Denne protokol muliggør optimering og efterfølgende effektiv generation af nukleare og cytoplasmiske fraktioner fra primære kroniske lymfocytiske leukæmiceller. Disse prøver bruges til at bestemme protein lokalisering samt ændringer i protein handel, der finder sted mellem de nukleare og cytoplasmiske rum på celle stimulation og narkotikabehandling.
Nuklear eksport af makromolekyler er ofte dereguleret i kræftceller. Tumor suppressor proteiner, såsom P53, kan gøres inaktive på grund af afvigende cellulære lokalisering forstyrre deres virkningsmekanisme. Overlevelsen af kronisk lymfatisk leukæmi (CLL) celler, blandt andre kræftceller, er bistået af deregulering af nukleare til cytoplasmisk fjer, i det mindste delvis gennem deregulering af transport receptor XPO1 og konstitutiv aktivering af PI3K-medierede signalering veje. Det er vigtigt at forstå den rolle, individuelle proteiner i forbindelse med deres intracellulære placering at få en dybere forståelse af rollen af sådanne proteiner i patogenbiologi af sygdommen. Desuden vil identificering af processer, der ligger til grund for celle stimulering og virkningsmekanismen for specifikke farmakologiske inhibitorer i forbindelse med subcellulær protein handel, give en mere omfattende forståelse af mekanismen for Handling. Den protokol, der er beskrevet her, gør det muligt at optimere og efterfølgende effektiv generering af nukleare og cytoplasmiske fraktioner fra primære kroniske lymfocytiske leukæmiceller. Disse fraktioner kan bruges til at bestemme ændringer i protein handel mellem de nukleare og cytoplasmiske fraktioner ved celle stimulation og narkotikabehandling. Dataene kan kvantificeres og præsenteres parallelt med immunfluorescent billeder, hvilket giver solide og kvantificerbare data.
Transport af makromolekyler mellem kernen og cytoplasmaet har længe været etableret for at spille en central rolle i normal cellulære funktion og er ofte dereguleret i kræftceller1,2. En sådan deregulering kan skyldes over ekspression/mutation af proteiner, der kontrollerer nuklear eksport. En sådan protein Exportin-1 (XPO1), er en transport receptor, der eksporterer > 200 nukleare eksport signal (NES)-indeholdende proteiner i cytoplasmaet fra Nucleus2. XPO1-Cargos omfatter P53, foxo familiemedlemmer og Ib, hvilket bidrager til deres inaktivering ved at hæmme deres virkningsmekanisme1,2,3. Yderligere protein fejllokalisering kan forekomme, når mikromiljømæssige signaler indvirke på kræftcellerne, fører til aktivering af intracellulære signalerings veje såsom phosphatidyl-inositol-3-kinase (PI3K)/akt pathway, hvilket resulterer i inaktivering af foxo familiemedlemmer og efterfølgende eksport fra Nucleus4,5. En sådan fejllokalisering af tumor suppressor proteiner har været impliceret i progression af en række hæmatologiske og solide tumorer1,2,6.
Udviklingen af små molekyle hæmmere til klinisk brug i hæmatologiske maligniteter (akut myeloid leukæmi (AML)/CLL), som binder til og selektivt hæmmer XPO1 funktion, understreger vigtigheden af at udvikle passende teknikker til at løse de virkningen af farmakologiske midler på fjer ningen af proteiner mellem de nukleare og cytoplasmiske rum6,7,8. Imaging teknikker har fremskreden betydeligt gør det muligt at identificere proteiner i subcellulære rum ved ekstern stimulering af lægemidler behandlinger, men betydningen af robuste og støttende parallelle teknikker er afgørende for pålideligt informere et videnskabeligt publikum om gyldigheden af et resultat.
Hvilende lymfocytter og maligne CLL-B-celler isoleret fra patient blodprøver repræsenterer en udfordring i produktionen af nukleare og cytoplasmiske fraktioner på grund af den høje nukleare: cytoplasmisk ratio. Optimering af eksperimentelle betingelser for at generere robuste og pålidelige eksperimentelle data er naturligvis afgørende for at planlægge fremtidige eksperimentelle programmer. Den beskrevne metode muliggør kvantificering af proteiner i de nukleare og cytoplasmiske fraktioner og afgør, hvordan disse proteiner kan påvirkes af cellulær stimulation og/eller lægemiddelbehandling.
Den beskrevne protokol giver en hurtig og effektiv metode til generering af nukleare og cytoplasmiske fraktioner fra primære CLL-celler og efterfølgende kvantificering af protein handel mellem de nukleare og cytoplasmiske fraktioner ved celle stimulation og narkotikabehandling. De fremlagte data viser muligheden for at afsløre handel med specifikke proteiner, for eksempel FOXO1, mellem de nukleare og cytoplasmiske fraktioner, efter behandling med en dual MTOR-hæmmer AZD8055 i nærværelse af/fravær af BCR-binding-mekanismen gennem F ( AB ‘)2 fragment stimulation (figur 3 og figur 4). Sammenkobling af disse eksperimenter med kvantificering af vestlige blotter fra individuelle CLL-patientprøver muliggør objektiv analyse af de genererede data og viser robustheden af den beskrevne analyse for at kvantificere de globale ændringer i protein lokalisering i CLL-celler isoleret fra patient kohorter (figur 4). Det fremgår af dataene, at gennemsnittet af fem patientprøver i cytoplasmatiske fraktioner nåede nær betydning. I betragtning af den kliniske heterogenitet af CLL-patienter11, vil disse analyser normalt blive udført på større patient kohorter og/eller fokuseret på specifikke prognostiske undergrupper af patienter for at opnå en mere fyldigere forståelse af den cellulære respons af CLL celler til specifikke lægemidler behandlinger.
De præsenterede data viser vigtigheden af at vælge protein markører, der udelukkende bor i enten cytoplasmatiske eller nukleare fraktioner, da renheden af fraktionering vil blive bekræftet af disse markører. β-Tubulin blev valgt til en cytoplasmisk fraktion bekræftelse, og Lamin A/C som en nuklear markør. Yderligere anvendte proteiner er gapdh og α-Tubulin til identifikation af cytoplasmiske fraktion eller Brg1 (SMARCA4), tfiid og RNA polymerase II for nuklear fraktion renhed4,5. Der skal dog udvises forsigtighed ved valg af proteiner, der er meget berigede i specifikke fraktioner, og som ikke findes i begge fraktioner (f. eks. γ-Tubulin) (figur 2C)9. Faktisk gapdh og actin mens generelt anses for at være cytoplasmatiske proteiner kan lokalisere til Nucleus12,13, fremhæver betydningen af at vælge en brøkdel markør, der ikke flytter sig, når stimulation eller behandling er anvendes på cellerne. Desuden er det vigtigt at bekræfte, at den valgte protein markør udtrykkes i cellen af interesse ved at køre WCL sammen med subcellulære fraktioneringer.
I det viste repræsentative eksperiment blev det samme antal CLL-celler anvendt til hver betingelse (stimulation/lægemiddelbehandling), og derefter blev fraktionerings prøverne forberedt med det samme. Lastning 10 μg fraktioneret protein/Lane giver tilstrækkeligt materiale til påvisning af de proteiner af interesse. Da disse prøver kun gennemgik en kortvarig lægemiddelbehandling og stimulering (op til 4 timer), blev det antaget, at proteinniveauet ville forblive det samme i hver prøve, og der blev ikke udført en proteinanalyse. Men hvis celle behandlinger forlænges (18-72 h), kan niveauet af celledød eller spredning i celler betydeligt ændre kvaliteten og mængden af protein ekstraheret, afhængig af den anvendte stof/celle stimulation, hvilket ændrer protein niveauerne i den behandlede /stimulerede prøver. I disse tilfælde for længerevarende lægemidler behandlinger, er det tilrådeligt at udføre protein kvantificering ved hjælp af en Bradford assay eller tilsvarende, forud for vestlige blotting at sikre den samme mængde protein er kørt i hver vognbane af immunoblot. Tilstedeværelsen af vaskemidler kan interferere med specifikke protein assays14, kan denne interferens reduceres ved fortynding af celle fraktion protein prøver. Desuden anvendes den komplette lysis-buffer som blindprøve ved hjælp af den samme fortynding som i de prøver, der testes.
For at fremlægge dokumentation for de resultater, der er beskrevet her, kan parallelle eksperimenter udføres ved hjælp af Fluorescens mikroskopi for at analysere placeringen af FOXO1 inden for CLL-celler for at muliggøre visualisering af disse fund5. Desuden kan de genererede subcellulære fraktioner også anvendes til enzym aktivitets analyser eller proteomics-analyse i yderligere downstream-analyser.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Dr. Natasha Malik for kritisk gennemgang af manuskriptet. Denne undersøgelse blev finansieret af et Blodvis projekttilskud tildelt AMM (18003). FACS analyse faciliteter blev finansieret af Howat Foundation. MWM blev finansieret af en PhD Studentship fra Friends of Paul O’Gorman leukæmi Research Centre, JC blev finansieret af Friends of Paul O’Gorman leukæmi Research Center og JH blev finansieret af en Bloodwise projekt Grant (18003).
1.5 mL microcentrifuge Tubes | Griener Bio one | 616201 | |
3 mL Pasteur Pipettes | Griener Bio one | 612398 | |
12 mm x 75 mm FACS Tubes | Elkay | 2052-004 | |
15 mL Tube | Griener Bio one | 188271 | |
50 mL Tube | Griener Bio one | 227261 | |
anti-CD5 FITC antibody | BD Biosciences | 555352 | phenotypic surface marker |
anti-CD19 PE Cy7 antibody | BD Biosciences | 557835 | phenotypic surface marker |
anti-CD23 APC antibody | BD Biosciences | 558690 | phenotypic surface marker |
anti-CD45 APC Cy7 antibody | BD Biosciences | 557833 | phenotypic surface marker |
anti-β-Tubulin antibody | Cell Signaling | 2146 | cytoplasmic marker |
anti-γ-Tubulin Mouse antibody (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T5326 | |
anti-FoxO1 (C29H4) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2880 | |
anti-Lamin A/C antibody | Cell Signaling | 2032 | nuclear marker |
anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | Secondary antibody |
anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody |
anti-Rpb1 CTD antibody (clone 4H8) | Cell Signaling | 2629 | nuclear marker |
BDFACS Canto II | BD Biosciences | By Request | Flow Cytometer |
DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | live/dead discriminator |
DMSO | Sigma | D2650 | |
EDTA | Sigma | EDS | |
Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 10500064 | |
GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | Software | |
Histopaque1077 density gradient media | Sigma | H8889 | |
HyperPAGE 10 – 190 kDa protein marker | Bioline | BIO-33066 | Molecular weight marker |
Image Studio Lite (version 5.2.5) | LI-COR | www.licor.com | Software |
Labnet VX100 | Fisher Scientific | Vortex | |
Nucelar Extract Kit | Active Motif | 40010 | |
OneComp eBeads | Thermofisher | 01-111-42 | |
Trypan Blue Solution | Thermofisher | 15250061 | |
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26619 | Molecular weight marker |
PBS Tablets | Fisher Scientific | BR0014G | |
RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15064 | |
Sigma 3-16P | SciQuip | Centrifuge | |
Sigma 1-15PK | SciQuip | Centrifuge |