Evaluación de la capacidad de diferenciación de las células epiteliales de próstata de ratón utilizando el cultivo organoide

Summary

Los organoides de próstata de ratón representan un contexto prometedor para evaluar los mecanismos que regulan la diferenciación. Este artículo describe un enfoque mejorado para establecer organoides de próstata, e introduce métodos para (1) recoger el lisato de proteína de los organoides, y (2) fijar y manchar los organoides para la microscopía confocal de montaje completo.

Abstract

El epitelio prostático se compone predominantemente de células basales y luminales. El trazado de linaje in vivo se ha utilizado para definir la capacidad de diferenciación de las células basales y luminales de la próstata del ratón durante el desarrollo, la regeneración de tejidos y la transformación. Sin embargo, evaluar los reguladores celulares-intrínsecos y extrínsecos de la capacidad de diferenciación epitelial de próstata utilizando un enfoque de trazado de linaje a menudo requiere una amplia reproducción y puede ser prohibitivo para los costos. En el ensayo organoide prostático, las células basales y luminales generan epitelio prostático ex vivo. Es importante destacar que las células epiteliales primarias pueden aislarse de ratones de cualquier origen genético o ratones tratados con cualquier número de moléculas pequeñas antes o después del cultivo tridimensional (3D). Se genera material suficiente para la evaluación de la capacidad de diferenciación después de 7-10 días. Colección de organoides derivados basales y de origen luminal para (1) análisis de proteínas por western blot y (2) análisis inmunohistoquímico de organoides intactos mediante microscopía confocal de montaje completo permite a los investigadores evaluar la diferenciación ex vivo capacidad de las células epiteliales de próstata. Cuando se utilizan en combinación, estos dos enfoques proporcionan información complementaria sobre la capacidad de diferenciación de las células basales y luminales de la próstata en respuesta a la manipulación genética o farmacológica.

Introduction

Las células basales y luminales comprenden la mayoría del epitelio de próstata^1. Los estudios de trazado de linaje han revelado que estos tipos de células son predominantemente autosostenidos por distintos progenitores en el ratón adulto²; sin embargo, la diferenciación luminal de los progenitores basales se ha observado en varios contextos incluyendo el desarrollo^3,4, regeneración de tejido⁵, inflamación^6,7 y la iniciación del cáncer de próstata^2,8. Además, los datos emergentes respaldan la existencia de progenitores luminales multipotentes, así como de progenitores comprometidos con^{luminales 9.} En el cáncer de próstata metastásico, la diferenciación de un linaje luminal dependiente de AR a un linaje indiferente a la AR con características basales y neuroendocrinas representa un mecanismo cada vez más apreciado de resistencia a los inhibidores de la vía de andrógenos^10,11,12. Por lo tanto, como la diferenciación está implicada en la fisiología normal, la iniciación del cáncer y la resistencia a la terapia, es fundamental es fundamental que los reguladores moleculares de la diferenciación de células epiteliales de próstata se es fundamental.

El modelo organoide prostático ratón ha surgido como un elegante contexto ex vivo para estudiar la diferenciación de células epiteliales de próstata^9,13,14. En este ensayo, las células epiteliales individuales se celen en una matriz 3D donde generan estructuras glandulares que contienen células basales y luminales dentro de 1 semana. Mientras que los enfoques existentes para el enchapado de células en el cultivo organoide se pueden utilizar para generar organoides de manera eficiente, estos enfoques requieren una optimización adicional^14. Los desafíos notables asociados con el cultivo de organoides de próstata incluyen (1) excluyendo las colonias bidimensionales (2D) que se forman debajo del Matrigel (gel de matriz) del análisis, (2) mantener la integridad del gel de matriz durante los cambios de medios, y (3) contar los organoides con precisión. Este documento describe un enfoque para generar organoides a partir de células epiteliales aisladas de la próstata del ratón. El enfoque descrito implica el recubrimiento de placas con poli(2-hidroxietilo metacrilato) (Poly-HEMA) para evitar la aparición de colonias 2D. Además, las células se celen en un anillo de gel de matriz, en lugar de un disco de gel de matriz, lo que hace que cambiar el medio y contar organoides sea menos difícil. Estas técnicas permiten a los investigadores investigar más fácilmente cómo las alteraciones genéticas o moléculas pequeñas introducidas antes o durante, la formación de organoides alteran procesos clave como la diferenciación.

La recolección de organoides de próstata para el análisis inmunohistoquímico o de la mancha occidental mediante microscopía confocal de montaje completo puede proporcionar una valiosa visión mecanicista sobre la diferenciación^13,pero faltan protocolos bien establecidos para preparar organoides para tales técnicas. Este manuscrito describe los enfoques para cosechar organoides para (1) la recolección de lisato de proteínas, o (2) fijación y tinción para microscopía confocal. Es importante destacar que el enfoque descrito para la fijación y tinción de organoides prostáticos se mejora considerablemente en relación con los métodos existentes. Mientras que estos se basan en la sección de organoides¹⁵, el método descrito en este manuscrito utiliza organoides intactos, que ayuda a proteger contra el daño organoides durante la preparación de la muestra. Cuando se utiliza en combinación, la mancha occidental y la microscopía confocal pueden proporcionar información valiosa sobre los reguladores moleculares de la diferenciación. Alternativamente, estos enfoques se pueden utilizar para modelar otros procesos como el desarrollo y la transformación.

Protocol

Todos los métodos descritos aquí han sido aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de California, Los Angeles. NOTA: En la Figura 1se proporciona un esquema que ilustra los enfoques descritos en el documento. 1. Aislación de ratón basal y células epiteliales de próstata luminal utilizando la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) — TIMING: 30 Min NOTA: Realice los pasos 1.3-1.5 en la oscuridad. Después de disociar las células de la próstata total del ratón como se describe en Lawson et al.16, transferir las células a tubos FACS y resuspender 0,1-5 x 106 células en 100 ml de medios de disociación (Tabla 1). Añada el volumen adecuado de los siguientes anticuerpos primarios conjugados directamente: CD45, CD31, Ter-119, EpCAM y CD49f. Incubar sobre hielo, protegido de la luz, durante 20 min.NOTA: Se recomienda utilizar el 10% del total de células disociadas para controles no manchados y de un solo mancha. Estos controles son necesarios para establecer la compensación y el voltaje correctos para la clasificación. Cóctel de anticuerpos de acuela añadiendo 1 ml de medios de disociación a cada muestra. Reventar las células por centrifugación a 800 x g durante 5 min a temperatura ambiente (RT) y eliminar el sobrenadante aspirando. Resuspenda las células en el volumen adecuado (250 ml por 1 x 106 células) de medios de disociación que contengan 1 g/ml 4′,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI). Proceda al FACS. Las gráficas de citometría de flujo que demuestran el aislamiento de las células epiteliales de próstata basales y luminales del ratón se ilustran en la Figura 2. 2. Placado de células epiteliales de próstata ordenadas en cultivo organoide de ratón primario — TIMING: 2-3 H (excluyendo la preparación de placas recubiertas de poli-HEMA) NOTA: Las placas están recubiertas con Poly-HEMA para evitar la formación de colonias 2D en la superficie del pozo por debajo del gel de matriz. Preparar placas recubiertas de Poli-HEMA 1 día antes de la chapado de células epiteliales basales u luminales de próstata en el cultivo organoide del ratón. Descongelar 1 mL alícuotas de gel de matriz de factor de crecimiento reducido, en adelante denominado gel de matriz, sobre hielo 2 h antes del paso 2.1. Y-27632 (inhibidor de LA ROCA) debe añadirse a los medios organoides del ratón inmediatamente antes del paso 2.1. Realice los pasos 2.1-2.8 en hielo. Peletizar las células en tubos de fondo redondo de 5 ml por centrifugación a 800 x g durante 5 min a 4 oC y aspirar al sobrenadante. Lavar el gránudo celular en 500 ml de medios organoides de ratón (Tabla 2)14. Peletizar las células por centrifugación a 800 x g durante 5 min a 4 oC y aspirar el sobrenadante. Resuspender en medios organoides de ratón a una densidad celular de 1.000 células/L. Para preparar mezclas maestras, mezcle las células epiteliales suspendidas en medios organoides de ratón con gel de matriz para generar una mezcla final que contenga 25% de células/medios y 75% de gel de matriz. Las células basales se nivelan típicamente a una concentración de 100-2,000 células/80 l, mientras que las células luminales se nivelan típicamente a una concentración de 2.000-10.000 células/80 l. La densidad de las células chapadas varía según el día de la recolección de material estimida, y la aplicación descendente deseada.NOTA: Enfríe los tubos de tamaño adecuado para el volumen de mezcla maestro esperado 5 min antes de la preparación de la mezcla maestra. Para asegurarse de que el gel de matriz no se endurece durante el manejo, es fundamental enfriar la punta de la pipeta pipeteando el gel de matriz 3-4 veces antes de transferirlo a un tubo nuevo. Añadir 80 l de la mezcla de gel/célula de la matriz por pozo de una placa de 24 pocillos. Se recomienda pipetear una gota en la mitad inferior de la pared del pozo, evitando el contacto directo con el revestimiento Poly-HEMA. Después de agregar el gel de matriz, gire la placa para permitir que la mezcla de gel de matriz/célula forme un anillo alrededor del borde del pozo. Coloque la placa de 24 pocillos en una incubadora de CO2 de 37oC 5% hacia arriba durante 10 minutos para permitir que el gel de matriz se endurezca parcialmente.NOTA: Comience a calentar los medios organoides del ratón a 37 oC inmediatamente después de colocar la placa de 24 pocillos en la incubadora. Después de incubar durante 10 minutos, voltee la placa de 24 pocillos al revés e incubar durante 50 minutos adicionales para permitir que el gel de matriz se endurezca por completo. Añadir 350 s de medios organoides de ratón precalentados en el centro de cada poca.NOTA: Para mantener la integridad del gel de matriz, es fundamental evitar el anillo de gel de matriz mientras se añaden medios. Después de añadir el soporte, devuelva la placa de 24 pocillos a la incubadora de CO2 de 37oC 5%. 3. Reposición de medios organoides de ratón — TIMING: 10-15 Min por placa de 24 pocillos NOTA: Los medios existentes deben sustituirse por medios nuevos cada 48 h. Antes de cada cambio de medio, precaliente los medios organoides del ratón. No es necesario añadir el inhibidor ROCK a los medios utilizados para la reposición. Incline la placa de 24 pocillos en un ángulo de 45o y retire suavemente los medios existentes del centro de cada pocal con una pipeta p1000, evitando el anillo de gel de matriz. Añadir 350 s de medios organoides de ratón precalentados como en el paso 2.9. Se recomienda añadir un mayor volumen de medios (hasta 1 ml) a los organoides cultivados durante más de 5 días con el fin de evitar el agotamiento rápido de nutrientes clave y factores de crecimiento. 4. Extracción de lisato proteico de organoides de próstata para el análisis de Western Blot — TIMING: 2.5-4 H NOTA: Antes de recoger organoides para la extracción de líos proteicos, preparar y precalentar los medios que contengan dispensa (Tabla 1). Retire el medio de cada uno bien, así como en el paso 3.1. Para recoger organoides, explote repetidamente el gel de matriz pipeteando 1 ml de medios que contienen dosis directamente en el anillo de gel de matriz hasta que todo el anillo se desaloje, y transfiera a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.NOTA: Es fundamental evitar el contacto directo con los pozos recubiertos con Poly-HEMA. El contacto directo puede causar contaminación del material recogido con Poly-HEMA, lo que podría afectar negativamente a la supervivencia celular. Coloque los tubos de microcentrífuga de 1,5 ml en una incubadora de CO2 de 37 oC al 5% durante 30 min a 1 h para permitir la digestión completa del gel de matriz mediante una dosis. Organoides de pellet por centrifugación a 800 x g durante 5 min a RT y retire el sobrenadante con un micropipeta. Agregue la solución salina con fosfato (PBS) al pellet organoide y resuspenda con un golpe suave.NOTA: Si no se resuspende suficientemente el pellet organoide, se puede contaminar el material organoide con una dispensa residual o gel de matriz. Peletizar los organoides por centrifugación a 800 x g durante 5 min a RT y retirar el sobrenadante con un micropieta. Congele rápidamente los gránulos organoides colocando cada tubo en una solución que contenga hielo seco y metanol. Almacene los tubos hasta su uso futuro a -80 oC. Alternativamente, extraiga el lisado proteico inmediatamente después del paso 4.6. Resuspenda los gránulos organoides en 100 ml de tampón de lisis proteica(Tabla 1) por 10 ml de volumen celular envasado. Deslice el dedo para resuspender.NOTA: Si se reanuda después de una congelación rápida, asegúrese de que el tampón de lisis proteica se descongele antes de extraer muestras de -80 oC, ya que se debe añadir un tampón de lisis a las muestras inmediatamente para prevenir la actividad de fosfatasa y proteasa. Incubar las muestras en tampón de lisis proteica en hielo durante al menos 45 min.NOTA: Se recomienda sonicar antes de la incubación en hielo para aumentar la eficiencia de la recuperación de proteínanuclear; sin embargo, la sonicación no es necesaria. Si no se realiza la sonicación, proceda al paso 4.10. Para sonicar, sumerja los tubos en hielo húmedo y aplique suavemente la punta del desmembrador sónico en el exterior del tubo de microcentrífuga. Sonicado para 40 s a 20 kHz. Proceda a Western blot siguiendo los protocolos establecidos. 5. Fijación y tinción de organoides de próstata para análisis inmunohistoquímicos por microscopía confocal de montaje completo Recolección de organoides prostáticos de placas de 24 pocillos — TIMING: 45-60 minNOTA: Al recoger organoides de próstata para procesar la microscopía confocal, es fundamental manejarlos con cuidado para mantener su estructura. El protocolo de recolección a continuación está diseñado para reducir la interrupción de la estructura organoide durante el aislamiento. Retire el medio de cada uno bien, así como en el paso 3.1. Digerir el gel de matriz incubando con 500 ml de medios que contienen dispensas(Tabla 1) durante 30 min en una incubadora de CO2 de 37oC al 5%. Recoger la suspensión organoide digerida en un tubo de microcentrífuga y peletizar los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 min en RT. Retire el sobrenadante. Tinción inmunofluorescente de montaje completo de los organoides de próstata — TIMING: 3-4 días (1-5 h/día) Añadir 500 s de 4% de paraformaldehído en PBS e incubar durante 2 h a RT con suave agitación. Pellet a los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 min en RT, quitar el sobrenadante, y lavar el pellet con 1 mL de PBS durante 15 min con suave agitación. Lave el pellet como en el paso 5.2.2 para dos veces más. Peletizar los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 min a RT y retirar el sobrenadante. Añadir 1 DAPI g/mL en la solución de bloqueo(Tabla 1). Incubar durante 2 h a RT o, alternativamente, durante la noche a 4oC con un suave temblor. Peletizar los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 min a RT y retirar el sobrenadante. Añadir anticuerpo primario (conejo anti-p63, ratón anticitoqueratina 8) en la solución de bloqueo e incubar durante la noche a 4oC con un suave temblor. Peletizar los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 min a RT y retirar el sobrenadante. Lave el pellet con 1 ml de PBS durante 15 minutos con un suave temblor. Lave el pellet como en el paso 5.2.6 para dos veces más. Peletizar los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 min a RT y retirar el sobrenadante. Añadir anticuerpo secundario (cabra anticonejo IgG-Alexa Fluor 594, cabra anti-ratón IgG-Alexa Fluor 488) en la solución de bloqueo e incubar durante la noche a 4 oC con agitación suave. Pellet a los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 min en RT, quitar el sobrenadante, y lavar el pellet con 1 mL de PBS durante 15 min con suave agitación. Lave el pellet como en el paso 5.2.9 para dos veces más. 6. Limpieza y montaje de tejidos de los organoides de próstata manchada para microscopía confocal de montaje completo — TIMING: 7 H Peletizar los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 min a RT y retirar el sobrenadante. Añadir 1 mL de 30% sacarosa en PBS con 1% De Tritón X-100 e incubar durante 2 h a RT con suave agitación. Peletizar los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 min a RT y retirar el sobrenadante. Añadir 1 mL de 45% sacarosa en PBS con 1% De Tritón X-100 e incubar durante 2 h a RT con suave agitación. Peletizar los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 min a RT y retirar el sobrenadante. Añadir 1 mL de 60% sacarosa en PBS con 1% De Tritón X-100 e incubar durante 2 h a RT con suave agitación. Peletizar los organoides por centrifugación a 800 x g durante 3 min a RT y eliminar el 95% del sobrenadante.NOTA: El pellet se vuelve más suelto a medida que la concentración de sacarosa se vuelve más alta. Se recomienda observar los organoides teñidos de DAPI bajo la luz UV para confirmar que no se perdieron durante la extracción del sobrenadante. Transfiera una gota de 10-20 l de la suspensión restante a un cubreobjetos con cámara y proceda a la microscopía confocal.NOTA: Los fragmentos de Coverslip se pueden colocar a ambos lados de la gota para ser utilizados como espaciadores(Figura 4C). Estos evitan que los organoides se derrumben cuando se coloca un cubreobjetos sobre la gota.

Representative Results

Las células epiteliales de próstata se enchapan en el cultivo organoides del ratón donde forman organoides, que se cosechan antes de la preparación para el análisis posterior(Figura 1). Las células epiteliales basales y luminales se aíslan mediante FACS. Después de excluir DAPI+ células y agotar Lin+ células (CD45, CD31, Ter119), las células basales y luminales se distinguen en función de la expresión diferencial de EpCAM y CD49f(Figura 2). El enfoque descrito para placar células basales y luminales de la próstata en cultivo organoide implica: (1) células de chapado en anillos de gel de matriz, y (2) revestimiento de pozos con Poly-HEMA. La chapación en anillos se ha descrito previamente en Agarwal et al9. El uso de este enfoque(Figura 3A)permite a los investigadores evitar más fácilmente el gel de matriz mientras se repone el medio (Paso 3), y más fácilmente contar los organoides siguiendo la circunferencia del pozo. Se ha demostrado que los pozos de recubrimiento con Poly-HEMA previenen la formación de colonias 2D en organoides retinianos17; sin embargo, este enfoque no se ha utilizado en el modelo de organoide prostático. Es importante destacar que los pozos de recubrimiento con Poly-HEMA(Tabla 3) eliminan la aparición de colonias 2D sin interferir con la formación de organoides(Figura 3B). Estas modificaciones amplían las capacidades del ensayo organoide prostático. Las células basales y luminales forman organoides con morfologías distintas(Figura 4A). Mientras que la mayoría de los organoides derivados de basales son de tamaño similar (100-300 m de diámetro) después de 7 días en cultivo, los organoides derivados de la luminaria exhiben una heterogeneidad significativa (30-450 m de diámetro). Además, la mayoría de los organoides derivados del basal contienen lúmenes rodeados por epitelio multicapa(Figura 4A, parte superior),mientras que los organoides derivados de la luminaria varían en morfología desde hueco, con epitelio de una sola capa a sólido, con cuerdas multicapa de células que no se canalizan(Figura 4A, inferior). Los enfoques descritos anteriormente para preparar organoides para el análisis posterior (pasos 4, 5), se utilizaron para investigar si estas diferencias fenotípicas reflejan las diferencias en la expresión del marcador de linaje. El análisis de manchas occidentales reveló que los organoides basales y derivados de la luminal conservan características asociadas con las células primarias basales y luminales. Los organoides derivados de la basal expresan niveles más altos del marcador basal de la citoqueratina 5 (K5), mientras que los organoides derivados de la luminal expresan niveles más altos del marcador luminal de citoqueratina 8 (K8)(Figura 4B). Se detectaron marcadores basales y luminales en organoides basales y derivados de la luminal en la población a granel, tal vez sugestivos de diferenciación(Figura 4B). Tratamos de caracterizar la expresión del marcador de linaje en organoides derivados de basales y determinar si los organoides de origen luminal morfológicamente distintos presentan diferencias en la expresión del marcador al manchar los organoides intactos y realizar microscopía confocal(Figura 4D). Los organoides derivados basales contenían epitelio multicapa con capas externas que expresaban altos niveles del marcador basal p63 y niveles moderados del marcador luminal K8 (p63hi,K8mid),y capas internas sin niveles detectables de p63 y altos niveles de K8 (p63lo,K8hi) (Figura 4D, superior). Mientras que todas las células de organoides de origen luminal de una sola capa se mancharon positivamente para K8, sólo seleccionaron las células contenidas nuclear p63(Figura 4D, inferior). Estos datos validan los enfoques para cosechar y preparar organoides para su análisis por microscopía occidental o confocal y, por lo tanto, amplían la capacidad del ensayo organoide para estudiar los procesos celulares clave, incluida la diferenciación. Figura 1: Flujo de trabajo esquemático para generar organoides de próstata para su recolección y análisis. La próstata total del ratón se disocia y las células epiteliales basales y luminales de la próstata se aíslan mediante la clasificación celular activada por fluorescencia a través de los protocolos establecidos18,19. Las células basales u luminales suspendidas en una mezcla de medios organoides de ratón y gel de matriz se chapan en anillos de gel de matriz. Después de 5 a 7 días de cultivo, los organoides son cosechados para su análisis por la mancha occidental o la microscopía confocal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Aislamiento de células epiteliales de próstata basales y luminales utilizando la clasificación celular activada por fluorescencia (FACS). Las células disociadas de la próstata del ratón se tiñen con DAPI, para distinguir las células vivas de las células muertas, y los anticuerpos superficiales, para distinguir basales de las células luminales, antes de FACS. Izquierda – Bloqueado en las células DAPI-. FSC-A – dispersión hacia adelante. Centro – Cerrado en Lin- células (CD45lo, CD31lo, Ter119lo). SSC-A – dispersión lateral. Derecha: Células basales (Bas) (EpCAMhi, CD49fhi),Células luminosas (Lum) (EpCAMhi,CD49fmid). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Establecimiento de organoides de próstata de ratón. (A) Enfoque esquemático de ilustración para generar un anillo de gel de matriz en un pozo de una placa de 24 pocillos. (B) Imágenes representativas de contraste de fase de organoides (plano de crecimiento 3D) y colonias bidimensionales (plano de crecimiento 2D) formadas 7 días después de enchapar las células epiteliales prostáticas en placas de 24 pocillos sin recubrimiento (Poly-HEMA (-)) o recubiertas (Poly-HEMA (+)). Las regiones en caja dentro del plano de crecimiento 2D se magnifican a la derecha. Barras de escala de 200 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 4: Análisis de la expresión del marcador de linaje en organoides de próstata por mancha occidental y microscopía confocal de montaje completo. (A) Imágenes representativas de contraste de fase de organoides derivados de basal (arriba) y derivados de la luminaria (inferior) después de 7 días de cultivo. Barra de escala a 100 m.(B) Análisis de manchas occidentales de organoides derivados de basales (Bas) y derivados de la luminaria (Lum) después de 5 días de cultivo. Tinción para el marcador basal, citoqueratina 5 (K5), y el marcador luminal, citoqueratina 8 (K8), y un control de carga, histona H3 (HH3). (C) Esquema ilustrando la cubierta con cámara con espaciadores. (D) Contraste de interferencia diferencial (DIC) representativo e imágenes inmunofluorescentes de organoides derivados de basal (arriba) y derivados de la luminaria (abajo) después de 7 días de cultivo. Tinción para p63 (rojo), K8 (verde) y DAPI (azul) individualmente y fusionado. Barras de escala a 100 m. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Recetas Medios que contienen la dispensa 1 mg/ml de dosis + inhibidor DE ROCK de 10 M en DMEM F12 avanzado. El filtro esteriliza con un filtro de 0,22 m. Medios de disociación 10% FBS + 1x Penicilina-Estreptomicina en RPMI 1640. El filtro esteriliza con un filtro de 0,22 m. Tampón de lisis proteica Tampón de RIPA + inhibidores de la fosfatasa + inhibidores de la proteasa Solución de bloqueo 10% FBS en PBS con 0.2% Triton X-100 Tabla 1: Instrucciones para la preparación de soluciones clave. Componente Concentración B-27 1x (diluido a partir de 50x concentrado) GlutaMAX 1x (diluido a partir de 100x concentrado) N-acetil-L-cisteína 1,25 mM Normocin 50 g/ml EGF humano recombinante, libre de animales 50 ng/mL Noggin humano recombinante 100 ng/mL Medios con condición R-spondin 1 10% de medios acondicionados A83-01 200 nM Dht 1 nM Dihidrocloruro Y-27632 (inhibidor de LA NA) 10 m DMEM avanzado/F-12 Medios base R-spondin 1-conditioned media se genera como se describe en Drost, et al.13. Después de la adición de todos los componentes, el filtro esteriliza los medios organoides del ratón con un filtro de 0,22 m. El inhibidor DE LA ROCK sólo se añade durante el establecimiento del cultivo y el passaging de organoides. Tabla 2: Instrucciones para la preparación de medios organoides de ratón. Protocolo para la preparación de placas recubiertas de Poli-HEMA 1 Añadir 0,25 g Poly-HEMA a 50 mL 98% EtOH. Disolver Poly-HEMA a 37oC en una coctelera. Este proceso toma al menos 4 h. 2 El filtro esteriliza Poly-HEMA con un filtro de 0,22 m. 3 Añadir 200 ml de solución de Poly-HEMA por pozo de una placa(s) de 24 pocillos. 4 Retire la tapa de la(s) placa(s) de 24 pocillos después de añadir Poly-HEMA y deje que la solución se evapore durante la noche. 5 Lave cada poca dos veces con PBS y asegúrese de que los pozos estén completamente secos antes de su almacenamiento después del lavado final. NOTA: La interrupción del recubrimiento Poly-HEMA durante el lavado podría contribuir al crecimiento en 2 dimensiones al enchapar las células epiteliales en el cultivo organoide. Para evitar daños en los pozos recubiertos con Poli-HEMA, evite el contacto directo con la punta de la pipeta durante el lavado. La integridad de los polos recubiertos con Poli-HEMA permanecerá intacta a menos que el Poly-HEMA sea raspado por la punta de la pipeta. 6 Las placas recubiertas de poli-HEMA se pueden almacenar a 4 oC durante un máximo de dos semanas. NOTA: Las placas de envoltura en parafilm antes del almacenamiento reducirán el riesgo de contaminación. Tabla 3: Protocolo para la preparación de placas recubiertas de Poli-HEMA.

Discussion

La diferenciación de células epiteliales de próstata se ha implicado tanto en la biología normal de la próstata^2,3,4,5,6,7 y la biología de la enfermedad^8,10,11,12; sin embargo, los reguladores maestros de este proceso siguen sin definirse. Identificar los reguladores clave de la diferenciación de células epiteliales de próstata ha sido difícil en parte debido a la ausencia de contextos bien establecidos para modelarlo. Mientras que el cultivo monocapa 2D se puede utilizar para modelar la diferenciación^11,12, este contexto no logra recapitular el microambiente de próstata complejo. Además, los contextos in vivo para la diferenciación de modelos no se prestan a los estudios mecánicos, ya que son difíciles de manipular. Por lo tanto, la identificación de un contexto fácil de manipular, pero fisiológicamente relevante, para estudiar la diferenciación es fundamental.

El modelo organoide prostático representa un contexto elegante ex vivo donde se reporta la diferenciación basal a luminal. Los métodos para establecer los organoides de próstata están bien establecidos^14; sin embargo, es necesaria una mayor optimización de estos métodos. Además, los enfoques para cosechar y preparar organoides de próstata para el análisis no se describen claramente. Este artículo describe un enfoque para placar células epiteliales de próstata aisladas de la próstata del ratón en el cultivo organoide. Este enfoque permite a los investigadores (1) prevenir la aparición de colonias 2D durante la formación de organoides, (2) reducir el riesgo de interrupción del gel de matriz durante la reposición de medios, y (3) contar organoides más eficazmente. Además, este manuscrito describe enfoques para cosechar organoides para su preparación para el análisis de manchas occidentales, o microscopía confocal de montaje completo. Es importante destacar que el enfoque utilizado para preparar organoides para la microscopía confocal mantiene la estructura intacta de los organoides a lo largo de su duración, lo que reduce el daño organoide antes de la adquisición de la imagen. En conjunto, los enfoques descritos amplían las capacidades del ensayo organoide prostático.

En particular, la capacidad de formación de organoides de las células basales y luminales puede ser alterada tanto por los métodos utilizados para aislar las respectivas poblaciones, como por las condiciones de cultivo. Las condiciones de cultivo organoides utilizadas en este ensayo fueron descritas por primera vez por Karthaus et al.¹³. Mientras que Karthaus et al. han informado de que las células basales tienen una mayor capacidad de formación de organoides (15%) que las células luminales (1%)¹³, Chua et al., utilizando métodos de aislamiento y condiciones de cultivo distintos, han informado de que las células luminales (0,2-0,3%) tienen una mayor capacidad de formación de organoides que las células basales (0,03%)²⁰. En general, los métodos descritos por Karthaus y otros conducen a mayores tasas de formación de organoides para las células basales y luminales, probablemente reflejando las diferencias en el enfoque utilizado para aislar las células basales y luminales^13,a diferencia de las condiciones de cultivo que sesgan la formación organoideria de las células luminales. No está claro si el protocolo descrito en este manuscrito favorece la formación de organoides luminales a partir de progenitores luminales multipotentes, o progenitores de luminal^{comprometidos 9.} Aunque son oportunos y prohibitivos para los costos, los estudios de trazado de linaje in vivo se pueden utilizar para validar las características progenitoras asociadas con linajes epiteliales de próstata distintos que se aclaran en el ensayo organoide.

Procesos como el desarrollo, la diferenciación y la transformación no sólo son relevantes para la biología de la próstata, sino también relevantes para la biología de otros tejidos como el cerebro, pulmón, intestino, páncreas e hígado. Los métodos descritos facilitan la utilización del modelo organoide para estudiar estos procesos no sólo en la próstata, sino también en una amplia gama de tejidos.

Materials

µ-Dish 35mm, high	ibidi	81156
16% Paraformaldehyde	Thermo Fisher Scientific	50-980-487
4’,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Thermo Fisher Scientific	D1306
A83-01	Tocris	2939
Advanced DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010
APC/Cy7 anti-mouse CD326 (Ep-CAM) Antibody, 100 ug	BioLegend	118218
B-27 Supplement (50x), Serum Free	Thermo Fisher Scientific	17504044
cOmplete Protease Inhibitor Cocktail	Sigma	11836145001
(DiHydro)testosterone (5α-Androstan-17β-ol-3-one)	Sigma	A-8380
Dispase II, Powder	Thermo Fisher Scientific	17-105-041
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma	F8667
FITC anti-mouse CD31 Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug)	BioLegend	102405
FITC anti-mouse CD45 Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug)	BioLegend	103107
FITC anti-mouse TER-119/Erythroid Cells Antibody (0.5 mg/ml, 50 ug)	BioLegend	116205
Goat anti-mouse IgG-Alexa Fluor 488	Invitrogen	A28175
Goat anti-rabbit IgG-Alexa Fluor 594	Invitrogen	A11012
GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061
Halt Phosphatase Inhibitor	Thermo Fisher Scientific	78428
Matrigel GFR Membrane Matrix	Corning	CB-40230C
Mouse anti-cytokeratin 8	BioLegend	904804
N-acetyl-L-cysteine	Sigma	A9165
Normocin	Thermo Fisher Scientific	ant-nr-1
PE anti-human/mouse CD49f Antibody	BioLegend	313612
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Thermo Fisher Scientific	15-140-122
Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (Poly-HEMA)	Sigma	P3932-25G
Rabbit anti-p63	BioLegend	619002
Radioimmunoprecipitation assay (RIPA)	Thermo Fisher Scientific	PI89901
Recombinant Human EGF, Animal-Free	PeproTech	AF-100-15
Recombinant Human Noggin	PeproTech	120-10C
RPMI 1640 Medium, HEPES (cs of 10)	Thermo Fisher Scientific	22400105
Sonic Dismembrator	Thermo Fisher Scientific	FB120
Sucrose	Sigma	S0389-500G
Triton X-100	Sigma	X100-5ML
Y-27632 dihydrochloride (ROCK inhibitor)	Selleck Chemical	S1049-50MG