यह प्रोटोकॉल एक एकीकृत रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) मंच प्रस्तुत करता है जो एकल-सेल संकल्प प्राप्त करने में सक्षम है। रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग दवाओं के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है, जबकि एमएस का उपयोग दवा तेज और चयापचय के लक्षित और मात्रात्मक विश्लेषण के लिए किया जा सकता है।
कोशिकाओं को दवाओं के प्रति उनकी प्रतिक्रियाओं में स्वाभाविक रूप से विषम माना जाता है। इसलिए, यह आवश्यक है कि एकल कोशिका विषमता दवा खोज अध्ययन में हिसाब है। यह एकल-कोशिका स्तर (यानी, दवा तेज, चयापचय और प्रभाव) पर कोशिका और दवा के बीच सेलुलर बातचीत की अधिकता को सही ढंग से मापने से प्राप्त किया जा सकता है। यह पेपर दवाओं के जवाब में कोशिकाओं के मेटाबोलिक बदलावों की निगरानी के लिए एक एकल सेल रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री (एमएस) मंच का वर्णन करता है। इस प्लेटफ़ॉर्म का उपयोग करके, दवा के जवाब में मेटाबोलिक परिवर्तन ों को रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा जा सकता है, जबकि दवा और इसके मेटाबोलाइट को एक ही सेल में बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। परिणाम बताते हैं कि एकल-कोशिका स्तर पर दवा तेज, चयापचय और प्रतिक्रिया के बारे में जानकारी तक पहुंचना संभव है।
कोशिकाएं एकल-कोशिका स्तर पर अपने माइक्रोएनवायरमेंट में परिवर्तन के लिए अलग तरह से प्रतिक्रिया करती हैं, एक घटना जिसे सेलुलर विषमता1कहा जाता है। इसके बावजूद, वर्तमान दवा खोज अध्ययन सेल आबादी के औसत माप पर आधारित हैं, जो संभावित उपआबादी के साथ-साथ एकल-सेल विविधताओं2के बारे में जानकारी को अस्पष्ट करते हैं। यह लापता जानकारी समझा जा सकता है क्यों कुछ कोशिकाओं दवाओं के लिए अतिसंवेदनशील होते हैं, जबकि दूसरों को प्रतिरोधी हैं । दिलचस्प बात यह है कि दवा प्रतिक्रिया के बारे में एकल सेल जानकारी की कमी दवाओं के द्वितीय चरण के नैदानिक परीक्षणों की विफलता के लिए एक संभावित कारण है3। इसलिए, इस समस्या को हल करने के लिए, दवा (यानी, तेज, चयापचय और प्रतिक्रिया) के साथ सेलुलर बातचीत को एकल-कोशिका स्तर पर मापा जाना चाहिए।
इस लक्ष्य को हासिल करने के लिए, हमने एक अनूठी प्रणाली तैयार की है जिसमें जीवित एकल कोशिकाओं को लेबल-फ्री रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी का उपयोग करके जांच की जाती है, फिर बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री4का उपयोग करके आगे की विशेषता है। रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी सेलुलर राज्य का आणविक फिंगरप्रिंट प्रदान करता है, जो कोशिका के अंदर कई अणुओं के योगदान के परिणामस्वरूप एक जटिल स्पेक्ट्रम है । इस जटिलता के बावजूद, यह माना जा सकता है कि रमन उंगलियों के निशान एक पूरी कोशिका की संरचना और चयापचय5,6को प्रतिबिंबित करते हैं । रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी एक गैर-आक्रामक और अपेक्षाकृत उच्च थ्रूपुट तरीके से सेलुलर राज्यों को मापने में उत्कृष्टता प्राप्त करता है, जो इसे एकल-कोशिका स्तर पर दवा प्रतिक्रिया की स्क्रीनिंग और आकलन के लिए उपयोगी बनाता है।
इसके विपरीत, एमएस एकल सेल स्तर पर दवा तेज को मापने के लिए आवश्यक संवेदनशीलता और चयनात्मकता प्रदान करता है। चूंकि एमएस विनाशकारी है (नमूना [सेल] आमतौर पर विश्लेषण के दौरान भस्म हो जाता है), इसे गैर-विनाशकारी के साथ एकीकृत करता है, लेबल-मुक्त रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी एक उच्च थ्रूपुट और संवेदनशील प्रणाली प्रदान कर सकता है। यह संयुक्त मंच एकल-कोशिका स्तर पर दवा तेज, चयापचय और प्रभावों के बारे में अधिक जानकारी प्रदान करने में सक्षम है।
यह पांडुलिपि एक एकीकृत रमन-एमएस मंच का उपयोग करके इन विट्रो संस्कृतियों का उपयोग करके एकल-सेल स्तर पर दवाओं के साथ सेलुलर बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोग किए जाने वाले प्रोटोकॉल को स्पष्ट करती है। ऐसा करने के लिए, हेपेटोसेलुलर कार्सिनोमा कोशिकाओं (हेपग्2) और टैमोक्सिफेन का उपयोग मॉडल के रूप में किया जाता है। हेपग्2 कोशिकाओं को चुना गया क्योंकि वे टैमोक्सिफेन लेते हैं और दवा को चयापचय करते हैं, और वे इसके हेपेटोटॉक्सिक प्रभावों के कारण एक साथ प्रभावित होते हैं। इस पांडुलिपि में दो राज्यों का उपयोग किया जाता है: दवा-इलाज कोशिकाएं बनाम गैर-इलाज कोशिकाएं (नियंत्रण)।
इस पांडुलिपि में, एक साधारण मामला चुना गया था जिसमें हेपग्2 कोशिकाओं को टैमोक्सिफेन करने के लिए उजागर किया गया था (या नहीं)। कोशिकाओं पर टैमोक्सिफेन के प्रभावों की निगरानी के लिए रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी और मास स्पेक्ट्रोमेट्री सिस्टम की क्षमता का प्रदर्शन किया जाता है। रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी ने संभावित बायोमार्कर की पहचान की अनुमति दी जो दवा जोखिम के लिए एकल कोशिकाओं की एक सामान्य प्रतिक्रिया को प्रतिबिंबित करता है। एकल कोशिकाओं के बीच कुछ विषमता देखी गई, जिससे यह सुझाव दिया गया कि कुछ कोशिकाओं ने दवा जोखिम का जवाब नहीं दिया। दूसरी ओर, एलएससी-एमएस एकल-कोशिका स्तर पर दवा और उसके मेटाबोलाइट का लक्षित विश्लेषण करने में सक्षम था, जिसमें दवा और इसकी मेटाबोलाइट बहुतायत में उच्च स्तर की विषमता देखी गई थी। यह विषमता यह समझाने में मदद करती है कि कुछ कोशिकाएं दवा से प्रभावित क्यों होती हैं जबकि अन्य प्रतीत नहीं होते हैं, बावजूद इसके कोशिकाएं माना जाता है कि समान आबादी12से उत्पन्न होती हैं।
इस तकनीक के विशेष पहलुओं में, जिस पर ध्यान देने की आवश्यकता होती है, डेटा की प्रजनन क्षमता सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप सेट-अप और सिग्नल प्रसंस्करण की गुणवत्ता का मूल्यांकन करना महत्वपूर्ण है। यदि स्पेक्ट्रा की पूर्वप्रसंस्करण सावधानी से की जाती है, तो सिग्नल विविधताओं को प्रत्येक चोटी के स्थानीय अधिकतम पर अधिकतम किया जाना चाहिए। इसके विपरीत, स्पेक्ट्रा के बेसलाइन और किनारे को परीक्षण कोशिका स्थितियों के बीच ओवरलैप करना चाहिए। एक अन्य महत्वपूर्ण पहलू उपचार के बीच मतभेदों की जांच करने के लिए उपयोग किया जाने वाला मल्टीवेरिएट मॉडल है। एक सटीक और सटीक विश्लेषण सुनिश्चित करने के लिए मॉडल और मॉडल मापदंडों का सावधानीपूर्वक मूल्यांकन करना चाहिए। तंत्रिका नेटवर्क के विपरीत पीएलएस मॉडल का एक लाभ यह है कि यह प्रत्येक तरंगदैर्ध्य (रमन पाली) से जुड़े वजन तक पहुंच की अनुमति देता है जो मॉडल द्वारा परीक्षण की गई स्थितियों को सबसे अच्छा अलग करता है।
रमन स्पेक्ट्रोस्कोपी के बावजूद सफलतापूर्वक दवा प्रतिक्रिया भेदभाव, यह जोर दिया जाना चाहिए कि इस तकनीक के उपयोग में सीमित है जैविक व्याख्या प्रदान करते हैं । यह मुख्य रूप से स्पेक्ट्रल सिग्नल की जटिलता के कारण होता है, जिसमें हजारों अणुओं का मिश्रण शामिल है। इसलिए, रमन स्पेक्ट्रल तीव्रता और दवा सांद्रता में भिन्नता के बीच व्यवस्थित विविधताओं का मूल्यांकन करने के लिए आगे की जांच की आवश्यकता है । इसके अलावा, टैमोक्सिफेन से जुड़े स्पेक्ट्रल बायोमार्कर के सामान्यीकरण का मूल्यांकन करने के लिए अन्य सेल लाइनों के समान अध्ययन की आवश्यकता होती है।
इसके अलावा, फार्माकोडायनामिक्स का आकलन करने और प्रत्येक कोशिका के भीतर दवाओं के प्रवेश और प्रवाह का अध्ययन करने के लिए जीवित ऊतकों मापन करना रुचि का हो सकता है। इसके अलावा, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एलएससी-एमएस में नमूना कदम ऑपरेटर के कौशल पर अत्यधिक निर्भर है। स्थानिक संकल्प, नमूना के बाद केशिका के अंदर सेल की स्थिति जैसे पैरामीटर, और थ्रूपुट ताकत पूरी तरह से ऑपरेटर निर्भर हैं, जो एलएससी-एमएस को बड़े पैमाने पर अपनाने की सीमा तय करते हैं। हालांकि, स्वचालित नमूना प्रणाली इस मुद्दे को कम कर सकते हैं । इसके अलावा, जबकि एलएससी-एमएस अपने मूल राज्यों में अनुयायी या फ्लोटिंग कोशिकाओं के नमूने में उत्कृष्टता प्राप्त करता है, यह ऊतक वर्गों में एम्बेडेड नमूने कोशिकाओं में अधिक खराब प्रदर्शन करता है। यह नमूना केशिका टिप की प्रवृत्ति को तोड़ने के लिए अगर नमूना घनत्व अधिक है के कारण है । इसलिए, एकल जांच जैसे एक और दृष्टिकोण14,15ऐसे मामलों में अधिक उपयुक्त हो सकता है।
चूंकि यहां उपयोग की जाने वाली कोशिकाओं का नमूना न्यूनतम नमूना तैयारी के साथ परिवेश की स्थितियों में लिया जाता है, इसलिए एलएससी-एमएस को आसानी से अन्य प्रौद्योगिकियों के साथ एकीकृत किया जा सकता है, जैसा कि इस प्रोटोकॉल में रमन के साथ इसके एकीकरण द्वारा दिखाया गया है। 3 डी होलोग्राफी के साथ इसी तरह के एक और एकीकरण ने उपकोशिकीय स्तर16पर सेलुलर मेटाबोलाइट्स की पूर्ण मात्रा प्राप्त करने की अनुमति दी है । इसके अतिरिक्त, प्रवाह साइटोमेट्री के साथ एकीकरण न्यूरोब्लास्टोमा कैंसर रोगियों17,18के एकल परिसंचारी ट्यूमर कोशिकाओं में मेटाबोलिक बायोमार्कर को अनकवर करने के लिए अनुमति दी गई है।
भविष्य में, इमेजिंग तौर-तरीकोंसेडेटासेट के संयोजन में हाल ही में बढ़ती रुचि के कारण, एकीकृत कम्प्यूटेशनल दृष्टिकोणों का उपयोग करके रमन संकेतों और बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री परिणामों (साथ ही अन्य ओमिक्स विधियों) के बीच व्यवस्थित विविधताओं का अध्ययन करना भी रुचि हो सकती है। दिलचस्प बात यह है कि हम पहले से ही वीआईपी स्कोर द्वारा पहचाने गए रमन चोटियों की तीव्रता और एमएस4द्वारा पहचाने गए एकल सेल स्तर पर टैमोक्सिफेन या इसके मेटाबोलाइट की बहुतायत के बीच कई कमजोर लेकिन महत्वपूर्ण रैखिक सहसंबंध पाए हैं। यह डेटा एमएस प्रोफाइल और रमन स्पेक्ट्रा के बीच मेटाबोलिक संबंध और इन मूल्यों की भविष्यवाणी करने की संभावना का सुझाव दे सकता है।
The authors have nothing to disclose.
लेखक ों ने डॉ अर्नो गेरमंड को जिम्मेदार ठहराते हुए उनके समर्थन और RIKEN आंतरिक सहयोगी फंडों के लिए तोशिओ यानागिडा को धन्यवाद दिया ।
0.1% penicillin-streptomycin | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
35mm glass bottom grid dish | Matsunami | ||
4-Hydroxy Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 94873 | |
532 nm diode pumped solid-state laser | Ventus, Laser Quantum | ||
BIOS-L101T-S motorized microscope stage | OptoSigma | ||
CT-2 cellomics coated sampling capillaries | HUMANIX | ||
d5-Tamoxifen standard | Cambridge Isotope Laboratories | ||
Dimethyl sulfoxide LC-MS grade | Nacalai Tesque | D8418 | |
Dulbecco's Modified Eagle's medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Eppendorf GELoader tips | Eppendorf | ||
fetal bovine serum | Hyclone laboratories | SH3006603 | |
FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | ||
Formic acid LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 33015 | |
HepG2 cell line (RCB1886) | RIKEN cell bank center | RCB1886 | |
MC0-19A1C Incubator | Sanyo Electric Co. | MC0-19A1C | |
Methanol LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 1060352500 | |
MMO-203 3-D Micromanipulator | Narshige | MMO-203 | |
NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens | Olympus | ||
Nanoflex nano-ESI adaptor | Thermo Fisher Scientific | ES071 | |
On-stage incubator | ibidi | ||
Pierce LTQ Velos ESI calibration solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | |
PIXIS BR400 cooled CCD camera | Princeton Instruments | ||
Q-Exactive Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | ||
Rat-tail collagen coating solution | Cell Applications Inc. | ||
Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 85256 |