Detta protokoll visar induktion av en hemogena program i human dermal fibroblaster genom påtvingat uttryck av transkriptionsfaktorerna GATA2, GFI1B och FOS för att generera hematopoietiska Stem och progenitorceller.
De cellulära och molekylära mekanismerna bakom specificering av humana hematopoetiska stamceller (HSCs) förblir svårfångade. Strategier för att recapitulate mänskliga HSC uppkomst in vitro krävs för att övervinna begränsningar i att studera denna komplexa utvecklingsprocess. Här, vi beskriver ett protokoll för att generera hematopoietiska Stem och stamceller-liknande celler från Human dermal fibroblaster anställa en direkt cell omprogrammering metod. Dessa celler transitering genom en hemogenic mellanliggande cell-typ, som liknar endothelial-till-hematopoietisk övergång (EHT) karakteristiska för HSC specifikation. Fibroblaster omprogrammerades till hemogenic celler via transduktion med GATA2, GFI1B och FOS transkriptionsfaktorer. Denna kombination av tre faktorer inducerade morfologiska förändringar, uttryck för hemogena och hematopoietiska markörer och dynamiska EHT transkriptionella program. Omprogrammerade celler genererar hematopoietisk avkomma och återbefolkar immunbrist möss i tre månader. Detta protokoll kan anpassas mot den mekanistiska dissektion av Human EHT processen som exemplifieras här genom att definiera GATA2 mål under de tidiga faserna av omprogrammering. Sålunda, mänskliga hemogena omprogrammering ger en enkel och tractable metod för att identifiera nya markörer och regulatorer av mänskliga HSC uppkomst. I framtiden kan trogen induktion av hemogena öde i fibroblaster leda till generering av patientspecifika HSCs för transplantation.
Slutgiltiga hematopoietiska stamceller och stamceller (hspcs) uppstår i aorta-gonad-mesonephros (AGM) region och moderkakan från endoteliala prekursorer med hemogena kapacitet, genom en endotelial-till-hematopoietisk övergång (EHT)1, 2. Hemogena prekursorer (HPs) uttrycker både endoteliala och hematopoietiska markörer, men deras exakta identifiering förblir svårfångade, särskilt i det mänskliga systemet. Trots att en relativt bevarad process hos däggdjur, hematopoietisk stamcells utveckling (HSC) fortfarande skiljer sig avsevärt mellan människor och musmodeller3,4. Därför behövs in vitro -metoder för att rekapitulera mänsklig HSC-utveckling.
Differentiering av pluripotenta stamceller (PSC) till HSCs, även lovande, har uppnått begränsad framgång under de senaste 20 åren, främst på grund av de tillgängliga differentierings protokollen, vilket resulterar i primitiva hematopoietiska progenitorer med dålig engraftelse förmåga5,6,7. Alternativt har direkta cell omprogrammering metoder tillämpats för att generera HSPC-liknande celler från flera celltyper, med hjälp av transkriptionsfaktorer (TFS)8,9. I synnerhet överuttryck av tre TFs, Gata2, Gfi1b och cFos, konverterade mus embryonala fibroblaster till HSPCs genom en HP-intermediär med en definierad fenotyp (Prom1 + SCA-1 + CD34 + CD45-)10. Denna process liknade EHT som förekommer i embryot och moderkakan, under specificering av definitiva hematopoies. Denna fenotyp möjliggjorde identifiering och isolering av en population av HPs i mus moderkakan som efter kortsiktig kultur och notch aktivering genererade seriellt transplanable hscs11.
Hittills har ingen fenotyp fastställts som särskiljer mänskliga hscs från deras föregångare, men vissa molekyler är kända för att uttryckas i framväxande hscs. integrin alpha 6 (ITGA6 eller CD49f) är starkt uttryckt i långsiktiga återinplantering hscs, den mest omogen celler i HSC-facket12, och angiotensinkonverterande ENZYM (ACE eller CD143) finns i CD34 negativa hematopoietiska prekursorer i embryonala blodbildande vävnader13.
Nyligen har vi visat att mänskliga versioner av de tre TFs, GATA2, FOS och GFI1B programmera Human dermal fibroblaster (HDFs) i HPs med kortsiktig inympningsförmåga kapacitet14. I de inledande faserna av omprogrammering, GATA2 engagerar öppna kromatin och rekryterar GFI1B och FOS för att förtrycka fibroblast gener och aktivera endoteliala och hematopoietiska gener. Inducerad celler högt uttryckt CD49f och ACE, och innehöll en liten andel av celler som uttrycker HSPC markör CD34. Den CD9 genen, som uttrycks i HSCs15 och är viktig för HSC homing16, visades vara ett direkt mål för GATA2 och bland de mest upp-reglerade gener i omprogrammerade celler14. CD9 kan därför utgöra en ytterligare markör för HPs av humant definitiv hematopoies.
I detta protokoll beskriver vi generering av HSPC-liknande celler från humana fibroblaster genom påtvingat uttryck av GATA2, GFI1B och FOS, samt en anpassad metod för analys av kromatin immunoprecipitation (ChIP)-sekvensering (SEQ) vid uppkomsten av Omprogrammering. TFs kodats i en doxycyklin (DOX)-inducerbar lentiviral vektor (pFUW-tetO) som innehåller en tetracyklinrespons element (TRE) och en minimal CMV promotor, och var omvandlades tillsammans med en konstitutiv vektor som innehåller omvänd tetracyklin transactivator protein (pFUW-M2rtTA). När DOX (analog av tetracyklin) tillsätts efter transduktion binder den till rtTA-proteinet som samverkar med den TRE som medger TF-transkription (tet-on-systemet). Proceduren kräver 25 dagar att slutföra. För chip-SEQ experiment, var HDFS sensorik med taggade versioner av GATA2 (pfuw-Teto-3xflag-GATA2) och GFI1B (PLV-Teto-ha-GFI1B), plus pfuw-Teto-FOS och TF bindnings platser analyserades två dagar efter DOX tillskott.
I slutändan, hemogena omprogrammering av mänskliga fibroblaster ger en in vitro -tractable system för att studera mekanismerna bakom mänsklig utveckling hematopoies och en potentiell källa till patientspecifika HSPCs för framtida klinisk tillämpning.
I denna artikel är en metod som beskrivs för att generera hematopoietiska stamceller direkt från mänskliga fibroblaster, som går igenom en HP cell Intermediate, på samma sätt som definitiva HSCs14.
Pool-produktion av lentivirala partiklar kodning GATA2, GFI1B och FOS var att föredra framför individuell produktion, eftersom i våra händer det resulterar i högre omprogrammering effektivitetsvinster (opublicerade data). Lentivirus, som medlemmar i familjen Retroviridae , innehåller normalt två kopior av positiva enkelsträngade RNA19. Den ökade omprogrammeringen effektivitet kan bero på förpackning av två olika transgener i samma lentiviral partikel, vilket resulterar i ökat antal celler Co-transduced med de tre transkriptionsfaktorerna. För att säkerställa detta protokolls framgång är det nödvändigt att transduce HDFs med adekvat mängd virus beroende på cell passage för att uppnå en optimal balans mellan omprogrammering effektivitet och cellernas lönsamhet, som rekommenderas i steg 4,6. Dessutom kan färska icke-koncentrerade virus användas. Det rekommenderas att transduce celler med 0.5-3 mL av 3TFs pool och M2rtTA. Också, celltäthet bör justeras enligt ansökan. 150 000 HDFs per 6-brunn plattan (steg 4,4) förutsatt att den optimala densiteten för att utföra FACS, transplantation och flödescytometri analys av omprogrammerade celler. För ChIP-SEQ-experiment krävdes fler celler från början (steg 5,1). Det är viktigt att kontrollera celler regelbundet för morfologiska förändringar och ersätta hematopoietiska medium två gånger i veckan för att stödja uppkomsten av inducerad hematopoietiska celler. Tillsats av hematopoietiska cytokiner eller co-kultur i matar skikt kan öka omprogrammering effektivitet.
Med denna metod kan vi identifiera nya hematopoietiska markörer som uttrycks dynamiskt under hemogena omprogrammering. CD9, som visades vara upp-reglerad i omprogrammerade celler på transkriptionella nivå14, uttrycks snabbt på cellytan i de inledande faserna av omprogrammering tillsammans med CD49F och CD143, som fungerar som en ny markör för mänskliga HSC-prekursorer. Vi visar också att ITGA6 och ACE är direkta mål för GATA2 under de inledande stadierna av hemogena omprogrammering, förutom CD9 och CD3414, vilket ger en direkt mekanistisk koppling mellan mänskliga hemogenic prekursor fenotyp och GATA2.
En fördel med detta system är bosatt i användningen av relativt homogena fibroblastkulturer. Medan PSCs lätt utökas och upprätthålls in vitro, differentierings protokoll generera heterogena populationer som inkluderar hematopoietiska stamceller, som att dåligt5,6,7. Dessutom finns det en risk för tumorigenes vid transplantation av PSC-derived HSPCs, eftersom odifferentierade gemensamma kontaktpunkter kan fortfarande kvar i kulturen även efter att ha anställande differentiering protokoll. Alternativt till fibroblaster, direkt omprogrammering till HSCs har tillämpats på blodengagerade stamceller20 och endotelceller21. Men, börjar med blodbegränsade stamceller hindrar terapeutisk tillämpning av de resulterande HSCs om patienten bär mutationer som påverkar stam/stamceller hematopoietiska befolkningen22. När det gäller endotelceller, dessa är svårare att få jämfört med fibroblaster, och utgör en mycket heterogena cellpopulation i termer av fenotyp, funktion och struktur, som är organ beroende23. Andra studier har lyckats omprogrammering mus fibroblaster i engraftable hematopoietiska progenitorer24,25 ännu, hittills, inget annat protokoll beskriver generering av HSPC-liknande celler från mänskliga fibroblaster.
Detta tillvägagångssätt, i kombination med farmakologisk hämning, Gene knock-out, eller knock-down tillstånd att definiera enskilda eller kombination av faktorer som krävs för att direkt inducera mänskliga HSCs. användning av metoder för effektiv screening baserad på CRISPR-Cas9 Technologies i HDFs före omprogrammering, representerar en spännande strävan för att definiera nya regulatorer av mänskliga definitiva hematopoies. I framtiden, omprogrammering icke-blodrelaterade mänskliga celltyper såsom fibroblaster kommer att fungera som en plattform för att generera hälsosamma patientanpassade hematopoietiska stamceller för kliniska tillämpningar.
The authors have nothing to disclose.
Knut och Alice Wallenbergs stiftelse, medicinska fakulteten vid Lunds universitet och Region Skåne är erkända för generöst finansiellt stöd. Detta arbete stöddes av ett bidrag från Olle Engkvists stiftelse (194-0694 till Filipe Pereira) och doktors stipendier från Fundação para a Ciência e Tecnologia (PTDC/BIM-MED/0075/2014 till Filipe Pereira, och SFRH/BD/135725/2018 och SFRH/BD/51968/2012 till Rita Alves och Andreia Gomes). Denna studie stöddes också av fonder från NIH och NYSTEM (1R01HL119404 och C32597GG till Kateri A. Moore).
0.45 μm low-protein binding filter, 150 mL Bottle Top Vacuum Filter | Corning | #430625 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | #M6250 | |
Alexa Fluor 488 anti-human CD34 clone 581 | BioLegend | #343518 | |
BD Pharmingen APC Mouse Anti-Human Angiotensin Converting Enzyme (CD143) clone BB9 | BD Biosciences | #557929 | |
BES buffered saline | Sigma-Aldrich | #14280 | |
Calcium chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | #449709 | |
Centrifugal filter unit, Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit | Sigma-Aldrich | #UFC903096 | |
Dissociation solution, TrypLE Express Enzyme (1X) no phenol red | Gibco | #12604-021 | |
Doxycycline hyclate (DOX) | Sigma-Aldrich | #D9891 | |
eBioscience CD49f (Integrin alpha 6) Monoclonal Antibody (eBioGoH3 (GoH3)), PE-Cyanine7 | Invitrogen | #25-0495-82 | |
FUW-M2rtTA | Addgene | #20342 | |
Gelatin from Porcine Skin Type A | Sigma-Aldrich | #G1890 | |
Gibco L-Glutamine (200 mM) | ThermoFisher Scientific | #25030-024 | |
Gibco MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X) | ThermoFisher Scientific | #11140-035 | |
Hematopoietic medium, MyeloCult H5100 | STEMCELL Technologies | #05150 | |
Hexadimethrine bromide (polybrene) | Sigma-Aldrich | #H9268 | |
Human Dermal Fibroblasts (HDFs) | ScienCell | #2320 | |
HyClone Dulbecco's Modified Eagles Medium (DMEM) | GE Healthcare | #SH30243.01 | |
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | GE Healthcare | #SV30160.03 | |
HyClone Penicillin Streptomycin 100X Solution (Pen/Strep) | GE Healthcare | #SV30010 | |
HyClone Phosphate Buffered Saline solution (PBS) | GE Healthcare | #SH30256.01 | |
Hydrocortisone | STEMCELL Technologies | #7904 | |
Mouse serum | Sigma-Aldrich | #M5905 | |
PE anti-human CD9 Antibody clone HI9a | BioLegend | #312105 | |
pFUW-tetO-3xFLAG-GATA2 | Addgene | #125600 | |
pFUW-tetO-FOS | Addgene | #125598 | |
pFUW-tetO-GATA2 | Addgene | #125028 | |
pFUW-tetO-GFI1B | Addgene | #125597 | |
pLV-tetO-HA-GFI1B | Addgene | #125599 | |
pMD2.G | Addgene | #12259 | |
psPAX2 | Addgene | #12260 |