इस प्रोटोकॉल अनुकूलन और प्राथमिक क्रोनिक लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं से परमाणु और साइटोप्लाज्मिक भिन्नों के बाद कुशल पीढ़ी सक्षम बनाता है। इन नमूनों को प्रोटीन स्थानीयकरण के रूप में के रूप में अच्छी तरह से प्रोटीन की तस्करी है कि सेल उत्तेजना और दवा उपचार पर परमाणु और कोशिका द्रव्य डिब्बों के बीच जगह ले में परिवर्तन निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है.
मैक्रो अणुओं के परमाणु निर्यात अक्सर कैंसर कोशिकाओं में अविनियमित है. ट्यूमर निरोधक प्रोटीन, जैसे p53, aberant सेलुलर स्थानीयकरण कार्रवाई के अपने तंत्र को बाधित करने के कारण निष्क्रिय प्रदान किया जा सकता है. पुरानी लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया (CLL) कोशिकाओं के अस्तित्व, अन्य कैंसर कोशिकाओं के बीच, कोशिका द्रव्य बंद करने के लिए परमाणु के विनियमन द्वारा सहायता प्रदान की है, कम से कम भाग में परिवहन रिसेप्टर XPO1 के विनियमन और के गठन सक्रियण के माध्यम से PI3K-मध्यस्थ संकेतन पथ. रोग के रोग विज्ञान में ऐसे प्रोटीन की भूमिका की गहरी समझ प्राप्त करने के लिए अपने इंट्रासेल्यूलर स्थान के संदर्भ में अलग-अलग प्रोटीन की भूमिका को समझना आवश्यक है। इसके अलावा, प्रक्रियाओं की पहचान है कि underlie सेल उत्तेजना और विशिष्ट औषधीय inhibitors की कार्रवाई के तंत्र, subcellular प्रोटीन तस्करी के संदर्भ में, के तंत्र की एक अधिक व्यापक समझ प्रदान करेगा कार्रवाई. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल अनुकूलन और प्राथमिक क्रोनिक लिम्फोसाइटिक ल्यूकेमिया कोशिकाओं से परमाणु और साइटोप्लाज्मिक भिन्नों के बाद कुशल पीढ़ी सक्षम बनाता है। इन अंशों सेल उत्तेजना और दवा उपचार पर परमाणु और साइटोप्लाज्मिक भिन्नों के बीच प्रोटीन की तस्करी में परिवर्तन का निर्धारण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. डेटा मात्रा निर्धारित किया जा सकता है और इम्यूनोफ्लोरेसेंट छवियों के साथ समानांतर में प्रस्तुत किया, इस प्रकार मजबूत और परिमाणात्मक डेटा प्रदान.
नाभिक और कोशिकाद्रव्य के बीच स्थूल अणुओं का परिवहन लंबे समय से सामान्य कोशिकीय फलन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाने के लिए स्थापित किया गया है और यह प्राय : कैंसर कोशिकाओं1,2में नियंत्रणमुक्त होता है . इस तरह के विनियमन परमाणु निर्यात को नियंत्रित करने वाले प्रोटीन के अतिअभिव्यक्ति/परिवर्तन से परिणाम कर सकते हैं। ऐसा ही एक प्रोटीन एक्सपोर्टिन-1 (XPO1), एक परिवहन ग्राही है जो नाभिक2से कोशिकाद्रव्य में प्रोटीन का निर्यात करता है। XPO1-कार्गो में p53, FOXO परिवार के सदस्य और आईबी शामिल हैं, जो उनके कार्य तंत्र1,2,3को बाधित करके निष्क्रियता में योगदान देते हैं। इसके अलावा प्रोटीन mislocalization हो सकता है जब सूक्ष्म पर्यावरण संकेतकैंसर कोशिकाओं पर impinge, इस तरह के फॉस्फेटिडिल-inositol-3-kinase (PI3K) / फॉक्सओ परिवार के सदस्यों की निष्क्रियता और बाद में नाभिक से निर्यात4,5. ट्यूमर निरोधक प्रोटीन के इस प्रकार के कुस्थानीकरण को कई हेमेटोलॉजिकल और ठोस ट्यूमर1,2,6की प्रगति में फंसाया गया है .
हेमेटोलॉजिकल द्रोह में नैदानिक उपयोग के लिए छोटे अणु अवरोधकों का विकास (तीव्र माइलॉयड ल्यूकेमिया (एएमएल)/CLL), जो XPO1 फ़ंक्शन को बांधता है और चुनिंदा रूप से बाधित करता है, उचित तकनीकों को संबोधित करने के लिए उचित तकनीकों के विकास के महत्व को रेखांकित करता है परमाणु और कोशिकाद्रव्यी डिब्बों के बीच प्रोटीन ों को बंद करने पर औषधीय एजेंटों का प्रभाव6,7,8. इमेजिंग तकनीक काफी दवा उपचार के बाहरी उत्तेजना पर subcellular डिब्बों में प्रोटीन की पहचान को सक्षम करने से उन्नत है, तथापि, मजबूत और सहायक समानांतर तकनीकों के महत्व मज़बूती से महत्वपूर्ण है एक परिणाम की वैधता के एक वैज्ञानिक दर्शकों को सूचित.
आराम लिम्फोसाइटों और घातक CLL-बी कोशिकाओं रोगी रक्त के नमूने से अलग उच्च परमाणु के कारण परमाणु और कोशिका द्रव्य भिन्न की पीढ़ी में एक चुनौती का प्रतिनिधित्व: कोशिका द्रव्य अनुपात. मजबूत और विश्वसनीय प्रयोगात्मक डेटा उत्पन्न करने के लिए प्रयोगात्मक स्थितियों के अनुकूलन भविष्य प्रयोगात्मक कार्यक्रमों की योजना के लिए पाठ्यक्रम महत्वपूर्ण है। यहाँ वर्णित विधि परमाणु और कोशिकाद्रव्यी अंशों में प्रोटीन के परिमाणीकरण सक्षम बनाता है और निर्धारित करता है कि कैसे इन प्रोटीन सेलुलर उत्तेजना और /
प्रोटोकॉल वर्णित प्राथमिक CLL कोशिकाओं से परमाणु और कोशिकाद्रव्यी भिन्नों की पीढ़ी के लिए एक तेज और कुशल विधि प्रदान करता है, और सेल उत्तेजना पर परमाणु और कोशिकाद्रव्यी भिन्नों के बीच प्रोटीन की तस्करी के बाद परिमाणीकरण और दवा उपचार. प्रस्तुत किए गए डेटा विशिष्ट प्रोटीन की तस्करी का पता लगाने की क्षमता को दर्शाता है, उदाहरण के लिए, FOXO1, परमाणु और कोशिकाद्रव्यी भिन्नों के बीच, एक दोहरी TOR अवरोध करनेवाला के साथ उपचार पर A$D8055 की उपस्थिति में / ab’)2 खंड उत्तेजना(चित्र 3 और चित्र 4)। व्यक्तिगत CLL रोगी नमूनों से पश्चिमी blots के परिमाणीकरण के साथ इन प्रयोगों युग्मन, उत्पन्न डेटा का उद्देश्य विश्लेषण सक्षम बनाता है और में प्रोटीन स्थानीयकरण में वैश्विक परिवर्तन की मात्रा निर्धारित करने के लिए वर्णित परख की मजबूती को दर्शाता है CLL कोशिकाओं रोगी सहगण से अलग (चित्र 4) . आंकड़ों से यह स्पष्ट है कि कोशिकाद्रव्यी अंशों में औसतन पांच रोगी नमूने महत्व के निकट पहुंच गए हैं। CLL रोगियों की नैदानिक विषमता को देखते हुए11, इन विश्लेषणों आमतौर पर बड़े रोगी सहगण पर किया जाएगा, और / विशिष्ट दवा उपचार के लिए कोशिकाओं.
प्रस्तुत डेटा प्रोटीन मार्करों है कि विशेष रूप से या तो कोशिका द्रव्य या परमाणु भिन्नों में रहते हैं चुनने के महत्व को प्रदर्शित करता है, के रूप में भिन्नीकरण की शुद्धता इन मार्करों द्वारा पुष्टि की जाएगी. साइटोप्लाज्मिक अंश पुष्टि के लिए जेड-ट्यूबुलिन को चुना गया था, और एक परमाणु मार्कर के रूप में Lamin A/ आमतौर पर इस्तेमाल किए जाने वाले अतिरिक्त प्रोटीन कोशिकाद्रव्यी अंश या ब्रज1 (SMARCA4), TFIID और RNA पॉलिमरेज II को परमाणु अंश शुद्धता के लिए4,5की पहचान करने के लिए जीएपीडीएच और जेड-टूबुलिन हैं। हालांकि, प्रोटीन है कि अत्यधिक विशिष्ट भागों में समृद्ध हैं चुनने के दौरान ध्यान रखा जाना चाहिए, और दोनों भागों में मौजूद नहीं (उदा., जेड-ट्यूबुलिन) (चित्र 2ब्)9. वास्तव में, GAPDH और actin जबकि आम तौर पर कोशिका द्रव्य प्रोटीन माना जाता है नाभिक के लिए स्थानीयकृत कर सकते हैं12,13, एक अंश मार्कर है कि जब उत्तेजना या उपचार स्थानांतरित नहीं करता है चुनने के महत्व पर प्रकाश डाला कोशिकाओं पर लागू होता है. इसके अलावा, यह पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण है कि चुना प्रोटीन मार्कर उपकोशिकीय अंशकेतः के साथ WCL चलाकर ब्याज की कोशिका में व्यक्त किया जाता है.
दिखाए गए प्रतिनिधि प्रयोग में, प्रत्येक स्थिति (उत्तेजना/दवा उपचार) के लिए कुलाकोशिका कोशिकाओं की समान संख्या का उपयोग किया गया था, और उसके बाद भिन्नण नमूने तुरंत तैयार किए गए थे। भिन्नप्रोटीन/लेन के 10 डिग्री ग्राम लोड करने से ब्याज के प्रोटीन का पता लगाने के लिए पर्याप्त सामग्री उपलब्ध होती है। के रूप में इन नमूनों को केवल एक अल्पकालिक दवा उपचार और उत्तेजना लिया (अप करने के लिए 4 ज), यह माना गया था कि प्रोटीन स्तर प्रत्येक नमूने में ही रहेगा, और एक प्रोटीन परख नहीं किया गया था. हालांकि, अगर सेल उपचार बढ़ा रहे हैं (18 – 72 एच), कोशिकाओं में सेल मौत या प्रसार के स्तर काफी गुणवत्ता और निकाले गए प्रोटीन की मात्रा को बदल सकते हैं, दवा पर निर्भर / / प्रेरित नमूने. लंबी अवधि के दवा उपचार के लिए इन मामलों में, यह एक ब्रैडफोर्ड परख या समकक्ष का उपयोग कर प्रोटीन परिमाणीकरण बाहर ले जाने के लिए सलाह दी जाती है, पश्चिमी blotting से पहले यह सुनिश्चित करने के लिए प्रोटीन की एक ही राशि इम्यूनोब्लॉट के प्रत्येक लेन में चलाया जाता है. डिटर्जेंट की उपस्थिति विशिष्ट प्रोटीन assays14के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं, इस हस्तक्षेप सेल अंश प्रोटीन नमूने को कम करके कम किया जा सकता है. इसके अलावा, रिक्त के रूप में पूरा lysis बफर का उपयोग करें, नमूनों में परीक्षण किया जा रहा है के रूप में एक ही कमजोर पड़ने का उपयोग.
यहाँ वर्णित निष्कर्षों के लिए सहायक साक्ष्य प्रदान करने के लिए, इननिष्कर्षोंके दृश्य को सक्षम करने के लिए CLL कोशिकाओं के भीतर FOXO1 के स्थान का विश्लेषण करने के लिए फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके समानांतर प्रयोग किए जा सकते हैं। इसके अलावा, उत्पन्न subcellular अंश भी आगे बहाव विश्लेषण में एंजाइम गतिविधि assays या proteomics विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
The authors have nothing to disclose.
लेखक पांडुलिपि की समीक्षा के लिए डॉ नताशा मलिक को धन्यवाद देना चाहेंगे। इस अध्ययन को एएमएम (18003) को दिए गए रक्तवार परियोजना अनुदान द्वारा वित्त पोषित किया गया था। FACS विश्लेषण सुविधाओं Howat फाउंडेशन द्वारा वित्त पोषित किया गया. MWM पॉल O’Gorman Lekaemia अनुसंधान केंद्र के दोस्तों से एक पीएचडी छात्र द्वारा वित्त पोषित किया गया था, जेसी पॉल O’Gorman Lekaemia अनुसंधान केंद्र के दोस्तों द्वारा वित्त पोषित किया गया था और जेएच एक रक्तवार परियोजना अनुदान (18003) द्वारा वित्त पोषित किया गया.
1.5 mL microcentrifuge Tubes | Griener Bio one | 616201 | |
3 mL Pasteur Pipettes | Griener Bio one | 612398 | |
12 mm x 75 mm FACS Tubes | Elkay | 2052-004 | |
15 mL Tube | Griener Bio one | 188271 | |
50 mL Tube | Griener Bio one | 227261 | |
anti-CD5 FITC antibody | BD Biosciences | 555352 | phenotypic surface marker |
anti-CD19 PE Cy7 antibody | BD Biosciences | 557835 | phenotypic surface marker |
anti-CD23 APC antibody | BD Biosciences | 558690 | phenotypic surface marker |
anti-CD45 APC Cy7 antibody | BD Biosciences | 557833 | phenotypic surface marker |
anti-β-Tubulin antibody | Cell Signaling | 2146 | cytoplasmic marker |
anti-γ-Tubulin Mouse antibody (clone GTU-88) | Sigma-Aldrich | T5326 | |
anti-FoxO1 (C29H4) Rabbit antibody | Cell Signaling | 2880 | |
anti-Lamin A/C antibody | Cell Signaling | 2032 | nuclear marker |
anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7076 | Secondary antibody |
anti-rabbit IgG, HRP-linked Antibody | Cell Signaling | 7074 | Secondary antibody |
anti-Rpb1 CTD antibody (clone 4H8) | Cell Signaling | 2629 | nuclear marker |
BDFACS Canto II | BD Biosciences | By Request | Flow Cytometer |
DAPI Solution | BD Biosciences | 564907 | live/dead discriminator |
DMSO | Sigma | D2650 | |
EDTA | Sigma | EDS | |
Fetal Bovine Serum | Thermofisher | 10500064 | |
GraphPad Prism 6 | GraphPad Software | Software | |
Histopaque1077 density gradient media | Sigma | H8889 | |
HyperPAGE 10 – 190 kDa protein marker | Bioline | BIO-33066 | Molecular weight marker |
Image Studio Lite (version 5.2.5) | LI-COR | www.licor.com | Software |
Labnet VX100 | Fisher Scientific | Vortex | |
Nucelar Extract Kit | Active Motif | 40010 | |
OneComp eBeads | Thermofisher | 01-111-42 | |
Trypan Blue Solution | Thermofisher | 15250061 | |
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder | Thermo Fisher Scientific | 26619 | Molecular weight marker |
PBS Tablets | Fisher Scientific | BR0014G | |
RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail | Stem Cell Technologies | 15064 | |
Sigma 3-16P | SciQuip | Centrifuge | |
Sigma 1-15PK | SciQuip | Centrifuge |