En ny metod presenteras för att inducera kronisk torra ögonsjukdom hos kaniner genom kirurgiskt avlägsnande av alla orbital lacrimal körtlar. Denna metod, skild från de som tidigare rapporterats, producerar en stabil, reproducerbar modell av vattenhaltiga bristfällig torra öga väl lämpad för att studera tår fysiologi och patofysiologi och okulär Therapeutics.
Torra ögonsjukdom (DED) är en komplex sjukdom med flera etiologier och varierande symtom, med okulär ytinflammation som dess viktigaste patofysiologiska steg. Trots framsteg i vår förståelse av DED, betydande kunskapsluckor kvarstår. Framstegen är delvis begränsade på grund av bristen på informativa djurmodeller. Författarna rapporterade nyligen om en metod för DED induceras genom att injicera alla orbital lacrimal körtel (LG) vävnader med lektin Concanavalin a. Här rapporterar vi en ny modell av vatten-bristfällig DED baserat på kirurgisk resektion av alla orbital LG (dacryoadenektomi) vävnader. Båda metoderna använder kaniner på grund av deras likhet med mänskliga ögon när det gäller storlek och struktur av den okulära ytan. En vecka efter avlägsnande av nictiterande membran, orbital överlägsen LG opererades bort under anestesi, följt av avlägsnande av palpebrala överlägsen LG, och slutligen avlägsnande av sämre LG. Dacryoadenektomi inducerad svår DED, framgår av en markant minskning i tår bryta upp tid test och Schirmer ‘ s tår test, och signifikant ökad tår osmolaritet och Rose Bengal färgning. Dacryoadenektomi-inducerad DED varade i minst åtta veckor. Det fanns inga komplikationer och djur tolererade förfarandet väl. Tekniken kan behärskas relativt lätt av dem med adekvat kirurgisk erfarenhet och uppskattning av den relevanta kanin anatomi. Eftersom denna modell recapitulates funktionerna i humant vatten-bristfällig DED, är det lämpligt för studier av okulär yta homeostas, DED, och kandidat Therapeutics.
Tårar krävs för att skydda den okulära ytan och för upprätthållandet av de optiska egenskaperna hos hornhinnan. De består av tre skikt: en inre mucin beläggning, en mellersta vatten komponent, och en lipid overlay1. Mucin lagrar produceras huvudsakligen i bägare celler av bindhinnan, den aqueous komponenten huvudsakligen i lacrimal körtlar (LGS) och lipidlagrar huvudsakligen i de meibomian körtlarna1,2. Den orbital LGs är den viktigaste källan för vattenhaltiga komponenten av tårar och för många av de proteiner som skyddar ytan från bakteriell attack3. Okulär ytsjukdomar uppstå när den vattenhaltiga tår produktionen minskar under en kritisk nivå, beröva epiteliala ytor i ögat av vatten komponenten och avgörande tår beståndsdelar inklusive tillväxtfaktorer, lysozym, och Laktoferrin. I fall av minskad tårproduktion av LGs, konjunktival och hornhinnan vävnader genomgår anpassningar för att kompensera för den förändrade miljön.
Förstå bidraget av tår komponent som härrör från orbital LGs och den okulära ytans kompenserande mekanismer när detta saknas påverkar vår uppskattning av fysiologi och patofysiologi i främre segmentet av ögat och, mer allmänt, hälsa och sjukdom i hela världen. Experimentellt förhållningssätt till dessa frågor kräver en informativ djurmodell. Följaktligen har flera grupper försökt att utveckla djurmodeller där orbital LGs avlägsnas, vilket underlättar bedömningen av tårarnas roll i okulär hälsa. En sådan modell rapporterades nyligen för musen4. Kaninen erbjuder dock många distinkta fördelar jämfört med gnagare modeller inklusive liknande anatomiska och histologiska strukturer av LG, och kanske ännu viktigare, liknande storlek och yta av hornhinnan och konjunktival vävnader jämfört med deras mänskliga motsvarigheter3.
Skapandet av vattenhaltiga bristfällig torra ögonsjukdom (DED) genom kirurgisk resektion av LG vävnad i kaniner är inte ny. Många rapporter beskriver resektion av LG vävnader med varierande framgång återspeglas i varierande förändringar i tår produktionen mätt med Schirmers tår test5,6,7,8. En grundlig förståelse av den relevanta anatomin av kanin och klarhet om anatomiska terminologi är till stor hjälp för att reproducera denna metod. En grundlig översikt av båda anges nedan.
Anatomi av lacrimal körtlar
Kaninen har två orbital LGs: den större sämre LG (ILG) och den mindre överlägsna LG (SLG; Figur 1). Den ILG sträcker sig längs sämre och bakre aspekt av orbital RIM. Med undantag av varierande storlek, den främre delen av ILG har en ganska enhetlig uppsvällda utseende som kan ses som en förhöjning i huden under jordklotet (figur 2). På grund av dess karakteristiska utseende i förhållande till resten av körteln, det kallas “huvudet” av ILG. En del av huvudet sveper runt och ligger på utsidan av zygomatic benet. Detta fungerar som ett användbart landmärke på ultraljud biomikroskopi att vägleda injektioner i ILG. Resten av huvudet bor medialt9 i omloppet.
På grund av det karakteristiska utseendet på den resterande delen av ILG, som är lång och tunn, detta segment kallas “svansen.” Svansen löper längs sämre orbital RIM, från chefen för ILG till orbital rim där det slutar med variabel anatomi på sämre och bakre orbital RIM (figur 3A). Svansen ligger djupt (medial) till zygomatic benet separeras från orbital innehållet av en fascian band för de flesta av dess kurs tills den når den bakre kanten av omloppsbana där det återigen sträcker ut över utsidan av zygomatic benet. Den ILG får sin blodtillförsel från grenar av halspulsådern.
Den SLG har två komponenter som motsvarar den mänskliga. En är palpebrala överlägsen LG (pslg), som bor i den övre bakre ögonlocket mediala till böjd plattan. Det verkar uppsvälld i naturen och har många punktat öppningar att dränera vattenlösning tår vätska som är lättare att se när täckt med 2% fluorescein (figur 3B).
Den andra är orbital överlägsen LG (OSLG), bosatt i en medial position i den överlägsna omloppsbana (figur 3C). På grund av sin position nära mittlinjen av skallen, det har varit omöjligt att framgångsrikt identifiera den med hjälp av externa kirurgiska metoder från den temporala eller sämre omloppsbana. I färskt obduktion prover eller kirurgiska fall, denna körtel kan prolapsed genom den bakre incisure ligger i dorsala ytan av skallen när milda mediala trycket appliceras på jorden. Framfall av denna körtelvävnad kan dokumenteras med ultraljud biomicroscopy.
PSLGEN och OSLGEN är sammanhängande strukturerar. Den oslg är en tubuloalveolar struktur vars duktal arkitektur coalesces i de viktigaste utsöndringskanalen. Denna kanal passerar under Supra-orbital åsen och går i övre locket vävnader avslutande i PSLG. Längs utsöndringskanalen, Glandulär vävnad överensstämmer med de ursprungliga beskrivningarna av Davis har identifierats10 (figur 3D).
En anteckning om terminologi
Utmärkta och omfattande anatomiska beskrivningar använder olika terminologi också. Den klassiska orbital anatomi av Davis definierar bara en övre och lägre LG10. Men hans beskrivning av den övre LG tydligt Detaljer de delar mer specifikt definieras här som PSLG och OSLG, medan hans beskrivning av den lägre LG Detaljer de delar som definieras här som huvudet och svansen av ILG. En nyare och grundlig anatomisk Atlas11 definierar dessa vävnader som zygomatic körtel och tillbehöret LG. Termen “lacrimal körtel” används här för att omfatta de nämnda PSLG och OSLG. Denna terminologi är bättre lämpad för att reproducera denna metod utan onödig förvirring.
DED klassificeras i två större grupper baserat på effekten på tår film stabilitet: vattenhaltigt bristfällig (minskad produktion av vatten komponenten i tårfilmen; ~ 20% av DED) och evaporativ (ökad avdunstning av tårfilmen; ~ 50% av DED). Cirka 30% av de patienter som fått patienterna visar tecken på både (blandat). Inflammation är kärna ur mekanismen av DED till som dess olika etiologir konvergerar13,14. Våra metod modeller vattenhaltiga-bristfällig DED.
Som tidigare nämnts, viktiga första stegen i reproducera vår metod är en uppskattning av de fina punkterna i anatomin i omloppsbanor lacrimal körtlar (LGs) av kanin och undvika förvirring genom varierande och ibland motstridiga anatomiska terminologi. Den anatomiska atlasen av Popesko et al.11 är mycket noggrann. För de mindre bekväma med anatomi kanin, dissektion av obduktion prover ger enkel förtrogenhet med dessa strukturer och aids deras kirurgiska avlägsnande i levande exemplar.
Viktiga råd om djur boende och acklimatisering har givits i vår följeslagare publikation12. Samma artikel presenterar också användbara kommentarer för testmetoder parametrarna för DED används i båda metoderna.
I motsats till den tidigare metoden12, kräver detta en högre nivå av kirurgisk skicklighet på grund av omfattningen och mer invasiva arten av de tekniker som behövs för att ta bort LGS. Den största risken under dessa omsektioner är katastrofal blödning orsakad av skadade stora fartyg som är i närheten av LGs såsom grenar av halspulsådern. Detta undviks genom att tillräckligt visualisera varje LG och dess marginaler inom det kirurgiska området. Slutligen, övernitiska avlägsnande av nictiterande membran kan leda till framfall av Harderian körtel, som kan störa tår film bedömning.
Försiktighet bör iakttas för att minimera mängden av konjunktival störningar med avlägsnande av PSLG, en ny aspekt av vår metod som förbättrar reproducerbarhet och ökar svårighetsgraden av DED. Det är förvånansvärt lätt att fastställa dissektion planet och bära den tillbaka till den överlägsna orbital Ridge så länge dragkraft appliceras på vävnaderna. Det är lugnande att kunna se de diatermi märkena från trunkering av oslg; de bekräftar fullständig avlägsnande av den huvudsakliga utsöndringskanalen av körteln.
Avlägsnande av ILG i sin helhet presenterar utmaningar också. Isolera huvudet av körteln först, eftersom detta är den enklaste delen att visualisera. Hela huvudet av körtel vävnaden separerar lätt från omgivande vävnader; emellertid, viss försiktighet måste användas för att förhindra skador på den stora venösa sinus, som ligger mediala till chefen för ILG. Svansen på ILG kan sedan följas tillbaka när den passerar under zygomatic benet. Majoriteten av svansen är lätt att isolera. Men den mest bakre aspekten av svansen kan visa sig vara mer utmanande på grund av varierande anatomi och dess närhet till en medelstor gren av halspulsådern. Noggrann dissektion bör tillåta alla marginaler av ILG ses tydligt, underlätta dess fullständiga avlägsnande. Prövaren bör vara beredd att bära dissektion mer fint i fall där svansen av körteln slutar under laterala canthus, som förklaras i den tidigare diskussionen om anatomi lacrimal körtlar. Notera, författarna har aldrig kunnat identifiera någon del av oslg när dissekera den ILG genom en krökt snitt längs den temporala och sämre klot. Även om detta kan vara tekniskt möjligt, att kirurgisk metod medför en alltför hög risk för allvarlig blödning. Närmar sig OSLG genom den bakre incisure bevisar mycket säkrare.
Den utsöndringskanalen av ILG kan ses tränga igenom den sämre fascian planet som passerar in i nedre konjunktival fornix. Ibland, små lobules av glandular-förekommer vävnad ses här också och kan tas bort noggrant.
Det är till stor hjälp att bibehålla ordningen på LG resektion som presenteras här. Om ILGEN tas bort först, blir isoleringen av OSLGEN tekniskt långt svårare. Den främsta orsaken är att OSLG, efter avlägsnande av ILG, inte lätt kan förlapsed och därmed identifieras.
En stor fördel med vår modell är att det kan vara “modulärt”. Med andra ord, graden av DED induceras av dacryoadenektomi kan kalibreras för att tillgodose experimentella behov. Till exempel skulle resektion av alla LGs orsaka maximal DED, men resektion av endast SLG skulle orsaka den mildaste formen av DED och resektion av endast ILG skulle generera sjukdom av mellanliggande svårighetsgrad.
Vår strategi, som recapitulates den distinkta patofysiologiska händelse av minskad tårproduktion erbjuder ytterligare fördelar jämfört med redan rapporterade metoder. Kortfattat, ingen annan kirurgisk modell elimineras tårproduktion av alla orbital LGS5,6,7,15,16; inklusive parasympatiska denervering av LGS17, och farmakologisk dämpning av tårproduktion18,19, med de två sistnämnda har sina off-Target effekter som betydande confounders. Slutligen, denna modell minimerar de viktigaste prövaren beroende bias, nämligen ofullständig resektion av LGs, eftersom den kirurgiska tekniken ger deras kompletta visualisering; Detta är hjälpt av det faktum att ingen hemostas, andra än cautery, krävs.
Prövaren bör vara medveten om att fullständig resektion av alla orbital LGs inte genererar fullständig frånvaro av tårar, och till exempel, bör Schirmers tår test värden närmar sig noll inte förväntas. Detta beror på det faktum att det finns alltid andra källor till tår vätska såsom tillbehör LGS av wolfring och Krause och plasmaläckage från konjunktival fartyg20,21,22. Ur experimentell synvinkel bör detta ses som en positiv aspekt av metoden eftersom den bibehåller den okulära ytan. komplett xeroftalmi skulle helt förstöra hornhinnan förneka nyttan av modellen. Dessutom, i sin nuvarande utförande, erbjuder denna modell ett utmärkt tillfälle att studera sådana kompenserande mekanismer och vätske transporter över dessa mindre avdelningar.
Sammanfattningsvis presenteras här är detaljerna i en roman och mångsidig metod för att inducera aqueous-bristfällig DED som lämpar sig för studier av tår fysiologi, patogenesen av DED och studiet av terapeutiska medel som utvecklas för denna indikation.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner det ekonomiska stödet från en riktad forskningsmöjligheter bidrag från Stony Brook University School of Medicine och ett forskningsanslag från Medicon Pharmaceuticals, Inc., Setauket, NY. Vi tackar Michele McTernan för redaktionellt stöd.
acepromazine, Aceproinj | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | NDC11695-0079-8 | 0.1ml/kg subcutaneously injection for rabbit sedation |
anesthesia vaporizer | VetEquip, Pleasanton, CA | Item # 911103 | Protocol 4.8 |
animal restraining bag | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | Jorvet J0170 | Use appropriately sized bag. |
bupivacaine, 0.5% | Hospira Inc, Lake Forest IL | NDC: 0409-1162-02 | Mixed 50:50 with 2% lidocaine with 1:100,000 epinephrine for infiltration of incision sites, protocol 5.1 |
buprenorphine | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | 0.01 mg/kg, for postprocedural care, 6.1.4 | |
cautery unit, high-temperature, battery-powered | Medline Industries Inc, Northfield, IL | REF ESCT001 | Keep on hand in case of bleeding, protocol 2.7 |
clipper, Wahl Mini Arco | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | No. 022573 | Cordless shears for fur removal, protocol 4.2 |
Colorado needle | Stryker Craniomaxillofacial, Kalamazoo, MI | N103A | Use with electrosurgical unit to make incisions, protocol 5.1 & 5.3 |
electrosurgical unit with monopolar cautery plate | Valleylab, Boulder, CO | Force FXc | Use with electrosurgical unit to make incisions, protocol 5.1 & 5.3 |
fluorescein, Ak-Fluor 10% | AKRON, Lake Forest, IL | NDC17478-253 | Dilute to 0.2% with PBS to measure TBUT, measurement of dry eye parameters, protocol 3.1 |
foceps, curved dressing | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | Storz E1406 | delicate serrated dressing forceps |
forceps, 0.3 | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | ET6319 | For removal of nictating membrane, protocol 2.5 |
forceps, Bishop Harmon | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | E1500-C | Use toothed forceps for dacryoadenectomy, protocol 5.1 & 5.2 |
hair remover lotion, Nair | Widely available | Softening Baby oil | Dipilitory cream for sensitive skin, protocol 4.2 |
isoflurane | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | 29405 | Possible alternative sedation, protocol 4.7 |
IV catheter, Terumo Surflo ETFE 24-gauge | Terumo, Tokyo, Japan; available from Fisher Sci., VWR, McKesson, etc. | SR-OX2419CA | 25-gauge for smaller rabbits; protocol 4.6 |
ketamine | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | NDC 11695-0701-1; NADA 200-055 | 15 mg/kg, protocol 4.7 |
ketoprofen | Hospira, Inc., Lake Forest, IL | 3 mg/kg, for postprocedural care, 6.1.4 | |
laryngeal mask airway | Docsinnovent Ltd, London, UK | Vgel R3 | Protocol 4.8 |
lid speculum, wire | Bausch and Lomb (Storz), Bridgewater, NJ | Barraquer SUH01 | For removal of nictating membrane, protocol 2.4 |
lidocaine 2% with epinephrine 1:100,000; 50:50 mixture | Hospira Inc, Lake Forest IL | NDC 0409-3182-02 | Pre-treat before removal of nictating membranes, protocol 2.4 |
lidocaine, preservative-free | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO | L5647 | 1% in PBS for anesthesia agent, for application to eye, protocol 2.4 |
micropipette | Eppendorf | Research Plus 100 uL | For application of preservative-free lidocaine to eye, protocol 2.4 |
micropipette tips | World Wide Medical Products | 41071052 | For application of preservative-free lidocaine to eye, protocol 2.4 |
monitoring device, multi-parameter | SurgiVet, Waukesha, WI | V9201 | For monitoring of vitals, protocol 4.9 |
needle, 26-gauge | BD, Franklin Lakes, NJ | REF 305115 | For injection of lidocaine/epinephrine, protocol 2.3 & 2.5 |
needle, 30-gauge | BD, Franklin Lakes, NJ | REF 305106 | For infiltration of incision sites; syringe and needle size are not critical, protocol 5.1 |
osmolarity tips | TearLab Corp., San Diego, CA | #100003 REV R | Measure tear osmolarity measurement of dry eye parameters, protocol 3.1 |
osmometer, TearLab | TearLab Corp., San Diego, CA | Model#200000W REV A | Measure tear osmolarity, measurement of dry eye parameters, protocol 3.1 |
povidone-iodine solution | Medline Industries Inc, Northfield, IL | PVP Prep Solution, NDC: 53329-939-04, REF MDS 093944 | To maintain sterile field, protocol 4.11 |
rabbit, New Zealand White | Charles River Labs, Waltham, MA (NZW) | 2-3 kg | Research animals |
Rose bengal stain | Amcon Laboratories Inc., St. Louis, MO | NDC51801-004-40 | 1% in PBS, for staining the ocular surface, measurement of dry eye parameters, protocol 3.1 |
saline, normal | B. Braun Medical, Irvine, CA | REF R5200-01 | For postprocedural care, protocol 6.1.3 |
Schirmer Tear Test strips | Eaglevision, Katena products. Denville, NJ | AX13613 | Measure tear production, measurement of dry eye parameters, protocol 3.1 |
scissors, Vannas | McKesson Medical-Surgical, San Francisco, CA | Miltex 2-130 | Capsulotomy scissors for dacryoadenectomy, protocol 5.1 & 5.2 |
scissors, Westcott tenotomy | McKesson Medical-Surgical, San Francisco, CA | Miltex 18-1480 | For removal of nictating membrane, protocol 2.7 |
sedation gas mask | DRE Veterinary, Louisville, KY | #1381 | Possible alternative sedation, protocol 4.7 |
surgical marking pen | Medical Action Industries, Arden, ND | REF 115 | Protocol 4.2 |
sutures, 5-0 Mersilene | Ethicon US, LLC | Ethylene terephthalate sutures, used for deep connective tissue closure, protocol 5.3.11 | |
sutures, Vicryl 6-0 | Ethicon US, LLC | Polyglactin 910 sutures, used for superficial muscle and skin closure, protocol 5.3.11 | |
syringe, 1 cc | BD, Franklin Lakes, NJ | ref 309659 | For injection of lidocaine/epinephrine, protocol 2.3 & 2.5 |
syringe, 5 cc | BD, Franklin Lakes, NJ | REF 309603 | For infiltration of incision sites; syringe and needle size are not critical, protocol 5.1 |
tissue forceps, 0.8mm Graefe | Roboz Surgical Store, Gaithersburg, MD | RS-5150 | Curved Weck forceps |
topical antibiotic ointment (neomycin, polymyxin, bacitracin, and hydrocortisone) | Bausch and Lomb, Tampa, FL | NDC 24208-785-55 | Applied after removal of nictating membrane, protocol 2.8, and for postprocedural care, protocol 6.1.2 |
ultrasound gel | Parker Laboratories, Inc., Fairfield, NJ | Aquasonic 100 | To ensure electrical contact with monopolar cautery plate, protocol 4.5 |
xylazine | Henry Schein Animal Health, Dublin, OH | NADA: 139-236 | 1 mg/kg, protocol 4.7 |