Denne protokol præsenterer en integreret Raman spektroskopi-Mass massespektrometri (MS) platform, der er i stand til at opnå en enkelt celle opløsning. Raman spektroskopi kan bruges til at studere cellulære respons på lægemidler, mens MS kan bruges til målrettet og kvantitativ analyse af stof optagelse og metabolisme.
Celler er kendt for at være iboende heterogene i deres reaktioner på narkotika. Det er derfor vigtigt, at der tages højde for heterogenitet af enkeltceller i undersøgelser af lægemiddel opdagelse. Dette kan opnås ved nøjagtigt at måle over floden af cellulære interaktioner mellem en celle og et lægemiddel på enkelt celleniveau (dvs. stof optagelse, metabolisme og effekt). Dette papir beskriver en enkelt-celle Raman spektroskopi og massespektrometri (MS) platform til at overvåge metaboliske ændringer af celler som reaktion på narkotika. Ved hjælp af denne platform, metaboliske ændringer som reaktion på stoffet kan måles ved Raman spektroskopi, mens stoffet og dets metabolit kan kvantificeres ved hjælp af massespektrometri i samme celle. Resultaterne tyder på, at det er muligt at få adgang til oplysninger om stof optagelse, metabolisme og respons på et enkelt celleniveau.
Cellerne reagerer forskelligt på ændringer i deres mikromiljø på enkelt celleniveau, et fænomen kaldet cellulær heterogenitet1. På trods af dette, nuværende Drug Discovery undersøgelser er baseret på gennemsnitlige målinger af cellepopulationer, som sløre oplysninger om potentielle delpopulationer samt enkelt-celle variationer2. Disse manglende oplysninger kan forklare, hvorfor nogle celler er mere modtagelige for stoffer, mens andre er resistente. Interessant, manglen på enkelt celleoplysninger om narkotika respons er en mulig årsag til svigt i fase II kliniske forsøg med narkotika3. For at løse dette problem skal cellulære interaktioner med lægemidlet (dvs. optagelse, metabolisme og respons) derfor måles på enkelt celleniveau.
For at opnå dette har vi designet et unikt system, hvor levende enkeltceller screenes ved hjælp af Label-fri Raman spektroskopi og derefter yderligere karakteriseret ved hjælp af massespektrometri4. Raman spectroskopi giver et Molekylær fingeraftryk af den cellulære tilstand, et komplekst spektrum som følge af bidragene fra mange molekyler inde i cellen. På trods af denne kompleksitet, kan det betragtes som Raman fingeraftryk afspejler en hel cellestruktur og metabolisme5,6. Raman spectroskopi udmærker sig ved at måle cellulære stater i en ikke-invasiv og relativt høj gennemløb måde, hvilket gør det nyttigt for screening og vurdering af narkotika respons på enkelt celleniveau.
I modsætning hertil giver MS den krævede følsomhed og selektivitet for måling af stof optagelsen på enkelt celleniveau. Da MS er destruktiv (prøven [celle] er typisk forbruges under analyse), integrere det med ikke-destruktiv, etiket-fri Raman spektroskopi kan give en høj gennemløb og følsomt system. Denne kombinerede platform er i stand til at give mere information om stof optagelse, metabolisme, og effekter på enkelt celleniveau.
Dette manuskript belyse en protokol, der anvendes til at studere cellulære interaktioner med lægemidler på enkelt celleniveau ved hjælp af in vitro-kulturer ved hjælp af en integreret Raman-MS-platform. For at gøre det, hepatocellulære karcinom celler (HepG2) og Tamoxifen anvendes som en model. HepG2 celler blev valgt, fordi de tager op Tamoxifen og metabolisere stoffet, og de er samtidig påvirket på grund af dets hepatotoksiske virkninger. To stater anvendes i dette manuskript: stof behandlede celler vs. ikke-behandlede celler (kontrol).
I dette manuskript blev der valgt et enkelt tilfælde, hvor HepG2 celler blev eksponeret (eller ikke) for Tamoxifen. Evnen af en Raman spektroskopi og massespektrometri system er påvist at overvåge virkningerne af Tamoxifen på celler. Raman spectroskopi tillod identifikation af potentielle biomarkører, der afspejlede en generel respons af enkeltceller til lægemiddeleksponering. Der blev observeret en vis heterogenitet mellem enkeltceller, hvilket tyder på, at nogle celler ikke reagerede på lægemiddel eksponeringen. På den anden side var LSC-MS i stand til at foretage en målrettet analyse af stoffet og dets metabolit på enkelt celleniveau, hvor der blev observeret en høj grad af heterogenitet i lægemidlet og dets metabolits overflod. Denne heterogenitet hjælper med at forklare, hvorfor nogle celler påvirkes af stoffet, mens andre tilsyneladende ikke, på trods af cellerne stammer fra en angiveligt ensartet befolkning12.
Blandt særlige aspekter af denne teknik, der kræver opmærksomhed, er det vigtigt at evaluere kvaliteten af mikroskop opsætning og signalbehandling for at sikre reproducerbarhed af dataene. Hvis forbehandling af spektrene udføres omhyggeligt, skal signal variationerne maksimeres ved det lokale maksimum for hver spids. Derimod bør spektrens grundlinje og kant overlappe hinanden mellem de testede celle betingelser. Et andet vigtigt aspekt er den multivariat model, der anvendes til at undersøge forskelle mellem behandlinger. Man skal omhyggeligt evaluere modellerne og model parametrene for at sikre en præcis og præcis analyse. En fordel ved PLS-modellen, i modsætning til neurale netværk, er, at det giver adgang til de vægte, der er forbundet med hver bølgelængde (Raman Skift), som bedst adskiller de betingelser testet af modellen.
Trods Raman spektroskopi med held diskriminere narkotika respons, det skal understreges, at denne teknik er begrænset i dens anvendelse til at give biologisk fortolkning. Dette skyldes primært kompleksiteten af spektral signalet, som omfatter en blanding af tusindvis af molekyler. Der er derfor behov for yderligere undersøgelser for at evaluere systematiske variationer mellem Raman-spektral intensiteter og variationer i lægemiddel koncentrationerne. Også, lignende undersøgelser af andre cellelinjer er forpligtet til at evaluere generalisering af spektral biomarkører forbundet med Tamoxifen.
Desuden kan det være af interesse at udføre levende væv målinger til at vurdere farmakodynamik og studere, hvordan narkotika trænge ind og flyde inden for hver celle. Det skal desuden bemærkes, at prøvetagnings trinnet i LSC-MS i høj grad afhænger af operatørens dygtighed. Parametre som rumlig opløsning, celle position inde i kapillar efter prøvetagning og overførsels styrke er udelukkende operatør afhængige, hvilket begrænser storstilet vedtagelse af LSC-MS. Selv om automatiserede prøvetagningssystemer kan afhjælpe dette problem. Mens LSC-MS udmærker sig ved prøvetagning af overtrædende eller flydende celler i deres oprindelige stater, klarer det sig mere dårligt i prøvetagnings celler indlejret i vævs sektioner. Dette skyldes, at prøveudtagnings kapillar spidsen er tilbøjelig til at knække, hvis prøve tætheden er høj. Derfor kan en anden fremgangsmåde som single-Probe være mere egnet i sådanne tilfælde14,15.
Da de celler, der anvendes her, udtages under omgivende forhold med minimal Prøvetilberedning, kan LSC-MS let integreres med andre teknologier, som det fremgår af integrationen med Raman i denne protokol. En anden lignende integration med 3D-holografi har gjort det muligt at opnå absolut kvantitation af cellulære metabolitter på det subcellulære niveau16. Desuden har integration med flow cytometri tilladt for afdækningen af metaboliske biomarkører i enkelt cirkulerende tumorceller af neuroblastom cancerpatienter17,18.
I fremtiden, på grund af den seneste stigende interesse i at kombinere datasæt fra Imaging metoder19, kan det også være af interesse at studere de systematiske variationer mellem Raman signaler og massespektrometri resultater (såvel som andre omic’er) ved hjælp af Integrative beregningsmæssige tilgange. Interessant, vi har allerede fundet flere svage, men signifikant lineær korrelationer mellem intensiteten af Raman toppe identificeret ved VIP scores og overflod af Tamoxifen eller dets metabolit på enkelt celleniveau som identificeret ved MS4. Disse data kan foreslå en metabolisk sammenhæng mellem MS-profiler og Raman Spectra og muligheden for at forudsige disse værdier.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Toshio Yanagida for hans støtte og RIKEN interne samarbejds fonde tilskrives Dr. Arno Germond.
0.1% penicillin-streptomycin | Nacalai Tesque | 09367-34 | |
35mm glass bottom grid dish | Matsunami | ||
4-Hydroxy Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 94873 | |
532 nm diode pumped solid-state laser | Ventus, Laser Quantum | ||
BIOS-L101T-S motorized microscope stage | OptoSigma | ||
CT-2 cellomics coated sampling capillaries | HUMANIX | ||
d5-Tamoxifen standard | Cambridge Isotope Laboratories | ||
Dimethyl sulfoxide LC-MS grade | Nacalai Tesque | D8418 | |
Dulbecco's Modified Eagle's medium | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Eppendorf GELoader tips | Eppendorf | ||
fetal bovine serum | Hyclone laboratories | SH3006603 | |
FluoroBrite DMEM | Thermo Fisher Scientific | ||
Formic acid LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 33015 | |
HepG2 cell line (RCB1886) | RIKEN cell bank center | RCB1886 | |
MC0-19A1C Incubator | Sanyo Electric Co. | MC0-19A1C | |
Methanol LC-MS grade | Sigma-Aldrich | 1060352500 | |
MMO-203 3-D Micromanipulator | Narshige | MMO-203 | |
NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens | Olympus | ||
Nanoflex nano-ESI adaptor | Thermo Fisher Scientific | ES071 | |
On-stage incubator | ibidi | ||
Pierce LTQ Velos ESI calibration solution | Thermo Fisher Scientific | 88323 | |
PIXIS BR400 cooled CCD camera | Princeton Instruments | ||
Q-Exactive Orbitrap | Thermo Fisher Scientific | ||
Rat-tail collagen coating solution | Cell Applications Inc. | ||
Tamoxifen standard | Sigma-Aldrich | 85256 |