Denne protokollen demonstrerer induksjon av et hemogenic program i menneskelig dermal fibroblaster ved tvungen uttrykk for transkripsjon faktorer GATA2, GFI1B og FOS å generere blodkreft stilk og stamceller.
Den cellulære og molekylære mekanismer underliggende spesifikasjon av menneskelig blodkreft stamceller (HSCs) forblir unnvikende. Strategier for å recapitulate menneskelige HSC fremveksten in vitro er pålagt å overvinne begrensninger i å studere denne komplekse utviklingsprosessen. Her beskriver vi en protokoll for å generere blodkreft stem og stamfar-lignende celler fra menneskelig dermal fibroblaster ansette en direkte celle omprogrammering tilnærming. Disse cellene transitt gjennom en hemogenic mellomliggende celle-type, likner endothelial-til-blodkreft overgang (EHT) karakteristisk for HSC spesifikasjon. Fibroblaster ble omprogrammeres til hemogenic celler via Transduction med GATA2, GFI1B og FOS transkripsjon faktorer. Denne kombinasjonen av tre faktorer indusert morfologiske endringer, uttrykk for hemogenic og blodkreft markører og dynamisk EHT transcriptional programmer. Omprogrammeres celler generere blodkreft avkom og gjenbefolke immunodeficient mus i tre måneder. Denne protokollen kan tilpasses mot mekanistisk Disseksjon av den menneskelige EHT prosessen som er illustrert her ved å definere GATA2 mål i de tidlige fasene av omprogrammering. Dermed menneskelige hemogenic omprogrammering gir en enkel og medgjørlig tilnærming for å identifisere romanen markører og regulatorer av menneskelig HSC fremveksten. I fremtiden kan trofast induksjon av hemogenic skjebne i fibroblaster føre til generering av pasientspesifikke HSCs for transplantasjon.
Definitive blodkreft stem og stamceller (HSPCs) dukker opp i aorta-gonad-mesonephros (AGM) regionen og placenta fra endothelial forløpere med hemogenic kapasitet, gjennom en endothelial-til-blodkreft overgang (EHT)1, 2i det. Hemogenic forløpere (HPs) uttrykker både endothelial og blodkreft markører, men deres presise identifisering er fortsatt unnvikende, spesielt i det menneskelige systemet. Til tross for å være en relativt bevart prosess i pattedyr, blodkreft stem cell (HSC) utvikling fortsatt avviker betydelig mellom mennesker og mus modeller3,4. Derfor, in vitro tilnærminger til RECAPITULATE menneskelige HSC utvikling er nødvendig.
Differensiering av Pluripotent stamceller (PSCer) til HSCs, men lovende, har møtt begrenset suksess i løpet av de siste 20 årene, hovedsakelig på grunn av tilgjengelig differensiering protokoller, som resulterer i primitive blodkreft forfedre med dårlig engraftment evne5,6,7. Alternativt, direkte celle omprogrammering metoder har blitt brukt til å generere HSPC-lignende celler fra flere celletyper, ved hjelp av transkripsjon faktorer (TFs)8,9. Spesielt overuttrykte av tre TFs, Gata2, Gfi1b og cFos, konverterte musen embryonale fibroblaster til HSPCs gjennom en HP mellomliggende med en definert fenotype (Prom1 + SCA-1 + CD34 + CD45-)10. Denne prosessen lignet EHT som oppstår i fosteret og placenta, under spesifikasjon av definitive hematopoiesen. Dette fenotype aktivert identifisering og isolering av en befolkning på HPs i musen placenta at etter kortsiktige kultur og hakk aktivisering generert serielt transplantable HSCs11.
Så langt har ingen fenotype er fastslått at skiller menneskelige HSCs fra sine forløpere, men noen molekyler er kjent for å være uttrykt i nye HSCs. integrin Alpha 6 (ITGA6 eller CD49f) er svært uttrykt i langsiktige repopulating HSCs, den mest umodne celler i HSC kupé12, og angiotensin-konvertering ENZYM (ACE eller CD143) er til STEDE i CD34 negative blodkreft forløpere i embryonale blod-forming vev13.
Nylig har vi vist at menneskelige versjoner av de tre TFs, GATA2, FOS og GFI1B programmere menneskelige dermal fibroblaster (HDFs) i HPs med kortsiktig engraftment kapasitet14. I de innledende fasene av omprogrammering, GATA2 engasjerer åpne kromatin og rekrutterer GFI1B og FOS å undertrykke Fibroblast gener og aktivere endothelial og blodkreft gener. Indusert celler svært uttrykt CD49f og ACE, og inneholdt en liten prosentandel av cellene uttrykker HSPC markør CD34. Den CD9 genet, som er uttrykt i HSCs15 og er viktig for HSC homing16, ble vist å være et direkte mål på GATA2 og blant de mest opp-regulerte gener i omprogrammeres celler14. CD9 kan derfor utgjøre en ekstra markør for HPs av menneskets definitive hematopoiesen.
I denne protokollen beskriver vi generering av HSPC-lignende celler fra menneskelige fibroblaster gjennom tvungen uttrykk for GATA2, GFI1B og FOS, samt en tilpasset metode for kromatin immunutfelling (ChIP)-sekvensering (SEQ) analyse ved utbruddet av Omprogrammere. TFs ble kodet i en Doxycycline (DOX)-induserbart lentiviral vektor (pFUW-tetO) som inneholder en Tetracycline respons element (TRE) og en minimal CMV promoter, og ble transduced sammen med en konstituerende vektor inneholder omvendt Tetracycline transactivator protein (pFUW-M2rtTA). Når DOX (analog av Tetracycline) er lagt til etter Transduction, binder den til rtTA proteinet som samhandler med TRE tillater TF transkripsjon (tet-on system). Prosedyren krever 25 dager å fullføre. For ChIP-SEQ eksperimenter, HDFs ble transduced med merkede versjoner av GATA2 (pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2) og GFI1B (pLV-tetO-HA-GFI1B), pluss pFUW-tetO-FOS og TF binding nettsteder ble analysert to dager etter DOX kosttilskudd.
Til syvende og sist, hemogenic omprogrammering av menneskelig fibroblaster gir et in vitro medgjørlig system for å studere mekanismene underliggende menneskets utviklingsmessige hematopoiesen og en potensiell kilde til pasientspesifikke HSPCs for fremtidig klinisk anvendelse.
I denne artikkelen er en metode beskrevet for å generere blodkreft stamceller direkte fra menneskelig fibroblaster, som går gjennom en HP celle mellomliggende, på samme måte som definitive HSCs14.
Pool-produksjon av lentiviral partikler koding GATA2, GFI1B og FOS ble foretrukket over individuell produksjon, siden i våre hender det resulterer i høyere omprogrammering effektivitet (upubliserte data). Lentiviruses, som medlemmer av Retroviridae -familien, inneholder normalt to eksemplarer av positiv enkelt strandet RNA19. Den økte omprogrammering effektivitet kan skyldes pakking av to forskjellige transgenes i samme lentiviral partikkel, noe som resulterer i økt antall celler co-transduced med de tre transkripsjon faktorer. For å sikre suksess for denne protokollen, er det nødvendig å overfører HDFs med tilstrekkelig mengde virus avhengig av celle passasje for å få en optimal balanse mellom omprogrammering effektivitet og celle levedyktighet, som anbefalt i trinn 4,6. Dessuten, frisk ingen-konsentrerte viruser kan brukes. Det anbefales å overfører celler med 0,5-3 mL 3TFs basseng og M2rtTA. I tillegg bør celle tetthet justeres i henhold til programmet. 150 000 HDFs per 6-brønn plate (trinn 4,4) gitt optimal tetthet for å utføre FACS, transplantasjon og flyt flowcytometri analyse av omprogrammeres celler. For eksperimenter med ChIP-SEQ ble det krevd flere celler fra begynnelsen (trinn 5,1). Det er viktig å sjekke celler regelmessig for morfologiske endringer og erstatte blodkreft medium to ganger i uken for å støtte fremveksten av indusert blodkreft celler. Tilsetting av blodkreft cytokiner eller co-kultur i mater lag kan øke omprogrammering effektivitet.
Med denne metoden, kan vi identifisere nye blodkreft markører som er dynamisk uttrykt under hemogenic omprogrammering. CD9, som ble vist å være opp-regulert i omprogrammeres celler på transcriptional nivå14, er raskt uttrykt på celleoverflaten i de innledende fasene av omprogrammering sammen med CD49F og CD143, som fungerer som en ny markør for menneskelige HSC forløpere. Vi viser også at ITGA6 og ess er direkte mål for GATA2 under den innledende stadier av hemogenic omprogrammering, i tillegg til CD9 og CD3414, som gir en direkte mekanistisk kobling mellom menneskelig hemogenic forløperen fenotype og GATA2.
En fordel med dette systemet ligger i bruk av relativt homogene Fibroblast kulturer. Mens PSCer er lett utvides og vedlikeholdes in vitro, differensiering protokoller generere heterogene populasjoner som inkluderer blodkreft forfedre, som engraft dårlig5,6,7. Videre er det en risiko for tumorigenesis når transplantere PSC-avledet HSPCs, siden udifferensierte PSCer kan fortsatt være i kultur selv etter å ansette differensiering protokoller. Alternativt for å fibroblaster, direkte omprogrammering til HSCs har blitt brukt på blod-begått forfedre20 og endothelial celler21. Men starter med blod-begrenset stamceller hindrer terapeutisk anvendelse av den resulterende HSCs Hvis pasienten bærer mutasjoner som påvirker stammen/stamfar blodkreft befolkning22. I tilfelle av endothelial celler, disse er vanskeligere å oppnå i forhold til fibroblaster, og utgjør en svært heterogen celle befolkning i form av fenotype, funksjon og struktur, som er organ-avhengige23. Andre studier har lyktes i omprogrammering mus fibroblaster inn engraftable blodkreft forfedre24,25 ennå, så langt, ingen annen protokoll beskriver generering av HSPC-lignende celler fra menneskelige fibroblaster.
Denne tilnærmingen, kombinert med farmakologisk hemming, gen knock-out, eller knock-Down tillater å definere individuelle eller kombinasjon av faktorer som er nødvendige for å direkte indusere menneskelig HSCs. ansette høy effektivitet screening metoder basert på siste CRISPR-Cas9 teknologier i HDFs før omprogrammering, representerer en spennende oppgave for å definere romanen regulatorer av menneskelig definitive hematopoiesen. I fremtiden, omprogrammering ikke-blod relaterte menneskelige celletyper som fibroblaster vil tjene som en plattform for å generere sunne pasient-skreddersydd blodkreft stamceller for kliniske applikasjoner.
The authors have nothing to disclose.
Knut og Alice Wallenberg stiftelse, det medisinske fakultet ved Lunds universitet og region Skåne er anerkjent for sjenerøs finansiell støtte. Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra Olle Engkvists stiftelse (194-0694 til Filipe Pereira) og PhD stipend fra Fundação para a Ciência e Tecnologia (PTDC/BIM-MED/0075/2014 til Filipe Pereira, og SFRH/BD/135725/2018 og SFRH/BD/51968/2012 til Rita Alves og Andreia Gomes). Denne studien ble også støttet av midler fra NIH og NYSTEM (1R01HL119404 og C32597GG til Kateri A. Moore).
0.45 μm low-protein binding filter, 150 mL Bottle Top Vacuum Filter | Corning | #430625 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | #M6250 | |
Alexa Fluor 488 anti-human CD34 clone 581 | BioLegend | #343518 | |
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human Angiotensin Converting Enzyme (CD143) clone BB9 | BD Biosciences | #557929 | |
BES buffered saline | Sigma-Aldrich | #14280 | |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | #449709 | |
Centrifugal filter unit, Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | #UFC903096 | |
Dissociation solution, TrypLE Express Enzyme (1X) no phenol red | Gibco | #12604-021 | |
Doxycycline hyclate (DOX) | Sigma-Aldrich | #D9891 | |
eBioscience CD49f (Integrin alpha 6) Monoclonal Antibody (eBioGoH3 (GoH3)), PE-Cyanine7 | Invitrogen | #25-0495-82 | |
FUW-M2rtTA | Addgene | #20342 | |
Gelatin from Porcine Skin Type A | Sigma-Aldrich | #G1890 | |
Gibco L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | #25030-024 | |
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | #11140-035 | |
Hematopoietic medium, MyeloCult H5100 | STEMCELL Technologies | #05150 | |
Hexadimethrine bromide (polybrene) | Sigma-Aldrich | #H9268 | |
Human Dermal Fibroblasts (HDFs) | ScienCell | #2320 | |
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | GE Healthcare | #SH30243.01 | |
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | GE Healthcare | #SV30160.03 | |
HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution (Pen/Strep) | GE Healthcare | #SV30010 | |
HyClone Phosphate Buffered Saline solution (PBS) | GE Healthcare | #SH30256.01 | |
Hydrocortisone | STEMCELL Technologies | #7904 | |
Mouse serum | Sigma-Aldrich | #M5905 | |
PE anti-human CD9 Antibody clone HI9a | BioLegend | #312105 | |
pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2 | Addgene | #125600 | |
pFUW-tetO-FOS | Addgene | #125598 | |
pFUW-tetO-GATA2 | Addgene | #125028 | |
pFUW-tetO-GFI1B | Addgene | #125597 | |
pLV-tetO-HA-GFI1B | Addgene | #125599 | |
pMD2.G | Addgene | #12259 | |
psPAX2 | Addgene | #12260 |