Detta protokoll möjliggör optimering och efterföljande effektiv generering av nukleära och cytoplasmiska fraktioner från primära kroniska lymfocytiska leukemiceller. Dessa prover används för att bestämma protein lokalisering samt förändringar i protein handel som sker mellan kärn-och cytoplasmiska fack vid cell stimulering och läkemedelsbehandling.
Kärn exporten av makromolekyler är ofta avreglerad i cancerceller. Tumör suppressor proteiner, såsom p53, kan göras inaktiva på grund av avvikande cellulära lokalisering störa deras verkningsmekanism. Överlevnaden för kroniska lymfatisk leukemi (KLL) celler, bland andra cancerceller, biträds av avregleringen av kärnkraft till cytoplasmiska shuttling, åtminstone delvis genom avreglering av transport receptor XPO1 och den konstitutiva aktiveringen av PI3K-medierade signalvägar. Det är viktigt att förstå den roll som enskilda proteiner i samband med deras intracellulära plats för att få en djupare förståelse för den roll som sådana proteiner i patobiologi av sjukdomen. Dessutom kommer identifiering av processer som ligger bakom cellstimulering och verkningsmekanismen för specifika farmakologiska hämmare, i samband med subcellulär protein handel, att ge en mer heltäckande förståelse av mekanismen för Åtgärder. Det protokoll som beskrivs här möjliggör optimering och efterföljande effektiv generering av nukleära och cytoplasmiska fraktioner från primära kroniska lymfocytiska leukemiceller. Dessa fraktioner kan användas för att bestämma förändringar i protein handeln mellan de nukleära och cytoplasmiska fraktioner på cell stimulering och läkemedelsbehandling. Uppgifterna kan kvantifieras och presenteras parallellt med Immunofluorescerande bilder, vilket ger robusta och kvantifierbara data.
Transporten av makromolekyler mellan kärnan och cytoplasman har länge etablerats för att spela en nyckelroll i normal cellulär funktion och är ofta avreglerad i cancerceller1,2. En sådan avreglering kan bero på överuttryck/mutation av proteiner som kontrollerar kärn exporten. Ett sådant protein Exportin-1 (XPO1), är en transport receptor som exporterar > 200 nukleär export signal (NES)-innehållande proteiner i cytoplasman från Nucleus2. XPO1-Cargos inkluderar p53, foxo familjemedlemmar och IB, bidrar till deras inaktivering genom att hämma deras verkningsmekanism1,2,3. Ytterligare protein mislocalization kan inträffa när mikromiljö signaler inkräkta på cancerceller, vilket leder till aktivering av intracellulära signalvägar såsom fosfatidyl-inositol-3-Kinas (PI3K)/akt väg, vilket resulterar i inaktivering av foxo familjemedlemmar och efterföljande export från Nucleus4,5. Sådan mislokalisering av tumör suppressor proteiner har varit inblandad i utvecklingen av ett antal hematologiska och solida tumörer1,2,6.
Utvecklingen av små molekyler hämmare för klinisk användning i hematologiska maligniteter (akut myeloisk leukemi (AML)/KLL), som binder till och selektivt hämma XPO1 funktion, understryker vikten av att utveckla lämpliga tekniker för att hantera effekterna av farmakologiska medel på shuttling av proteiner mellan kärn-och cytoplasmiska fack6,7,8. Imaging tekniker har avancerat avsevärt möjliggöra identifiering av proteiner i subcellulära fack vid extern stimulering av läkemedelsbehandlingar, men vikten av robusta och stödjande parallella tekniker är avgörande för att tillförlitligt informera en vetenskaplig publik om giltigheten av ett resultat.
Vilande lymfocyter och maligna CLL-B-celler isolerade från patientens blodprov utgör en utmaning i generering av nukleära och cytoplasmiska fraktioner på grund av den höga nukleära: cytoplasmiska förhållandet. Optimering av experimentella förhållanden för att generera robusta och pålitliga experimentella data är naturligtvis avgörande för att planera framtida experimentella program. Den metod som beskrivs här möjliggör kvantifiering av proteiner i nukleära och cytoplasmiska fraktioner och avgör hur dessa proteiner kan påverkas av cellulär stimulering och/eller läkemedelsbehandling.
Det beskrivna protokollet ger en snabb och effektiv metod för generering av nukleära och cytoplasmiska fraktioner från primära KLL-celler, och efterföljande kvantifiering av protein handel mellan nukleära och cytoplasmiska fraktioner vid cellstimulering och läkemedelsbehandling. De data som presenteras visar förmågan att upptäcka handel med specifika proteiner, till exempel FOXO1, mellan de nukleära och cytoplasmiska fraktioner, vid behandling med en dual mTOR hämmare AZD8055 i närvaro/frånvaro av BCR tvärbindning genom F ( AB ‘)2 fragment stimulering (figur 3 och figur 4). Koppling dessa experiment med kvantifiering av västerländska blotting från enskilda KLL patientprover, möjliggör objektiva analyser av de data som genereras och visar robustheten av analysen beskrivs för att kvantifiera globala förändringar i protein lokalisering i CLL-celler som isolerats från patient kohorter (figur 4). Det framgår av uppgifterna att ett genomsnitt av fem patientprover i cytoplasmiska fraktioner nådde nära betydelse. Med tanke på den kliniska heterogeniteten hos KLL-patienter11, skulle dessa analyser normalt utföras på större patient kohorter, och/eller fokuserat på specifika prognostiska undergrupper av patienter för att få en fylligare förståelse för cellulär respons av KLL celler till specifika läkemedelsbehandlingar.
De uppgifter som presenteras visar vikten av att välja protein markörer som uteslutande vistas i antingen cytoplasmiska eller nukleära fraktioner, som renhet av fraktionering kommer att bekräftas av dessa markörer. β-tubulin valdes för att bekräfta cytoplasmiska fraktion och Lamin A/C som en nukleär markör. Ytterligare proteiner som vanligen används är GAPDH och α-tubulin för att identifiera cytoplasmiska fraktionen eller Brg1 (SMARCA4), TFIID och RNA-polymeras II för kärn fraktion renhet4,5. Emellertid, försiktighet måste iakttas när man väljer proteiner som är mycket berikade i specifika fraktioner, och inte förekommer i båda fraktioner (t. ex., γ-tubulin) (figur 2C)9. Faktum GAPDH och aktin medan allmänt anses vara cytoplasmiska proteiner kan lokalisera till kärnan12,13, belyser vikten av att välja en bråkdel markör som inte flyttar när stimulering eller behandling är appliceras på cellerna. Dessutom är det viktigt att bekräfta att den valda protein markören uttrycks i cellen av intresse genom att köra WCL vid sidan av de subcellulära fraktionationerna.
I det representativa experiment som visas användes samma antal KLL-celler för varje tillstånd (stimulering/läkemedelsbehandling), och därefter bereddes fraktioneringsproverna omedelbart. Lastning 10 μg fraktionerat protein/Lane ger tillräckligt med material för detektion av proteiner av intresse. Eftersom dessa prover endast genomgick en kortsiktig läkemedelsbehandling och stimulering (upp till 4 timmar), antogs det att proteinnivån skulle förbli densamma i varje prov, och en proteinanalys utfördes inte. Men om cell behandlingar förlängs (18-72 h), nivån av celldöd eller spridning i celler kan avsevärt förändra kvaliteten och mängden av protein som utvinns, beroende på drogen/cell stimulering tillämpas, därmed förändra proteinnivåer i den behandlade /stimulerade prover. I dessa fall för längre sikt läkemedelsbehandlingar, är det tillrådligt att utföra protein kvantifiering med hjälp av en Bradford analys eller motsvarande, före Western blotting att se till att samma mängd protein körs i varje körfält i immunoblot. Förekomsten av tvätt-och rengöringsmedel kan störa specifika protein analyser14, kan denna störning minskas genom att späda cell fraktion protein prover. Använd dessutom hela lyseringsbufferten som blind, med samma utspädning som i proven som testas.
För att tillhandahålla stödjande bevis för fynd som beskrivs här kan parallella experiment utföras med fluorescensmikroskopi för att analysera placeringen av FOXO1 inom KLL-celler för att möjliggöra visualisering av dessa fynd5. Dessutom kan de subcellulära fraktioner som genereras också användas för enzymaktivitet analyser eller proteomik analys i ytterligare nedströms analyser.
The authors have nothing to disclose.
Författarna skulle vilja tacka Dr Natasha Malik för kritiskt granska manuskriptet. Denna studie finansierades av ett Blodklokt projektbidrag som tilldelades AMM (18003). FACS analys anläggningar finansierades av Howat Foundation. MWM finansierades av en doktorandanställning från Friends of Paul o ‘ Gorman leukemi Research Centre, JC finansierades av Friends of Paul o ‘ Gorman leukemi Research Centre och JH finansierades av en Bloodwise projekt Grant (18003).
1.5 mL microcentrifuge Tubes | Griener Bio one | 616201 | |
3 mL Pasteur Pipettes | Griener Bio one | 612398 | |
12 mm x 75 mm FACS Tubes | Elkay | 2052-004 | |
15 mL Tube | Griener Bio one | 188271 | |
50 mL Tube | Griener Bio one | 227261 | |
anti-CD5 FITC antibody | BD Biosciences | 555352 | phenotypic surface marker |
anti-CD19 PE Cy7 antibody | BD Biosciences | 557835 | phenotypic surface marker |
anti-CD23 APC antibody | BD Biosciences | 558690 | phenotypic surface marker |
anti-CD45 APC Cy7 antibody | BD Biosciences | 557833 | phenotypic surface marker |
anti-β-Tubulin antibody | Cell Signaling | 2146 | cytoplasmic marker |
anti-γ-Tubulin Mouse antibody (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T5326 | |
anti-FoxO1 (C29H4) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2880 | |
anti-Lamin A/C antibody | Cell Signaling | 2032 | nuclear marker |
anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | Secondary antibody |
anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody |
anti-Rpb1 CTD antibody (clone 4H8) | Cell Signaling | 2629 | nuclear marker |
BDFACS Canto II | BD Biosciences | By Request | Flow Cytometer |
DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | live/dead discriminator |
DMSO | Sigma | D2650 | |
EDTA | Sigma | EDS | |
Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 10500064 | |
GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | Software | |
Histopaque1077 density gradient media | Sigma | H8889 | |
HyperPAGE 10 – 190 kDa protein marker | Bioline | BIO-33066 | Molecular weight marker |
Image Studio Lite (version 5.2.5) | LI-COR | www.licor.com | Software |
Labnet VX100 | Fisher Scientific | Vortex | |
Nucelar Extract Kit | Active Motif | 40010 | |
OneComp eBeads | Thermofisher | 01-111-42 | |
Trypan Blue Solution | Thermofisher | 15250061 | |
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26619 | Molecular weight marker |
PBS Tablets | Fisher Scientific | BR0014G | |
RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15064 | |
Sigma 3-16P | SciQuip | Centrifuge | |
Sigma 1-15PK | SciQuip | Centrifuge |