Bal. Os dados são expressos em ± SEM (* * p < 0, 1). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: confirmação da apoptose induzida por UV em células T de Jurkat. As células T de Jurkat foram expostas a UV (60 mJ/cm2) usando um crosslinker UV (modelo 1800). Após a exposição aos raios UV, as células de Jurkat T foram incubadas a 37 ° c com 5% de CO2 por 4 h. Após a incubação, as células de Jurkat T foram coradas com anexina V e iodeto de propiídio (PI), e a apoptose foi avaliada por citometria de fluxo. Células apoptóticas, apoptóticas tardias e necróticas precoces são identificadas como anexina V+/PI-, anexina v+/PI+, anexina v-/PI+, respectivamente. Parcelas de dispersão de citometria de fluxo representativa (com 10.000 eventos registrados) de (A) células T de Jurkat não expostas e (B) células de t de Jurkat expostasAUV. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: O3 exposição diminui a efferocitose alveolar do macrófago. Camundongos fêmeas C57BL/6J foram expostos ao ar filtrado (FA) ou 1 ppm O3 por 3 h. 24 h após a exposição, camundongos foram orofaringicamente instilados com aproximadamente 5 x 106 células apoptóticas de Jurkat T. 1,5 h após a instilação, o lavado broncoalveolar (LBA) foi realizado, e o índice eferocítico foi calculado em macrófagos de LBA por microscopia de luz após contagem de 200 macrófagos (n = 11 por grupo). A) imagem representativa de um macrófago efferocítico. (B) identificação de macrófagos alveolares (setas brancas) e macrófago eferocítico (setas pretas) após exposição de FA ou O3 . (C) cálculo do índice eferocítico após a exposição a FA ou O3 (* * * p < 0, 1). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 4
Figura 4: apoptose de células T de Jurkat suboptimal usando 350 nm lâmpadas geadas. As células T de Jurkat foram irradiadas usando o crosslinker UV por 10 min e incubadas a 37 ° c a 5% CO2 por 1 h. Após a exposição aos raios UV, as células de Jurkat T foram incubadas a 37 ° c com 5% de CO2 por 4 h. Após a incubação, as células T de Jurkat foram coradas com anexina V e iodeto de propiídio (PI), e a apoptose foi avaliada por citometria de fluxo. Células apoptóticas, apoptóticas tardias e necróticas precoces são identificadas como anexina V+/PI-, anexina v+/PI+e anexina v-/PI+, respectivamente. Parcelas de citometria de fluxo representativo (com 10.000 eventos registrados) de células de Jurkat T expostas a UV com bulbos de 350 nm são mostradas. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

A eferocitose é um processo anti-inflamatório no qual macrófagos Desobstruem células e detritos apoptóticos, bem como produzem múltiplos mediadores anti-inflamatórios9,10,11,12,16 ,18. Vários modelos de eferocitose forneceram uma visão de como o macrófago é uma célula crítica na resolução da inflamação6,7. Recentemente, a progressão das doenças pulmonares crônicas tem sido associada a defeitos de eferocitose8,9,15,16,17. No entanto, atualmente não está claro se a exposição a poluentes atmosféricos como O3, resulta em defeitos de eferocitose. Este protocolo permite a avaliação da efferocitose alveolar do macrófago após a exposição de O3 . Também quantifica a eferocitose in vivo usando microscopia de luz e permite a mensuração da eferocitose no contexto do microambiente pulmonar, sem manipulações ex vivo ou corantes fluorescentes dispendiosos. Embora este protocolo seja realizado no contexto da exposição O3 , vários modelos de inflamação e lesão pulmonar podem ser utilizados com este protocolo para avaliar a efferocitose alveolar do macrófago.

As vantagens deste método sobre os métodos existentes são a sua capacidade de analisar os macrófagos alveolares no contexto do ambiente fisiológico. A análise ex vivo de macrófagos alveolares inclui plaqueamento e incubação com células apoptóticas. O revestimento de macrófagos alveolares pode induzir alterações fisiológicas e genómicas que podem alterar a eferocitose28,29,30. Adicionalmente, no pulmão, existem macrófagos alveolares em um microambiente que contém surfactante e componentes do fluido de revestimento pulmonar que são conhecidos por influências da função macrófago31,32,33, 34,35. Nosso método permite medições de eferocitose no pulmão sem manipulações ex vivo, o que é mais fisiologicamente relevante. As aplicações futuras deste protocolo podem conduzir a uns estudos mais detalhados sobre como o microambiente do pulmão pode alterar o efferocytosis alveolar do macrófago.

Um componente crítico deste protocolo é a geração de células apoptóticas para avaliação da efferocitose de macrófago alveolar. Isso envolve a otimização do nível de exposição UV correto para induzir a apoptose, não a necrose. Nosso protocolo usa o chapéu cabeado UV com bulbos da emissão do comprimento de onda de 254 nanômetro e um nível da exposição de 60 MJ/cm2. As escolhas do bulbo UV são críticas em produzir o apoptosis, não a necrose. 350 nm lâmpadas UV são excelentes para a membrana proteica cross-linking e esterilização, mas não conseguem induzir a apoptose35,36,37. Um exemplo de gráfico de pontos de células de Jurkat T expostos a 60 mJ/cm2 com 350 lâmpadas nm é mostrado na Figura 4 com um aumento significativo nas células apoptóticas e necróticas tardias. Adicionalmente, o protocolo utiliza uma exposição pós-UV de incubação de 4 h. Para otimizar esta parte do protocolo, examinamos previamente vários tempos de incubação e descobrimos que 1,5 e 2 h de incubação pós-exposição só renderam aproximadamente 40% de apoptose, com um índice eferocítico inferior a 5% (dados não mostrados). Com base na literatura atual, ~ 70%-80% células apoptóticas totais são suficientes para medir a eferocitose38.

Uma limitação a este protocolo é que examina a resposta efferocytic de todos os macrófagos no espaço aéreo após a exposição da FA ou do O3 e não distingue macrófagos residentes do tecido dos macrófagos recrutados. O macrófago do residente do pulmão denominado o macrófago alveolar origina do fígado fetal, visto que os macrófagos recrutados derivam de uma origem embrionário sangue-carregada. Em cima de ferimento, o pulmão pode ter uma população altamente heterogênea do macrófago com genética e expressão originais de marcadores de superfície da pilha28,29,30,31,32, 33,34,35. Sabe-se que a resposta imunológica e a função dessas populações de macrófago são diferentes; Entretanto, estudos recentes indicaram que o macrófago residente tecidual tem maior resposta eferocítica em comparação aos macrófagos recrutados29,30,31. A determinação da resposta eferocítica de macrófagos residentes no tecido versus macrófagos recrutados pode ser avaliada com o protocolo atual; no entanto, as populações de macrófago precisam ser purificadas por FACS e banhadas em lâminas para análise. Adicionalmente, este protocolo avalia somente a função efferocytic do macrófago alveolar em uma tensão de ratos Inbred, comercialmente disponíveis. Tem sido relatado previamente que as tensões diferentes dos ratos mostram respostas diferentes à exposição do O3 , incluindo a inflamação pulmonaa39,40. Conseqüentemente, pode haver umas diferenças na macrófagos alveolar do macrófago baseada na tensão examinada. Esta é uma variável que deve ser considerada ao realizar este ensaio in vivo.

Em conclusão, o protocolo descrito acima permite a avaliação da efferocitose de macrófago alveolar in vivo. Este protocolo é rentável e simples, tornando-se um ensaio que pode ser amplamente utilizado. Além disso, este método pode ser aplicado a inúmeros modelos de lesão pulmonar e/ou inflamação para aumentar a compreensão de como vários insultos pulmonares podem alterar a efferocitose de macrófago.

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Disclosures

Os autores não declaram conflitos de interesse.

Acknowledgments

Este estudo é financiado pelo Health Effects Institute Walter A. Rosenblith Award e NIEHS R01ES028829 (para K. M. G). Gostaríamos de agradecer ao Dr. Dianne Walters (departamento de Fisiologia, ECU) por sua assistência com a obtenção de imagens representativas de macrófagos alveolares.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Annexin V-FITC Kit Trevigen 4830-250-K  The TACS Annexin V-FITC Kit allows rapid, specific, and quantitative identification of apoptosis in individual cells when using flow cytometry.
BCL2 Jurkat T Cells  ATCC ATCC CRL-2899 The BCL2 Jurkat cell line was derived by transfecting human Jurkat T cells with the pSFFV-neo mammalian expression vector containing the human BCL-2 ORF insert and a neomycin-resistant gene. Has been for models of measuring efferocytosis. 
Countess II Automated Cell Counter Thermofisher AMQAX1000 It is a benchtop assay platform equipped with state-of-the-art optics, full autofocus, and image analysis software for rapid assessment of cells in suspension. Very easy to use.
Cytospin 4 Cytocentrifuge Thermofisher A78300003 Provides economical thin-layer preparations from any liquid matrix, especially hypocellular fluids such as bronchoalveolar lavage fluid.
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated Thermofisher 16140071 Provides Nutrients to cultured cells for them to grow. It is standard for cell culture. 
Kwik-Diff  Reagent 2, Eosin Thermofisher 9990706 Eosin staining that stains cytoplasm.
Kwik-Diff Reagent 1, Fixative Thermofisher 9990705 Fixes cells to be stained by H&E.
Kwik-Diff Reagent 3, Methylene Blue Thermofisher 9990707 Methylene Blue staining that stains the nucleus.
Penicillin-Streptomycin Sigma/Aldrich P0781-100ML Penicillin-Streptomycin is the most commonly used antibiotic solution for culture of mammalian cells. Additionally it is used to maintain sterile conditions during cell culture.
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  Thermofisher 61870036 RPMI 1640 Medium (Roswell Park Memorial Institute 1640 Medium) was originally developed to culture human leukemic cells in suspension and as a monolayer. RPMI 1640 medium has since been found suitable for a variety of mammalian cells, including HeLa, Jurkat, MCF-7, PC12, PBMC, astrocytes, and carcinomas. Helps grow Jurkat T cells fast and efficiently.
Stratagene UV Stratalinker 1800 UV Crosslinker Cambridge Scientific  16659 The Stratalinker UV crosslinker is designed to induce apoptosis, crosslink DNA or RNA to nylon, nitrocellulose, or nylon-reinforced nitrocellulose membranes.
Teledyne T400 ultraviolet light photometer  Teledyne API T400 The Model T400 UV Absorption analyzer uses a system based on the Beer-Lambert law for measuring low ranges of ozone in ambient air.
Teledyne T703 Ozone calibrator Teledyne API T703 Provides feedback control of the UV lamp intensity, assuring stable ozone output.

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Imunologia e infecção edição 152 poluição atmosférica ozônio pulmão inflamação macrófago alveolar eferocitose
In vivo avaliação da Efferocitose de macrófago alveolar após exposição ao ozônio
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Hodge, M. X., Reece, S. W.,… More

Hodge, M. X., Reece, S. W., Madenspacher, J. H., Gowdy, K. M. In Vivo Assessment of Alveolar Macrophage Efferocytosis Following Ozone Exposure. J. Vis. Exp. (152), e60109, doi:10.3791/60109 (2019).

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