Maus-Prostata-Organoide stellen einen vielversprechenden Kontext zur Bewertung von Mechanismen dar, die die Differenzierung regulieren. Dieses Papier beschreibt einen verbesserten Ansatz zur Etablierung von Prostataorganoiden und führt Methoden ein, um (1) Proteinlysat aus Organoiden zu sammeln und (2) Organoide für die konfokale Volltonmikroskopie zu fixieren und zu färben.
Das Prostataepithel besteht überwiegend aus Basal- und Leuchtzellen. In vivo Lineage Tracing wurde verwendet, um die Differenzierungskapazität der Maus Prostata basalen und luminalen Zellen während der Entwicklung, Geweberegeneration und Transformation zu definieren. Die Bewertung zellintrininter und extrinsischer Regulatoren der Prostataepitheldifferenzierungskapazität mithilfe eines Linienverfolgungsansatzes erfordert jedoch häufig eine umfangreiche Züchtung und kann kostenprohibitiv sein. Im Prostataorganoid-Assay erzeugen Basal- und Luminalzellen Prostataepithel ex vivo. Wichtig ist, dass primäre Epithelzellen von Mäusen mit genetischem Hintergrund oder Mäusen isoliert werden können, die mit einer beliebigen Anzahl kleiner Moleküle behandelt werden, bevor oder nach der Beschichtung in eine dreidimensionale (3D) Kultur eingeschichten wird. Nach 7-10 Tagen wird ausreichend Material für die Bewertung der Differenzierungskapazität erzeugt. Die Sammlung von basalabgeleiteten und luminalabgeleiteten Organoiden für (1) Proteinanalysen durch Western Blot und (2) immunhistochemische Analyse intakter Organoide durch vollmontierte konfokale Mikroskopie ermöglicht es Forschern, die ex vivo-Differenzierung zu bewerten Kapazität von Prostataepithelzellen. In Kombination liefern diese beiden Ansätze ergänzende Informationen über die Differenzierungsfähigkeit von Prostatabasal- und Leuchtzellen als Reaktion auf genetische oder pharmakologische Manipulationen.
Basal- und Leuchtzellen bilden die Mehrheit des Prostataepithels1. Lineage-Tracing-Studien haben gezeigt, dass diese Zelltypen überwiegend von unterschiedlichen Vorläufern in der erwachsenen Maus2selbstgetragen werden; jedoch wurde luminale Differenzierung von Basalvorläufern in verschiedenen Kontexten beobachtet, einschließlich Entwicklung3,4, Geweberegeneration5, Entzündung6,7 und Prostatakrebs Initiation2,8. Darüber hinaus unterstützen neu entstehende Daten die Existenz von multipotenten luminalen Vorläufern sowie luminal-gebundenen Vorläufern9. Bei metastasierendem Prostatakrebs stellt die Differenzierung von einer AR-abhängigen luminalen Abstammung zu einer AR-indifferenten Abstammung mit basalen und neuroendokrinen Merkmalen einen zunehmend geschätzten Mechanismus der Resistenz gegen Androgenweghemmer10,11,12dar. Da Differenzierung in die normale Physiologie, Krebsinitiation und Therapieresistenz involviert ist, ist es daher entscheidend, wichtige molekulare Regulatoren der Prostataepithelzelldifferenzierung aufzuklären.
Das Maus-Prostata-Organoid-Modell hat sich als eleganter ex vivo Kontext zur Untersuchung der Prostataepithelzelldifferenzierung9,13,14entwickelt. Bei diesem Test werden einzelne Epithelzellen in eine 3D-Matrix eingegliedert, wo sie drüsenstrukturen erzeugen, die sowohl Basal- als auch Leuchtzellen innerhalb von 1 Woche enthalten. Während bestehende Ansätze zur Beschichtung von Zellen in die organoide Kultur genutzt werden können, um Organoide effizient zu erzeugen, erfordern diese Ansätze eine weitere Optimierung14. Bemerkenswerte Herausforderungen im Zusammenhang mit der Kultivierung von Prostataorganoiden sind (1) ohne zweidimensionale (2D) Kolonien, die sich unterhalb des Matrigels (Matrixgel) aus der Analyse bilden, (2) die Integrität des Matrixgels während Medienveränderungen zu erhalten und (3) Organoide genau zu zählen. Dieses Papier skizziert einen Ansatz zur Erzeugung von Organoiden aus Epithelzellen, die aus der Prostata der Maus isoliert sind. Der beschriebene Ansatz beinhaltet Beschichtungsplatten mit Poly(2-Hydroxyethylmethacrylat) (Poly-HEMA), um das Auftreten von 2D-Kolonien zu verhindern. Darüber hinaus werden Zellen in einen Matrix-Gel-Ring eingezäunt, anstatt in eine Matrix-Gelscheibe, was das Wechseln der Medien und das Zählen von Organoiden weniger schwierig macht. Diese Techniken ermöglichen es Forschern, leichter zu untersuchen, wie genetische Veränderungen oder kleine Moleküle, die vor oder während der Organoidbildung eingeführt wurden, Schlüsselprozesse wie Differenzierung verändern.
Die Ernte von Prostataorganoiden für Western Blot oder immunhistochemische Analysen durch die konfokale Volltonmikroskopie kann wertvolle mechanistische Einblicke in die Differenzierung13liefern, doch es fehlen gut etablierte Protokolle zur Vorbereitung von Organoiden auf solche Techniken. Dieses Manuskript beschreibt Ansätze zur Ernte von Organoiden für (1) die Sammlung von Proteinlysat oder (2) Fixierung und Färbung für die konfokale Mikroskopie. Wichtig ist, dass der beschriebene Ansatz zur Fixierung und Färbung von Prostataorganoiden im Vergleich zu bestehenden Methoden erheblich verbessert wird. Während diese sich auf die Sektionsorganoide15stützen, verwendet die in diesem Manuskript beschriebene Methode intakte Organoide, die bei der Probenvorbereitung vor organoiden Schäden schützen. In Kombination können Western Blot und konfokale Mikroskopie wertvolle Einblicke in die molekularen Regulierer der Differenzierung liefern. Alternativ können diese Ansätze verwendet werden, um andere Prozesse wie Entwicklung und Transformation zu modellieren.
Prostataepithelzelldifferenzierung wurde sowohl in der normalen Prostatabiologie2,3,4,5,6,7 und Krankheitsbiologie8,10,11,12; Die Master-Regler dieses Prozesses bleiben jedoch undefiniert. Die Identifizierung wichtiger Regulatoren der Prostataepithelzelldifferenzierung war zum Teil aufgrund des Fehlens gut etablierter Kontexte zur Modellierung schwierig. Während 2D-Monolayer-Kultur verwendet werden kann, um Differenzierung11,12zu modellieren, kann dieser Kontext die komplexe Prostata-Mikroumgebung nicht rekapitulieren. Darüber hinaus eignen sich in vivo-Kontexte zur Modelldifferenzierung nicht für mechanistische Studien, da sie eine Herausforderung zu manipulieren sind. Daher ist die Identifizierung eines leicht zu manipulierenden, aber physiologisch relevanten Kontextes zur Untersuchung der Differenzierung von entscheidender Bedeutung.
Das Prostataorganoidmodell stellt einen eleganten Ex-vivo-Kontext dar, in dem basale bis luminale Differenzierung berichtet wird. Methoden zur Etablierung von Prostataorganoiden sind gut etabliert14; eine weitere Optimierung dieser Methoden ist jedoch erforderlich. Darüber hinaus sind Ansätze zur Ernte und Vorbereitung von Prostataorganoiden für die Analyse nicht klar beschrieben. Dieses Papier beschreibt einen Ansatz zur Platte Prostataepithelzellen isoliert von Maus Prostata in Organoid-Kultur. Dieser Ansatz ermöglicht es Forschern, (1) das Auftreten von 2D-Kolonien während der Organoidbildung zu verhindern, (2) das Risiko einer Störung des Matrixgels während der Medienauffüllung zu reduzieren und (3) Organoide effektiver zu zählen. Darüber hinaus skizziert dieses Manuskript Ansätze zur Ernte von Organoiden zur Vorbereitung auf die Western Blot-Analyse oder zur konfokalen Ganzkörpermikroskopie. Wichtig ist, dass der Ansatz, der zur Vorbereitung von Organoiden für die konfokale Mikroskopie verwendet wird, die intakte Struktur der Organoide während ihrer Dauer aufrechterhält, was Organoidschäden vor der Bildaufnahme reduziert. Insgesamt erweitern die beschriebenen Ansätze die Fähigkeiten des Prostataorganoid-Assays.
Insbesondere kann die organoidbildende Fähigkeit von Basal- und Luminalzellen sowohl durch Methoden zur Isolierung der jeweiligen Populationen als auch durch Kulturbedingungen verändert werden. Die in diesem Test verwendeten organoiden Kulturbedingungen wurden zuerst von Karthaus et al.13beschrieben. Karthaus et al. haben berichtet, dass Basalzellen eine höhere Organoidbildungsfähigkeit haben (15%) als Luminalzellen (1%)13, Chua et al., unter Verwendung unterschiedlicher Isolationsmethoden und Kulturbedingungen, haben berichtet, dass Luminalzellen (0,2-0,3%) organoidbildende Kapazität haben als Basalzellen (0,03%)20. Insgesamt führen die von Karthaus et al. beschriebenen Methoden zu höheren organoiden Bildungsraten sowohl für Basal- als auch für Luminalzellen, was wahrscheinlich Unterschiede im Ansatz widerspiegelt, der zur Isolierung von Basal- und Leuchtlichtzellen13verwendet wird, im Gegensatz zu Kulturbedingungen, die gegen die Organoidbildung aus Leuchtzellen voreingenommen sind. Es bleibt unklar, ob das in diesem Manuskript beschriebene Protokoll die luminale Organoidbildung von multipotenten luminalen Vorläufern oder engagiert-luminalen Vorläufern9begünstigt. Obwohl rechtzeitig und kostenprohibitiv, In-vivo-Lineage-Tracing-Studien können verwendet werden, um Vorläufer-Features im Zusammenhang mit verschiedenen Prostata-Epithel-Linien im Organoid-Assay zu validieren.
Prozesse wie Entwicklung, Differenzierung und Transformation sind nicht nur für die Prostatabiologie relevant, sondern auch relevant für die Biologie anderer Gewebe wie Gehirn, Lunge, Darm, Bauchspeicheldrüse und Leber. Die beschriebenen Methoden erleichtern die Nutzung des Organoidmodells, um diese Prozesse nicht nur in der Prostata, sondern auch in einer Vielzahl von Geweben zu untersuchen.
The authors have nothing to disclose.
PDC und JMG werden durch den Ruth L. Kirschstein National Research Service Award GM007185 unterstützt. JAD wird vom National Institute of General Medical Sciences der National Institutes of Health (R25GM055052) unterstützt, das an T. Hasson und das Saul Martinez Stipendium verliehen wird. Die ASG wird durch den Spitzer Family Foundation Fund und das Gill Endowment unterstützt. Diese Arbeit wurde von der American Cancer Society (RSG-17-068-01-TBG), Department of Defense (W81XWH-13-1-0470), Margaret E. unterstützt. Early Medical Research Trust, NIH/NCI (P50CA092131/UCLA SPORE in Prostatakrebs), Rose Hills Foundation und Unterstützung durch das Jonsson Comprehensive Cancer Center der UCLA, das Broad Stem Cell Research Center, das Clinical and Translational Science Institute und das Institute of Urologic Oncology.
µ-Dish 35mm, high | ibidi | 81156 | |
16% Paraformaldehyde | Thermo Fisher Scientific | 50-980-487 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
A83-01 | Tocris | 2939 | |
Advanced DMEM/F-12 | Thermo Fisher Scientific | 12634010 | |
APC/Cy7 anti-mouse CD326 (Ep-CAM) Antibody, 100 ug | BioLegend | 118218 | |
B-27 Supplement (50x), Serum Free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11836145001 | |
(DiHydro)testosterone (5α-Androstan-17β-ol-3-one) | Sigma | A-8380 | |
Dispase II, Powder | Thermo Fisher Scientific | 17-105-041 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F8667 | |
FITC anti-mouse CD31 Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 102405 | |
FITC anti-mouse CD45 Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 103107 | |
FITC anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug) | BioLegend | 116205 | |
Goat anti-mouse IgG-Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A28175 | |
Goat anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11012 | |
GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
Halt Phosphatase Inhibitor | Thermo Fisher Scientific | 78428 | |
Matrigel GFR Membrane Matrix | Corning | CB-40230C | |
Mouse anti-cytokeratin 8 | BioLegend | 904804 | |
N-acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165 | |
Normocin | Thermo Fisher Scientific | ant-nr-1 | |
PE anti-human/mouse CD49f Antibody | BioLegend | 313612 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15-140-122 | |
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (Poly-HEMA) | Sigma | P3932-25G | |
Rabbit anti-p63 | BioLegend | 619002 | |
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA) | Thermo Fisher Scientific | PI89901 | |
Recombinant Human EGF, Animal-Free | PeproTech | AF-100-15 | |
Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | |
RPMI 1640 Medium, HEPES (cs of 10) | Thermo Fisher Scientific | 22400105 | |
Sonic Dismembrator | Thermo Fisher Scientific | FB120 | |
Sucrose | Sigma | S0389-500G | |
Triton X-100 | Sigma | X100-5ML | |
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor) | Selleck Chemical | S1049-50MG |