Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

ウサギにおける完全なダクリオアデネクトー切除術を用いた重症ドライアイモデルの確立

doi: 10.3791/60126 Published: January 8, 2020

Summary

すべての眼窩涙腺を外科的に除去することによってウサギの慢性ドライアイ病を誘発する新しいアプローチが提示される。この方法は、以前に報告されたものとは異なり、涙液生理学および病態生理学および眼科治療の研究に適した水性欠乏ドライアイの安定した、再現可能なモデルを生成する。

Abstract

ドライアイ病(DED)は、複数の病因と可変症状を有する複雑な疾患であり、その主要な病態生理学的ステップとして眼表面炎症を有する。DED に対する理解の進歩にもかかわらず、重要な知識ギャップは残っています。進歩は、有益な動物モデルの欠如のために部分的に制限されています。著者らは最近、レクチンコンカナサリンAにすべての眼窩涙腺(LG)組織を注入することによって誘導されるDEDの方法について報告した。ここでは、すべての眼窩LG(ダクリオアデネクトーミー)組織の外科的切除に基づく水性欠乏DEDの新規モデルを報告する。どちらの方法も、眼表面の大きさや構造の点で人間の目に類似しているため、ウサギを使用します。ニチッティング膜を除去した1週間後、眼窩上優性LGは麻酔下で外科的に除去され、次いでパルペブラル優れたLGを除去し、最終的に下のLG.ダクリオアデネクトーマイムを除去した重度のDEDを誘発し、によって示される涙分裂時間試験とシルマーの涙試験の減少を顕著に示し、涙液の浸透性と上昇ベンガル染色を有意に増加させた。ダクリオアデネクトーミー誘発DEDは少なくとも8週間続いた。合併症はなく、動物は手順を十分に許容しました。この技術は、適切な外科的経験と関連するウサギの解剖学の感謝を持つものによって比較的容易に習得することができる。このモデルはヒト水性欠乏DEDの特徴を再現するので、眼表面恒常性、DED、および候補治療薬の研究に適している。

Introduction

涙は、眼表面の保護と角膜の光学特性の維持のために必要とされます。それらは3つの層からなる:内側のムチンコーティング、中央水性成分および脂質オーバーレイ1。ムチン層は、主に結膜のゴブレット細胞において産生され、主に涙腺(LG)における水性成分、及びマイボミアン腺1、2において主に脂質層である。軌道LGは、涙の水性成分と細菌発作から表面を保護するタンパク質の多くのための主な供給源である3.水性涙液産生が臨界レベル以下に減少すると眼表面疾患が生じ、成長因子、リソザイム、ラクトフェリンを含む水成分および重要な涙成分の眼の上皮表面を奪う。LGによる涙液産生の減少の場合、結膜組織および角膜組織は、変化した環境を補償するために適応を受ける。

軌道LCに由来する涙成分の寄与と眼表面の補償機構を理解することは、眼の前部セグメントの生理学的および病態生理学、そしてより広く、地球全体の健康と疾患に対する我々の理解に影響を与える。これらの問題に対する実験的アプローチには、有益な動物モデルが必要です。その結果、いくつかのグループは、軌道LGを除去する動物モデルの開発を試み、それによって眼の健康における涙の役割の評価を促進する。そのようなモデルの1つは、マウス4について最近報告されました。しかし、ウサギは、LGの類似した解剖学的および組織学的構造を含むげっ歯類モデルに対する多くの明確な利点を提供し、そしておそらくより重要なのは、彼らのヒトの対応する3と比較した場合、角膜および結膜組織の同様の大きさおよび表面積である。

ウサギにおけるLG組織の外科的切除による水性欠乏性ドライアイ病(DED)の作成は新しいものではない。多くの報告は、シルマーの涙試験5、6、7、8によって測定される涙産生の可変変化に反映される様々な成功を有するLG組織の切除を記述する。ウサギの関連する解剖学の完全な理解と解剖学的用語についての明確さは、この方法を再現するのに非常に役立ちます。両方の詳細な概要を以下に示します。

涙腺の解剖学

ウサギは2つの軌道LGを持っています:より大きな劣ったLG(ILG)と小さい優れたLG(SLG;図 1)。ILGは、軌道リムの下側および後部の側面に沿って延びる。可変サイズを除き、ILGの前部は、地球の下の皮膚の突起として見ることができるかなり均一な球状の外観を有する(図2)。腺の残りの部分に関連してその特徴的な外観のために、それはILGの「頭」と呼ばれています。頭部の一部は周りを包み、頬骨の外面に横たわっている。これは、ILGに注射を導くために超音波バイオ顕微鏡の有用なランドマークとして機能します。頭部の残りの部分は軌道のより多くの中間の9を存在する。

ILGの残りの部分の特徴的な外観は、長くて薄いため、このセグメントは「尾」と呼ばれます。尾部は、ILGの頭部から軌道リムまで、下側および後眼窩リムで可変解剖学で終点する下軌道リムに沿って走る(3A)。尾部は、軌道上の後部リムに到達するまで、そのコースの大部分の筋バンドによって軌道の内容から分離された頬骨の深部(中間)に位置し、再び頬骨の外面上に伸びる。ILGは頸動脈の枝から血液供給を受ける。

SLGは人間に類似した2つの成分を有する。1つは、上部後眼瞼内側に座るパルペブラル優れたLG(PSLG)で、歯座板の内側に存在します。それは自然界で球状に見え、2%フルオレセインで覆われたときにより容易に見られる水性涙液を排出する多数の穿刺口を有する(3B)。

2つ目は軌道上優れたLG(OSLG)で、上軌道上の内側の位置に位置しています(図3C)。頭蓋骨の中間線付近の位置のために、側軌道または下軌道からの外部外科的アプローチを使用して正常にそれを識別することは不可能であった。新鮮な壊死サンプルまたは外科的症例では、この腺は、穏やかな内側圧が地球に加えられたときに、頭蓋骨の後面に位置する後部の腸管を通って脱出することができる。この腺組織の脱出は、超音波バイオ顕微鏡で文書化することができる。

PSLG と OSLG は連続した構造です。OSLGは管状の建築が主要な排泄管に合体する管状の花取り構造である。このダクトは、上軌道尾根の下を通過し、PSLGで終わる上部蓋組織で実行されます。排泄管に沿って、デイビスの元の説明と一致する腺組織が10を同定した(3D)。

用語に関する注意事項

優れた包括的な解剖学的記述は、さまざまな用語も使用します。デイビスによる古典的な軌道解剖学は、上下のLG10のみを定義します。しかし、上のLGの彼の記述は、PSLGとOSLGとしてここでより具体的に定義された部分を明確に詳細に説明し、下のLGの彼の記述は、ILGの頭と尾としてここで定義された部分を詳細に説明します。より最近かつ徹底的な解剖学的アトラス11は、これらの組織を頬骨腺および付属LGとして定義する。用語「涙腺」は、前述のPSLGおよびOSLGを含むためにここで使用される。この用語は、過度の混乱なしにこの方法を再現する場合に適しています。

Protocol

すべての脊椎動物の動物研究は、すべての関連する規制および制度ガイドラインに従って完了しました。すべての研究は、ストーニーブルック大学の機関審査委員会によって承認され、眼科および視覚研究における動物の使用のための視覚眼科学研究協会(ARVO)声明に従って行われました。

1. 動物・住宅

  1. 2−3 kgのニュージーランドホワイト(NZW)ウサギを使用してください。
  2. 厳密に管理された環境で個別にウサギを収容する:温度(65 ±5 °F)、湿度(45 ±5%)、照明(12時間オン/オフサイクル)。
    注:グループハウスであるウサギの間でしばしば示される攻撃的な行動のために、不注意な眼の傷害を防ぐために個々のケージに動物を保ちます。
  3. ウサギは、標準的なウサギのチョウと水への無制限のアクセスを与えます。
  4. ドライアイに影響を与える可能性のある不注意なビタミンA補給を防ぐために、他の食事濃縮を提供しません。
  5. DEDパラメータを記録する前に少なくとも2週間の慣性ウサギ。

2. ニチタチブ膜の除去

注:わかりやすくするために、右目のテクニックを以下に説明します。左目のこの手順を同じ方法で実行します。

  1. 順応期間中(通常は最初の週)に両側にニチカチ膜を取り除きます。
  2. ウサギを適当な大きさの拘束袋に入れます。
  3. 1ccシリンジと26G針を使用して肩にアセプロマジン(1mg/kg)の皮下注射を投与し、ウサギを鎮静させる。この穏やかな沈下の終点は、動物が正常な走査運動なしでリラックスした頭部位置を維持し、その耳が完全に直立していない場合である。
  4. マイクロピペットを使用して、防腐剤フリーリドカインの25°Lを適用する(1%)目に。まぶたの間にワイヤー蓋の鏡を挿入します。
  5. 頂点のニチタチカチ膜を0.3鉗子(または同等)で把握し、角膜表面上に引っ張ります。1%リドカインに1:100,000エピネフリンを注入し、26G針を用いてニチッティング膜の結膜下膜に挿入する。約0.3mLを注入して、ニチタリング膜の上に控えめなサイズのブレブを形成します。1 mL 以上の注射量は、ウサギの安全な用量範囲内 (2-4 mg/kg) です。
  6. ワイヤスペクトルを取り外します。リドカインとエピネフリンが有効になるまで約5分間待ちます。この間、仲間の目で同じ手順を実行します。
  7. ワイヤーふたの鏡を交換してください。0.3鉗子を使用して角膜表面上のニチタリング膜をつかみ、伸ばします。膜をその基部で、解膜はさみまたは同等のもので切断します。
    メモ:通常、出血は最小限ですが、高温のバッテリー焼灼ユニットを近くに保管し、必要に応じて使用して出血を最小限に抑えます。ニチタチ膜の切断ベース上の直接圧力は、それが発生した場合に小さな出血を止めるために使用することができます。
  8. ワイヤーふたの鏡を取り外します。角膜表面に局所抗生物質軟膏(ネオマイシン、ポリミキシン、バチトラシン、ヒドロコルチゾン)を置きます。
  9. プロトコルで示されているように、仲間の目と同じ手順を実行します。
  10. 動物を個々のケージに戻し、少なくとも1週間、または結膜表面が臨床的な観点から完全に治癒するまで、さらなるアッセイまたは介入を行う前に、動物を治癒させる。
    注:完全な臨床治癒は、結膜表面からの腫脹、注射または排出の欠如によって示される。動物は保護性の下手を持たずに、目を正常に開けておくべきである。

3. ドライアイパラメータの測定と涙液サンプルの採取

  1. 実験プロトコルに応じて、次のDEDパラメータを測定します:涙浸透圧、涙分解時間、シルマーの涙液試験、およびローズベンガル染色。少なくとも2人の調査員のチームで、前述の12のようにそれらを実行します。
    注:少なくとも2人の調査者のチームは、同じクロック時間の周りに動物のより大きなグループ(6以上)の効率的な測定を可能にし、結果に影響を与える可能性のある概日変動を防ぐことができます。

4. 外科的準備と麻酔

  1. 上記のように皮下アセプロマジン(1mg/kg)で拘束袋に入れた動物を軽く沈静化させる。
  2. 外科的ランドマークを視覚化するために、頭蓋骨の顔と後ろ面上のすべての毛皮を削除します。
    1. 長さ約1mmの残留微細ファーを残した切断せん断で毛皮をトリムします(図4A、左)。
    2. 製造元の指示に従って、軽度の脱毛クリームを使用してすべての残留ファーを取り除きます(図4A、右)。
  3. 手術用ペンで外科的切開部位をマークします。
    1. OSLGの脱出から後部の発裂の上に皮膚に小さな膨らみが発生する原因となる内側の切圧を地球に適用することによって、後部の切開部位を特定する。
    2. 外科マーキングペンで頭蓋骨の背中の表面の上の皮膚の前/後方向に直線的な2cmのマークを作ります。
    3. ILGの除去のための切開を計画する場合、眼の周りに長い曲線線(下側および側頭蓋のマージンから1cm)を前軌道(中間)に延びるマークを付ける。マーキングを後軌道に沿って内側の軌道に沿って内側のカンサスのレベルまで延ばすか、これより優れているようにします(図4B)。一部のディスセクションでは、OSLGとILGを除去するための切開が接続されます。
      注:二国間手術を行う場合は、この時点で両方の軌道に印を付けます。
  4. 各大腿の側面にせん断をかけて幅2~3cmの毛皮のパッチをトリムし、単極焼灼板を配置できるようにします。
    1. 超音波ゲルを適用して、単極焼灼板との良好な電気的接触を確保します。
  5. 必要に応じて、耳の限界静脈の1つに25G静脈内(IV)カテーテルを置き、薬物または液体を投与する。
  6. 皮下キシラジン(1mg/kg)とIVケタミン(15 mg/kg)を麻酔の初期誘導(IVアクセスを介して)を与える。
    注:ウサギがステップ2.3で説明したエンドポイントを保持するのに十分なアセプロマジンで事前に鎮静されている場合は、代わりにアイソフルランでガスマスク鎮静を使用してください。
  7. 弾性バンドまたは弦を使用して、喉頭マスク気道を所定の場所に配置し、気道を固定および維持します。
    1. 1 L/分に設定された酸素流量でマスクを麻酔機に接続します。
    2. イソフルランを最初に5%に設定し、動物の沈み込みのレベルに基づいて許容されるほど減らします。
    3. 最終的な創傷閉鎖まで2%以上でアイソフルランを維持する。
      注:外科的または痛みを伴う刺激に応答して呼吸数と動きを監視することにより、沈下のレベルを評価します。呼吸数が毎分10回以上増加した場合、ウサギが気道維持装置で噛み始めた場合、または痛みを伴う刺激に反応して何らかの動きが観察される場合は、麻酔の深さを増加させる。
  8. 多パラメータ監視装置または他の適切な装置を使用して、パルスオキシメトリー、カプノグラフィー、血圧、直腸体温および心拍数を監視する。
    1. 処置の間に連続的に生命を監視し、10から15分ごとに記録する。
  9. 低体温を防ぐために、手術室(OR)テーブルの上にウサギを暖房パッドの上に置きます。出血を最小限に抑えるために、約30°で逆トレンデレンブルクの位置にテーブルを傾けます。
  10. 滅菌場を維持するために、滅菌水とドレープで半分強度に希釈したポビドネヨウ素溶液で手術領域を準備します。

5. 完全な外科的ダクリオアデネクトー切り

注:本明細書に記載されているように、完全な外科的ダクリオアデネクトーミーは、0.3組織鉗子、歯切りはさみ、歯のない組織鉗子およびはさみを用いて行われた。これらの器械は外科医の好みに基づいて同じ機能を行う同様の器械と交換することができる。

  1. 最初に OSLG を取り外します。
    1. 切開部位(外科マーキングペンラインと上後蓋)に、2%リドカインと1:100,000エピネフリン、0.5%ブピバカインを30G針で5ccシリンジを用いて50:50混合物で浸潤部位(図5A)に浸潤する(図5A)。
      メモ:注射器と針のサイズは重要ではありません。
    2. 電気手術ユニットに接続されたコロラド針を使用して、外科的マーキングに沿って皮膚切開を行います。設定は臨床応答に基づいて異なり、通常は切断と凝固の両方で10〜15単位の間です(図5B)。
    3. 皮膚切開部全体に反対の緊張を加えて組織を分離し、下層前頭角筋線維を露出させる。
    4. 前頭角筋線維の内側または深さに位置する膨らんだ組織として見られるOSLGの可視化を支援するために、地球上の内側圧を適用します。必要に応じて、これらの筋線維を側面に移動して、基礎となるインシストを公開します。
    5. 歯付き鉗子(0.3)とカプロートミーハサミで、OSLGの上に上にある繊維状のカプセルをやさしく引き込み、切断します。OSLGは通常、淡い日焼け色をしています(図5C)。
    6. 歯付きまたは歯のない鉗子を使用して、OSLG腺組織をつかみ、「手渡し」技術を使用して優れた熱心な介動を通してそれを引き出します。カプロートミーはさみを使って小さな繊維状バンドをカットし、軌道上のその位置から腺を解放します(図5D)。
      注:OSLG腺組織が除去されると、それは大きなチューブ状の構造(主な排泄管)に合体し始めます。
    7. 腺が可能な限り完全に除去されたら、コロラド針で寛大な焼灼を使用して組織のチャールを作成し、可能な限り深く内側の亀頭の中で腺を切り捨てる。これは後にPSLGの除去中に確認ランドマークとして機能します.
  2. PSLG を削除します。
    1. 綿の先端のアプリケーターを使用して上まぶたをエフォートします。PSLGの球根端は通常容易に見える。
      注:一部の解剖学的解剖では、主排泄管を幅約1または2mmの淡い線形構造として可視化することができる場合がある。
    2. PSLGを歯付き鉗子(0.3)で係合し、カプロートミーはさみを使用して基底から歯根を分離するベースを切断しながら、まぶたの表面から引き込みます(図6A)。
    3. 単極焼灼で中等度の出血を制御する。
    4. 分離された組織に連続的な牽引を適用して解剖のための組織面を維持する。これにより、SLGの主要な排泄管も取り除くことを可能にします(図6B)。
      注:解剖が行われるように、それは通常、より優れた、中間的に位置するOSLGの除去から残された焼灼マークを見することができる上軌道リムに進みます。
  3. ILG を切除します。
    1. 局所麻酔薬が有効になるまで少なくとも5分間待ちます。
    2. 皮膚を切開し、下手根のうつ病筋、頬骨筋の頬骨室下部、およびコロラドマイクロセクション針を用いた口内筋と、セクション5.1のOSLGに対して分離する。
    3. 単極焼灼で止血を維持する。
    4. 切開は皮膚のマーキングを通して深く運ばれるので、マセッター筋肉の頬骨または表面的な部分の上に面膜の光沢を探します。この時点で、組織面を維持し、コロラド針を使用して軌道リムに向かって優れた搬下を行います(図7A)。
      メモ:ILGを識別する目的で、通常は眼の前肢よりも劣るILGの頭部の上に解剖のこの部分を実行するのが最も簡単です。
    5. ILGを取り囲むカプセルを同定して切開した後、ILGの日焼け組織を同定する。ILG ヘッドの前部のみが表示されます (図 7B)。ただし、頭部は、頬骨アーチの下を通過し、尾部に遷移する中間に従うことができる(図7C)。
    6. 腸切りはさみを使用して、ILGテールのより後部を露出させる下縁に沿って眼窩中隔を切断します。組織面が特定されたら、切開線全体に沿って解剖を後部に延長する(7D)。
      注:ILGのダクトは、蓋の側頭部の下側結膜空間に入るために、下部線維結合組織を通過します。後部リムでは、ILGの尾部は様々な解剖学的構成を有することができる。時には後部(横)缶に劣って終わることがあり、他のセクションでは時間軌道の周りにより優越して延びる。
    7. ILGが頸動脈の枝から受け取る血液供給への不注意な損傷を防ぐために細心の注意を払う。血液供給は解剖のこの部分の間に見ることができます (図 7E) 。
    8. 尾が後部(横)の下で終発する場合、頬骨に沿って位置するILGの尾部を露出させるために、前皮筋の側頭部分を二分する必要がある場合がある。
    9. ILG 全体が分離され、公開されたら、削除します。サイズが大きいため、はさみで半分に切り、尾から離して頭部を取り除くことが好ましいことが多い。
    10. ILGの頭部を取り外すときは、軌道上の大きな静脈の静脈にすぐ隣接しているので、非常に慎重に進んでください。外科的切除中にこの構造からの出血は起こっていないが、このリスクを軽減するために十分な止血補助具が存在する。
    11. すべての腺組織を除去した後、複数の中断された5-0エチレンテレフタル酸縫合糸で深い結合組織面を閉じます。0.3組織鉗子と針ドライバーを使用して、6-0ポリラクチン910縫合糸(図7F)を実行して表面的な筋肉と皮膚を閉じます。

6. 手続き後のケア

  1. 動物を解凍し、滅菌水で手術部位を浄化します。
  2. 切開部に局所眼科用抗生物質とステロイド軟膏(ネオマイシン、ポリミキシン、バシトラシン、ヒドロコルチゾン)を塗布する。このアプリケーションを 1 日 2 回 2 日間継続します。
  3. 26 G針を使用して、肩甲骨の上に20 mLの正常な生理行物の皮下注射を与えます。
  4. 皮下ブプレノルフィン0.01 mg/kgまたはケトプロフェン3 mg/kgを与え、1ccの注射器と30 G針を使用して疼痛制御を行う。
    注:動物は1-2日以内に通常の食事摂取量と活動に戻る必要があります。ウサギは、進行性の腫脹、痛み、紅斑、カロリーまたは化膿性分泌物によって示されるように、感染の臨床徴候について少なくとも毎週評価されるべきである。動物はまた、切開部位/縫合線を傷つけ始めないように観察する必要があります。ダクリオアデネクトーシス切除前にすべての爪をトリミングすることは、この点で役立つかもしれません。切開線の引っ掻き傷が見られる場合は、自傷行為を防ぐために標準的な保護首輪が使用される。
  5. 麻酔を逆にします。
    1. 動物が刺激に反応し、自発的な噛み付きが現れ始めた後、気道メンテナが損傷する前に気道維持装置を取り外します。
    2. およそ1−2時間、またはケージ内の自発的な動きによって示されるように麻酔から完全に回復するまで、動物を監視する。
    3. 動物の痛みを評価し、適切に治療します。
  6. DEDの臨床対策を行う前に、手術後少なくとも1週間は動物を回復させてください。

Representative Results

ここで説明する完全なダクリオアデネクトーミー法を8匹に対して行った。それは外科的な技能の適度な程度を要求する。二国間手術の手術時間は平均約2.2時間で、別々に行われ、<10分を必要とするニチタリング膜の除去を除いた。死亡者や術中の合併症はなく、ウサギは控えめな焼灼以外の止血援助を必要としなかった。

私たちの外科的アプローチは、すべての目にドライアイを誘発することに成功しました。これは、DEDの臨床マーカーおよび検査マーカーのパネルによって確認された(表1)。観察の8週間の間に、平均TBUTは術前レベルの75%以上(すべての時点でp< 0.0001)によって抑制された。同様に、シルマーの涙試験は約50%減少し、8週間の観察のために残った。フォローアップ期間中は回復の傾向を示さなかった。術後、涙浸透圧はDEDと一致する10%の増加を示し、術後に少なくとも8週間持続した。角膜のローズベンガル染色も増加し、フォローアップの8週間の間に回復の兆候を示さなかった(図8)。完全なダクリオアデネクトーミーを受けているすべての眼は、ゴブレット細胞数およびドライアイと一致する上皮変化(結膜印象細胞学)の顕著な減少を示した。

Figure 1
図1:ウサギの涙腺解剖学(右目)。軌道上涙腺(OSLG)は、より大きな軌道部分およびより小さいパルペブラル成分から成っている。より大きい下側涙腺(ILG)は前部/頭部および後部/尾部から成っている。座標軸は、テキスト内で使用される方向のすべての説明に使用される用語を示します。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 2
図2:ILGの頭部の位置毛皮を取り外した後の右顔の横図。前軌道に劣る皮膚輪郭(太い矢印で示される)の膨らみは、この位置の頬骨の外面にあるILGの頭部の位置を示す。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 3
図3:眼窩涙腺(A)エバンスブルー色素で染色した後の右下涙腺(ILG)は、ILG(赤い矢印)の尾部の近接を示すだけで、頬骨(黒い矢印)に中間し、地球に劣る。(B)パルペブラル上立涙腺(PSLG)からの涙液産生。2%フルオレセインの局所適用後に撮影されたタイムラプス写真。PSLGから発する水性流体は、最初は濃い青色または黒色のフルオレセイン色素を薄くし、明るい黄色の緑色に変えます(ザイデル試験と同様)。(C)ウサギ頭蓋骨における軌道SLG(OSLG)の位置は、後部裂性内の頭蓋骨の中間線(点線)の近くに横たわっている(矢印)。エバンスブルー染料をOSLGおよびパルペブラル上立涙腺に注入した。(D)少量の腺組織(矢印)に囲まれたOSLGの主な排泄管を介した組織学セクションは、右上まぶたの後部(側頭)を通して採取されたヘマトキシリンおよびエオシン色素で染色されたこの組織病理学的断面に見られる。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 4
図4:手術部位の準備(A) 左上パネル: せん断付きの長い毛皮の除去。すべての残留細かい毛皮は、その後、軽度の脱毛クリームで除去されます。右上パネル:ILGの外科的マーキングおよび高品質超音波を行うことを可能にする完全な毛皮の除去に続く最終的な出現。(B)右眼窩周囲領域の適切な外科的マーキングが示されている。この例では、OSLGとILGを除去する切開部が接続されており、1つの長い曲線切開を作成しています。後部切賦の位置は、曲線切開部のマーキング上の小さなハッシュ記号で示されます (矢印)。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 5
図5:OSLGの取り外し(A)外科部位は、1:100,000エピネフリンと0.5%ブピバカインを用いた2%リドカインの50:50の組み合わせを使用して麻酔薬で浸潤され、処置中の不快感を最小限に抑えるために上部蓋に注入され、切開線に沿って注入される。(B)コロラド州の微小解剖針は、事前にマークされた外科的切開部位に沿って皮膚および表面的な筋肉層を切開するために使用される。創傷全体の穏やかな牽引は解剖面を作成するのを助けるために適用される。小さなピンポイントの火傷(矢印)は、創傷閉鎖中に組織を最適に再調整するのに役立つ切開線に沿って等距離の点でコロラド針で作られました。(C)OSLGは、後部の裂け目の上に覆われた組織が動員された後に露出される(矢印)。腺のカプセルが切開されました。OSLGは、その除去を容易に地球に中間圧力を加えることによって脱出することができる。(D)鉗子はOSLGに関与し、後部の扇力を通して軌道内のより深い位置からそれを穏やかに取除くために使用される。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 6
図6:手のひら上涙腺(PSLG)および排泄管の除去。(A)上まぶたの反転に続いて、PSLGの球根部分は鉗子に従事し、はさみを使用して歯皮を解剖する。鉗子がPSLGに適用される牽引は外科用平面を維持するために重要である。(B)PSLGおよび主涙管の解剖は、適切な手術面を維持するために、腺および管組織上の鋭い解剖および連続的な牽引を使用して軌道縁に向かって優れた運搬される。解剖は、OSLGが取り外された時点まで進む必要があります。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 7
図 7: ILG の削除(A)皮膚および表在筋は、マセッター筋の頬骨または表面的な部分を覆う筋膜面に達するまで切開される。ILGの頭部は通常、前辺縁の下に位置する小さな膨らみとして明らかに示される。(B)ILGの繊維状カプセルは、ILGを露出させるはさみで切開される。カプセルが切開されると、腺のより深い部分を容易に除去することができる。(C) 頬骨上にあるILGヘッドの最も外部部分が露出し、基礎となる頬骨を示す前向きに反射されている。(D)下縁に沿った眼窩中隔の切開は、ILGの尾部を露出する。(E) 外頸動脈の枝がILGの尾部(矢印)を供給する。(F) 完全なダクリオアデネクトーシス切除後の皮膚切開後の外観。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

Figure 8
図8:角膜表面のローズベンガル染色顕著な染色を示す外部写真は、鼻象限で最も顕著である。完全なダクリオアデネクトーミーを受けているすべての眼は、手術後1週間までに明らかであった同様の変化を発症し、少なくとも6週間持続した。注意してください、リングフラッシュからの光反射は、ドライアイが視力に悪影響を与える方法を示す乾燥した眼表面からの歪みを示しています。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

ダクリオアデネクトー切除術
平均 ± SEM;n = 16 個の目
ベースライン 第2週
ティアブレークアップ時間、s 60.0 ± 0.0 4.5 ± 1.2
p < 0.0001
涙口蓋、mOsm 291.2 ± 3.7 315.3 ± 5.5
p = 0.001
シルマーの裂け目テスト、mm 18.3 ± 1.3 10.5 ± 1.6
p = 0.0006
ローズベンガル、変更NEIスコア 0.0 ± 0.0 4.28 ± 0.6
p < 0.0001
操作.ベースライン:ダクリオアデネクトーマイア: TBUT, p < 0.0001;涙浸透圧, p < 0.001;シルマー裂け試験、 p < 0.0006);そして、ベンガルを上がった。

表1:術後週2のドライアイパラメータ。

Discussion

DEDは、涙液膜安定性への影響に基づいて2つの主要なグループに分類される:水性欠損(涙液膜の水性成分の産生減少;DEDの〜20%)および蒸発(涙液膜の蒸発増加;DEDの〜50%)。DED患者の約30%が両方の証拠を示す(混合DED)。炎症は、その多様な病因が13、14に収束するDED中核的なメカニズムである。私たちのメソッドは、水性欠乏DEDをモデル化します。

前述したように、我々の方法を再現する上で重要な最初のステップは、ウサギの軌道涙腺(LG)の解剖学的点の微妙な点を理解し、様々で時には矛盾する解剖学的用語による混乱を避けることである。ポペスコら11による解剖学的地図帳は非常に徹底的である。ウサギの解剖にあまり快適でない人のために、壊死標本の解剖はこれらの構造に容易な親しみを提供し、生きている標本の彼らの外科的除去を助ける。

動物の住宅と順応に関する批判的なアドバイスは、私たちのコンパニオン出版物12で与えられています。同じ記事はまた、両方の方法で使用されるDEDのパラメータを言うための有用なコメントを提示します。

前の方法12とは対照的に、これは、LGを除去するために必要な技術の程度およびより侵襲的な性質のために、より高いレベルの外科的スキルを必要とする。これらの切片の間の最大のリスクは、頸動脈の枝のようなLGに近接している主要な血管を傷つけることによって引き起こされる致命的な出血である。これは外科分野の各LGおよびマージンを十分に視覚化することによって避ける。最後に、ニチッとする膜の過度の除去は、涙液膜評価を妨害する可能性があるハーダーリアン腺の脱出につながる可能性があります。

再現性を向上させ、DEDの重症度を高める我々の方法の新しい側面であるPSLGの除去に伴う結膜破壊の量を最小限に抑えるように注意する必要があります。解剖面を確立し、組織に牽引力が適用されている限り、優れた軌道尾根に持ち帰ることは驚くほど簡単です。OSLGの切り捨てから焼灼マークを見ることができることは心強いです。彼らは腺の主な排泄管の完全な除去を確認します。

ILG全体の除去は、同様に課題を提示します。これは視覚化する最も簡単な部分であるため、最初に腺の頭部を分離します。腺組織の頭部全体は、周囲の組織から容易に分離する。しかし、ILGの頭部に内側にある大きな静脈の静脈の損傷を防ぐために、いくつかの注意を使用する必要があります。ILGの尾は、それが頬骨の下を通過する時に戻って続けることができます。尾の大部分は分離しやすいです。しかし、尾の最も後部の側面は、可変解剖学と頸動脈の中型枝への近さのために、より困難を証明することができます。慎重な解剖は、ILGのすべてのマージンを明確に見ることを可能にし、その完全な除去を容易にする必要があります。研究者は、涙腺の解剖学の以前の議論で説明したように、腺の尾が横広いカンサスの下で終わる場合には、解剖をより優れたものに運ぶ準備をする必要があります。著者らは、時間的および劣った地球に沿って曲線切開を通してILGを解剖する際に、OSLGのどの部分も同定できなかった。これは技術的には可能かもしれないが、その外科的アプローチは重篤な出血のリスクが高すぎる。後部の保証を通してOSLGに近づくのははるかに安全であることを証明する。

ILGの排泄管は、下部の膜下のフォルニックスに通過する下側の筋膜を貫通して見ることができます。時折、腺に現れる組織の小さな小葉もここでも見られ、慎重に除去することができる。

ここで示すように、LG切除の順序を維持することは非常に役立ちます。ILGを最初に取り除くと、OSLGの分離が技術的にはるかに困難になります。主な理由は、ILGを除去した後、OSLGを容易に脱出させ、それによって同定することができないからである。

私たちのモデルの重要な利点は、それが「モジュラー」であることができることです。言い換えれば、ダクリオアデネクトーミー切除術によって誘導されるDEDの程度は、実験的なニーズを満たすために較正することができる。例えば、すべてのLGの切除は最大DEDを引き起こすが、SLGのみの切除は最も穏やかな形態のDEDを引き起こし、ILGのみの切除は中間重症度の疾患を生じるであろう。

涙液産生の減少の明確な病態生理学的事象を再現する私たちのアプローチは、既に報告された方法と比較して追加の利点を提供する。簡単に言えば、他の外科モデルはすべての軌道LGs5、6、7、15、16によって涙の生産を除去しなかった;LGs17の副交感神経脱窒、および涙液産生18、19薬理学的抑制を含み、後者の2つは有意な共同創設者としてオフターゲット効果を有する。最後に、このモデルは、外科的技術が完全な可視化を提供するので、主な研究者依存的なバイアス、すなわちLGの不完全な切除を最小限に抑えます。これは、焼灼器以外の止血が必要という事実によって助けされる。

調査官は、すべての軌道Lの完全な切除が涙の完全な欠如を生成しないことを認識する必要があり、例えば、ゼロに近づくシルマーの涙試験値は期待すべきではない。これは、ヴォルフリングとクラウゼのアクセサリーLGや結膜血管20、21、22からのプラズマ漏れなど涙液の他の源が常に存在するという事実によるものです。実験的な観点からは、これは眼表面を維持するので、メソッドの肯定的な側面として見るべきです。完全なxerophthalmiaは完全にモデルの有用性を否定角膜を破壊するであろう。さらに、現在の実施形態では、このモデルは、これらの小さなコンパートメント全体にわたるこのような補償機構および流体輸送を研究する絶好の機会を提供する。

結論として、ここで提示される涙生理学の研究、DEDの病因およびこの適応症のために開発されている治療薬の研究に適する水性欠乏DEDを誘導する新しい、多目的な方法の詳細である。

Disclosures

著者は、メディコン・ファーマシューティカルズ社とアピス・セラピューティクス(LLC)で株式を有するBRを除き、競合する利益を宣言しない。そして、アピス・セラピューティクス(LLC)の株式を有するメディコン・ファーマシューティカルズ社の従業員であるLH。

Acknowledgments

ストーニーブルック大学医学部の対象研究機会助成金と、ニューヨーク州セトーケットのメディコン・ファーマシューティカルズ社の研究助成金による資金援助を認めます。編集支援をしてくれたミケーレ・マクターナンに感謝します。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
acepromazine, Aceproinj Henry Schein Animal Health, Dublin, OH NDC11695-0079-8 0.1ml/kg subcutaneously injection for rabbit sedation
anesthesia vaporizer VetEquip, Pleasanton, CA Item # 911103 Protocol 4.8
animal restraining bag Henry Schein Animal Health, Dublin, OH Jorvet J0170 Use appropriately sized bag.
bupivacaine, 0.5% Hospira Inc, Lake Forest IL NDC: 0409-1162-02 Mixed 50:50 with 2% lidocaine with 1:100,000 epinephrine for infiltration of incision sites, protocol 5.1
buprenorphine Henry Schein Animal Health, Dublin, OH 0.01 mg/kg, for postprocedural care, 6.1.4
cautery unit, high-temperature, battery-powered Medline Industries Inc, Northfield, IL REF ESCT001 Keep on hand in case of bleeding, protocol 2.7
clipper, Wahl Mini Arco Henry Schein Animal Health, Dublin, OH No. 022573 Cordless shears for fur removal, protocol 4.2
Colorado needle Stryker Craniomaxillofacial, Kalamazoo, MI N103A Use with electrosurgical unit to make incisions, protocol 5.1 & 5.3
electrosurgical unit with monopolar cautery plate Valleylab, Boulder, CO Force FXc Use with electrosurgical unit to make incisions, protocol 5.1 & 5.3
fluorescein, Ak-Fluor 10% AKRON, Lake Forest, IL NDC17478-253 Dilute to 0.2% with PBS to measure TBUT, measurement of dry eye parameters, protocol 3.1
foceps, curved dressing Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ Storz E1406 delicate serrated dressing forceps
forceps, 0.3 Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ ET6319 For removal of nictating membrane, protocol 2.5
forceps, Bishop Harmon Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ E1500-C Use toothed forceps for dacryoadenectomy, protocol 5.1 & 5.2
hair remover lotion, Nair Widely available Softening Baby oil Dipilitory cream for sensitive skin, protocol 4.2
isoflurane Henry Schein Animal Health, Dublin, OH 29405 Possible alternative sedation, protocol 4.7
IV catheter, Terumo Surflo ETFE 24-gauge Terumo, Tokyo, Japan; available from Fisher Sci., VWR, McKesson, etc. SR-OX2419CA 25-gauge for smaller rabbits; protocol 4.6
ketamine Henry Schein Animal Health, Dublin, OH NDC 11695-0701-1; NADA 200-055 15 mg/kg, protocol 4.7
ketoprofen Hospira, Inc., Lake Forest, IL 3 mg/kg, for postprocedural care, 6.1.4
laryngeal mask airway Docsinnovent Ltd, London, UK Vgel R3 Protocol 4.8
lid speculum, wire Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ Barraquer SUH01 For removal of nictating membrane, protocol 2.4
lidocaine 2% with epinephrine 1:100,000; 50:50 mixture Hospira Inc, Lake Forest IL NDC 0409-3182-02 Pre-treat before removal of nictating membranes, protocol 2.4
lidocaine, preservative-free Sigma-Aldrich, St. Louis, MO L5647 1% in PBS for anesthesia agent, for application to eye, protocol 2.4
micropipette Eppendorf Research Plus 100 uL For application of preservative-free lidocaine to eye, protocol 2.4
micropipette tips World Wide Medical Products 41071052 For application of preservative-free lidocaine to eye, protocol 2.4
monitoring device, multi-parameter SurgiVet, Waukesha, WI V9201 For monitoring of vitals, protocol 4.9
needle, 26-gauge BD, Franklin Lakes, NJ REF 305115 For injection of lidocaine/epinephrine, protocol 2.3 & 2.5
needle, 30-gauge BD, Franklin Lakes, NJ REF 305106 For infiltration of incision sites; syringe and needle size are not critical, protocol 5.1
osmolarity tips TearLab Corp., San Diego, CA #100003 REV R Measure tear osmolarity measurement of dry eye parameters, protocol 3.1
osmometer, TearLab TearLab Corp., San Diego, CA Model#200000W REV A Measure tear osmolarity, measurement of dry eye parameters, protocol 3.1
povidone-iodine solution Medline Industries Inc, Northfield, IL PVP Prep Solution, NDC: 53329-939-04, REF MDS 093944 To maintain sterile field, protocol 4.11
rabbit, New Zealand White Charles River Labs, Waltham, MA (NZW) 2-3 kg Research animals
Rose bengal stain Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO NDC51801-004-40 1% in PBS, for staining the ocular surface, measurement of dry eye parameters, protocol 3.1
saline, normal B. Braun Medical, Irvine, CA REF R5200-01 For postprocedural care, protocol 6.1.3
Schirmer Tear Test strips Eaglevision, Katena products. Denville, NJ AX13613 Measure tear production, measurement of dry eye parameters, protocol 3.1
scissors, Vannas McKesson Medical-Surgical, San Francisco, CA Miltex 2-130 Capsulotomy scissors for dacryoadenectomy, protocol 5.1 & 5.2
scissors, Westcott tenotomy McKesson Medical-Surgical, San Francisco, CA Miltex 18-1480 For removal of nictating membrane, protocol 2.7
sedation gas mask DRE Veterinary, Louisville, KY #1381 Possible alternative sedation, protocol 4.7
surgical marking pen Medical Action Industries, Arden, ND REF 115 Protocol 4.2
sutures, 5-0 Mersilene Ethicon US, LLC Ethylene terephthalate sutures, used for deep connective tissue closure, protocol 5.3.11
sutures, Vicryl 6-0 Ethicon US, LLC Polyglactin 910 sutures, used for superficial muscle and skin closure, protocol 5.3.11
syringe, 1 cc BD, Franklin Lakes, NJ ref 309659 For injection of lidocaine/epinephrine, protocol 2.3 & 2.5
syringe, 5 cc BD, Franklin Lakes, NJ REF 309603 For infiltration of incision sites; syringe and needle size are not critical, protocol 5.1
tissue forceps, 0.8mm Graefe Roboz Surgical Store, Gaithersburg, MD RS-5150 Curved Weck forceps
topical antibiotic ointment (neomycin, polymyxin, bacitracin, and hydrocortisone) Bausch and Lomb, Tampa, FL NDC 24208-785-55 Applied after removal of nictating membrane, protocol 2.8, and for postprocedural care, protocol 6.1.2
ultrasound gel Parker Laboratories, Inc., Fairfield, NJ Aquasonic 100 To ensure electrical contact with monopolar cautery plate, protocol 4.5
xylazine Henry Schein Animal Health, Dublin, OH NADA: 139-236 1 mg/kg, protocol 4.7

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gillan, W. D. H. Tear biochemistry: A review. South African Optometrist. 69, (2), 100-106 (2010).
  2. Conrady, C. D., Joos, Z. P., Patel, B. C. Review: The Lacrimal Gland and Its Role in Dry Eye. Journal of Ophthalmology. 2016, 7542929 (2016).
  3. Schechter, J. E., Warren, D. W., Mircheff, A. K. A lacrimal gland is a lacrimal gland, but rodents' and rabbits' are not human. Ocular Surface. 8, (3), 111-134 (2010).
  4. Shinomiya, K., Ueta, M., Kinoshita, S. A new dry eye mouse model produced by exorbital and intraorbital lacrimal gland excision. Scientific Reports. 8, (1), 1483 (2018).
  5. Bhattacharya, D., et al. Tear Production After Bilateral Main Lacrimal Gland Resection in Rabbits. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 56, (13), 7774-7783 (2015).
  6. Chen, Z. Y., Liang, Q. F., Yu, G. Y. Establishment of a rabbit model for keratoconjunctivitis sicca. Cornea. 30, (9), 1024-1029 (2011).
  7. Li, N., et al. Establishment of the mild, moderate and severe dry eye models using three methods in rabbits. BioMed Central Ophthalmology. 13, 50 (2013).
  8. Honkanen, R., et al. A New Rabbit Model of Chronic Dry Eye Disease Induced by Complete Surgical Dacryoadenectomy. Current Eye Research. 1-10 (2019).
  9. Nisha, S., Deepak, K. An Insight Into Ophthalmic Drug Delivery System. International Journal of Pharmaceutical Studies and Research. 3, (2), 9-13 (2012).
  10. Davis, F. A. The Anatomy and Histology of the Eye and Orbit of the Rabbit. Transactions of the American Ophthalmological Society. 27, (1929).
  11. Popesko, P., Rajitova, V., Horak, J. Rabbit - Guinea Pig. A Colour Atlas of the Anatomy of Small Laboratory Animals. 1, Saunders. Philadelphia, PA. (1992).
  12. Honkanen, R. A., Huang, L., Rigas, B. A rabbit model of aqueous-deficient dry eye disease induced by concanavalin A injection into the lacrimal glands: Application to drug efficacy studies. Journal of Visualized Experiments. e59631 (2019).
  13. Wei, Y., Asbell, P. A. The core mechanism of dry eye disease is inflammation. Eye & Contact Lens. 40, (4), 248-256 (2014).
  14. Pflugfelder, S. C., de Paiva, C. S. The Pathophysiology of Dry Eye Disease: What We Know and Future Directions for Research. Ophthalmology. 124, (11S), S4-S13 (2017).
  15. Gilbard, J. P., Rossi, S. R., Gray, K. L. A new rabbit model for keratoconjunctivitis sicca. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 28, (2), 225-228 (1987).
  16. Odaka, A., et al. Efficacy of retinol palmitate eye drops for dry eye in rabbits with lacrimal gland resection. Clinical Ophthalmology. 6, 1585-1593 (2012).
  17. Toshida, H., Nguyen, D. H., Beuerman, R. W., Murakami, A. Evaluation of novel dry eye model: preganglionic parasympathetic denervation in rabbit. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 48, (10), 4468-4475 (2007).
  18. Burgalassi, S., Panichi, L., Chetoni, P., Saettone, M. F., Boldrini, E. Development of a simple dry eye model in the albino rabbit and evaluation of some tear substitutes. Ophthalmic Research. 31, (3), 229-235 (1999).
  19. Xiong, C., et al. A rabbit dry eye model induced by topical medication of a preservative benzalkonium chloride. Investigative Ophthalmology and Visual Science. 49, (5), 1850-1856 (2008).
  20. Shiue, M. H., et al. Pharmacological modulation of fluid secretion in the pigmented rabbit conjunctiva. Life Science. 66, (7), 105 (2000).
  21. Li, Y., et al. Rabbit conjunctival epithelium transports fluid, and P2Y2(2) receptor agonists stimulate Cl(-) and fluid secretion. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 281, (2), C595-C602 (2001).
  22. Dartt, D. A. Regulation of mucin and fluid secretion by conjunctival epithelial cells. Progress in Retinal and Eye Research. 21, (6), 555-576 (2002).
ウサギにおける完全なダクリオアデネクトー切除術を用いた重症ドライアイモデルの確立
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Honkanen, R. A., Huang, L., Huang, W., Rigas, B. Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits. J. Vis. Exp. (155), e60126, doi:10.3791/60126 (2020).More

Honkanen, R. A., Huang, L., Huang, W., Rigas, B. Establishment of a Severe Dry Eye Model Using Complete Dacryoadenectomy in Rabbits. J. Vis. Exp. (155), e60126, doi:10.3791/60126 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter