Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biochemistry

ספקטרוסקופיית ראמאן משולבת ופלטפורמת ספקטרומטר המסה ללימוד תא יחיד קליטת סמים, מטבוליזם, ואפקטים

doi: 10.3791/60449 Published: January 9, 2020

Summary

פרוטוקול זה מציג את פלטפורמת משולבת ראמאן ספקטרוסקופית (MS) של המסה המסוגלת להשיג רזולוציה של תא בודד. ספקטרוסקופית ראמאן ניתן להשתמש כדי ללמוד תגובה תאית לסמים, בעוד MS יכול לשמש ניתוח ממוקד וכמותי של ספיגת התרופה ואת חילוף החומרים.

Abstract

תאים ידועים להיות הטרוגנית מיסודו בתגובותיהם לסמים. לכן, חיוני כי תא בודד טרוגניות במחקרים גילוי סמים. זה יכול להיות מושגת על ידי מדידת מדויק של שפע של אינטראקציות סלולריות בין תא לבין תרופה ברמה תא יחיד (כלומר, ספיגת הסמים, חילוף החומרים, והתוצאה). המאמר מתאר את הפלטפורמה היחידה לניטור מטבולית של תאים בעלי תא יחיד ולנטר שינויים מטבוליים בתגובה לתרופות. באמצעות פלטפורמה זו, שינויים מטבולית בתגובה לתרופה ניתן למדוד על ידי ספקטרוסקופיית ראמאן, בעוד התרופה ואת המטבולית שלה ניתן לכמת באמצעות ספקטרומטר מסה באותו תא. התוצאות מרמזות על כך שניתן לגשת למידע אודות ספיגת הסמים, חילוף החומרים והתגובה ברמה של תא בודד.

Introduction

תאים מגיבים באופן שונה לשינויים בסביבת המיקרו-שלהם ברמת התא הבודד, תופעה הנקראת טרוגניות סלולר1. למרות זאת, המחקרים הנוכחיים של גילוי הסמים מבוססים על מדידות ממוצעות של אוכלוסיות תאים, אשר מערפל מידע על אוכלוסיות משנה פוטנציאליות, וכן וריאציות של תא בודד2. מידע חסר זה עשוי להסביר מדוע תאים מסוימים רגישים יותר לסמים בעוד אחרים עמידים. מעניין, היעדר מידע תא יחיד על תגובת התרופה היא סיבה אפשרית לכישלון הניסויים הקליניים שלב II של תרופות3. לכן, כדי לטפל בבעיה זו, יש למדוד את האינטראקציות הסלולריות עם הסם (כלומר, ספיגת, חילוף החומרים והתגובה) ברמת התא היחיד.

כדי להשיג זאת, עיצבנו מערכת ייחודית שבה החיים תאים בודדים מוקרנים באמצעות התווית ספקטרוסקופית ראמאן לאחר מכן מאופיין עוד יותר באמצעות ספקטרומטר מסה4. ספקטרוסקופיית ראמאן מספק טביעת אצבע מולקולרית של המדינה התאית, ספקטרום מורכב הנובע מהתרומות של מולקולות רבות בתוך התא. למרות מורכבות זו, זה יכול להיחשב כי טביעות אצבע ראמאן משקפים מבנה של תא שלם חילוף חומרים5,6. הספקטרוסקופית ראמאן מצטיינת במדידת מצבים סלולאריים בצורה של תפוקה לא פולשנית וגבוהה יחסית, מה שהופך אותו לשימושי להקרנה ולהערכת תגובת הסמים ברמת התא היחיד.

לעומת זאת, MS מספק את הרגישות הנדרשת ואת הסלקטיביות למדידת ספיגת התרופה ברמה תא יחיד. מאז MS היא הרסנית (המדגם [תא] הוא נצרך בדרך כלל במהלך הניתוח), שילוב זה עם גמישה, תווית הספקטרוסקופית ראמאן יכול לספק תפוקה גבוהה ומערכת רגישה. פלטפורמה זו משולבת מסוגל לספק מידע נוסף על ספיגת הסמים, חילוף החומרים, ואפקטים ברמה תא יחיד.

כתב יד זה מהבהיר פרוטוקול המשמש לחקר אינטראקציות סלולריות עם סמים ברמה של תא יחיד באמצעות תרביות מבחנה באמצעות פלטפורמת ראמאן-MS משולבת. לשם כך, תאי קרצינומה של hepatocellular (HepG2) ו טמוקסיפן משמשים כמודל. תאים HepG2 נבחרו משום שהם לוקחים את טמוקסיפן מטבוליזם התרופה, והם מושפעים בו בשל ההשפעות hepatotoxic שלה. שתי מדינות משמשות בכתב יד זה: תאים שטופלו בסמים לעומת תאים שאינם מטופלים (בקרה).

Protocol

1. תרבית תאים

  1. התרבות בתחומי העניין במדיית תרבות מתאימה. פניצילין-סטרפטומיצין ניתן להוסיף כדי למנוע זיהום. במקרה של תאים HepG2, התרבות תאים בתקשורת התרבות המכילה בינונית שונה של מדיום של הנשר (DMEM) שיושלם עם 10% סרום בפרה עוברית (FBS) ו 0.1% פניצילין-סטרפטומיצין. כדי faciltate מדידות מדידה ראמאן, תאים ניתן לגדל על 0.1% מצופה ג'לטין זכוכית בתחתית הצלחת או שקופיות קוורץ.
  2. התאים הדגירה עבור 2 ימים ב 37 ° צ' ו 5% CO2 בחממה לחות.
  3. סנכרון תרביות תאים כדי להגיע ל70% שליטה.
  4. התאים תת-תרבות לתוך הצלחת 35 mm זכוכית התחתית או שקופיות קוורץ באמצעות בינוני זהה בצפיפות הזריעה של 0.7 x 106, ולאחר מכן הדגירה ב 37 ° צ' עבור 24 h.
    הערה: מנות תרבות או שקופיות יכול להיות מצופה מראש עם קולגן או ציפוי הג פתרון עם יחס פני השטח של התרבות של 5 ו/cm2 כדי לאפשר להם לתקן, הבטחת ההישרדות שלהם במהלך המדידה.

2. טיפול בסמים

  1. הסר את תרביות התאים מהאינקובטור ושטוף את 2x עם מאגר PBS מחומם (37 ° c).
    הערה: מיטבי להסיר תאים לטיפול בסמים בשטף של 50%-60%.
  2. חלוקת תאים לקבוצות מטופלות שטופלו בסמים ולא מטופלות במנות תרבות 35 מ"מ.
  3. מערבבים את סם הבחירה עם מדיית התרבות. לדוגמה, התמוססות טממוקסיפן ב-diמתיל סולפוקסיד (DMSO) וערבבו עם מדיית התרבות כדי להשיג נפח סופי של 2 מ ל וריכוז טמוקסיפן של 10 μM. . זו תהיה הקבוצה המטופלת בסמים
  4. לערבב נפח המתאים של ממס (DMSO) לתוך המדיום כפקד ללמוד את ההשפעות של DMSO. . זו תהיה קבוצת הביקורת
  5. מודטה שתי הקבוצות ב 2 מ ל של מדיה מחודדים שהוכנו בשלבים 2.3-2.4 עבור 24 שעות. השטף הצפוי לאחר הדגירה צריך להיות 70%-80%.

3. הדמיה ספקטרלית ועיבוד ספקטרלי

הערה: למרות שמערכות ספקטרוסקופיית ראמאן מסחריות זמינות, מערכת הספקטרוסקופיית המשמשת בבית היא מיקרוסקופ ביתי לסריקת קו שתוארה קודם לכן7,8. בקצרה, מערכת זו מצוידת 532 ננומטר לייזר דיודה מוצק שאוב המדינה. אור לייזר מעוצב לתוך מטוס באמצעות עדשת גליל, אשר מאפשר מדידה של 400 ספקטרום בחשיפה אחת. ספקטרום ראמאן נרשמו באמצעות מצלמה מקורר CCD רכוב על polychromator המשתמשת 1,200 חריצים/מ"מ פומפיה כדי למקסם את הרזולוציה הספקטרלית של אזור טביעת האצבע (מ 500-1800 ס מ-1). אזור ספקטרלי זה מכיל צפיפות גבוהה של תדרים ספציפיים מולקולות המייצר פיזור ראמאן. ניתן להשתמש בעדשת המים האובייקטיבית (NA = 0.95). הרזולוציה המרחבית של מערכת זו היא ~ 300 ננומטר והרזולוציה הספקטרלית היא1 ס מ -1. כדי להבטיח הישרדות תא במהלך הניסוי, מיקרותא קבוע על הבמה מיקרוסקופ ממונע משמש.

  1. , לפני המדידות הספקטרליות. בדוק את היישור של האופטיקה חריר 50 יקרומטר ניתן להשתמש כדי לוודא כי חריר ומיקום לייזר להתאים בדיוק. הזן את הספקטרוסקופיה כאשר לצמצמה ככל האפשר.
  2. השתמש אתנול לכייל את הספקטרוסקופיה לפני כל ניסוי. כדי לעשות זאת, מקום אטוח בצלחת זכוכית תחתית, למדוד את הספקטרום בעוצמת לייזר נתון (נמדד במדגם) עבור 1 s, ולשייך את השיא לאורכי גל ידוע7.
  3. מזער את עוצמת הלייזר במדגם כדי ~ 2.4 mW/μm2 כך תאים לשרוד חשיפה לייזר.
  4. הגדר את המיקרוחדר ב 5% CO2 ו 37 ° c.
  5. לאחר מערכת המיקרוסקופ הוא מוכן, להסיר תאים מתוך החממה ולשטוף מיד את התאים 2x עם מאגר PBS (37 ° c), ולאחר מכן להוסיף 2 מ ל של PBS מחומם (37 ° c) או DMEM כדי להשעות מחדש את התאים.
    הערות: שניהם PBS ו-FluoroBrite מדיה מבוססי המדיה הם מספיק אפשרויות עבור מדידות ספקטרוסקופית ראמאן כי הם מייצרים אות רקע מינימלי.
  6. הוסף 10 μL של מים על העדשה היעד טבילה במים ולמקם בעדינות את הצלחת הזכוכית התחתונה התא על הבמה המיקרוסקופ.
  7. למדוד כל תא על ידי התמקדות קו הלייזר. זמן חשיפה של 15 s לכל תא מספיק כדי לקבל חתך של תא עם אות ראמאן ברור. מראה גאלבנו מאפשר סריקה של תא אחד או קבוצה של תאים בתוך כמה עשרות דקות.
    הערות: ברזולוציה גבוהה יותר של הדמיה ספקטרלית מלאה של תאים דורש זמן רב יותר והוא עלול לגרום לנזק פוטותאי. כאן, התאים נמדדו באמצעות חשיפה של שורה אחת כדי לקבל חתך רוחב של כל תא. גישה זו היא החלפה טובה להגדלת התפוקה והשגת מידע מספיק לתאים מפלים, תוך הקפדה גם על הכדאיות של התאים על-ידי הגבלת הנזק לתמונות.

4. עיבוד מקדים של נתונים ספקטרליות וניתוחים רב-משתנים

הערה: עיבוד מקדים הוא צעד הכרחי לפני ניתוח נוסף כדי להסיר וריאציות טכניות לא רצויות בתוך הנתונים הספקטרליות. בשל גיוון של שיטות ותוכנה, לא ניתן לספק רשימה ממצה, ויש ביקורות רבות שימושיות שנמצאו בספרות7,8. בסעיף זה, אנו מתארים בקצרה את הגישה המשמשת לניתוח ולפרש מידע ראמאן ספקטרלי שהתקבלו מתאים בודדים חיים.

  1. לחלץ ולקדם מראש תמונות ראמאן כדי להסיר הפרעות הקרן הקוסמית אפשרי.
    הערה: ציר ספקטרלי של ספקטרום שהושג במהלך ימים שונים/שבועות/חודשים עשויים לכלול כמה וריאציות בשל וריאציות טכניות קטנות במהלך כיול באמצעות אתנול. פעולה זו תשפיע מאוד על ניתוחים מרובי משתנים והשוואות סטטיסטיות. במקרה שניסויים מתבצעים במהלך שבועות/חודשים שונים, צפויות וריאציות אופטיות קטנות. במקרה זה, הנתונים יש לבצע אינטרפולציה כדי לתקן בסופו של דבר שינויים ספקטרלי של הנתונים על פני ניסויים. אינטרפולציה באמצעות ליטת חיבור מעוקב משמש כאן. לאחר שלב זה, יש ליישר את כל צירי הספקטרום. מגוון של 500-1800 ס"מ-1 נחשב לניתוח שלאחר מכן.
  2. חילוץ נתונים ספקטרלי של תאים ורקע (העדר תאים) מכל תמונה באמצעות אלגוריתם תוצרת בית. הפחת את אות הרקע מהאות של התא. לאחר מכן, ממוצע הספקטרום של הפיקסלים הנותרים, שאמור להתאים לתא בודד. השלבים הבאים מתבצעים באמצעות ספקטרום דו-ממדי של תאים.
  3. בצע תיקון בסיסי באמצעות ModPoly9 או כל אלגוריתם אחר שנאמד בהתאמה מספקת. חתוך את טווח ספקטרלי 600-1700 ס"מ-1 כדי לבחור את אזור טביעת האצבע ולהבטיח כי אין תופעות הקצה לא רצויות על הספקטרום עקב התאמה פולינומיאלית רע.
  4. בצע שלב נורמליזציה כגון נורמליזציה וקטורית (עוצמה בכל מספר גל מחולק על-ידי הנורמה l2 הגלובלית או ערך מרבי של ספקטרום) כדי לנרמל את העוצמה הספקטרלית10, למרות שניתן לשקול התאמות אחרות.
  5. הכן ערכת נתונים עם התווית המתאימה עבור כל מחלקה/תנאי.
    הערה: ניתוח ספקטרלי השוואתי יכול להיות מנקב כדי לחקור את האופי של הבדלים אפשריים בין מחלקת התאים/התנאים (למשל, על ידי הפחתת הספקטרום הממוצע של קבוצת הבקרה לקבוצות אחרות כדי לזהות אזורי עניין [כגון סמנים פוטנציאליים]). בנוסף, ניתן לבצע חישובים של מבחנים של ANOVA ופישר ב-10.
  6. כדי לזהות תאים מטופלים ולא מטופלים המבוססים על תכונות ספקטרליות, ניתן להחיל ניתוחים רב-משתנים. יש להשתמש בנתונים ספקטרלי מנורמאליים כערכת נתונים של הדרכה, וערכת נתונים לא ידועה (ללא תווית) מניסוי שכפול צריכה לשמש כנתוני בדיקה, במידת האפשר.
    הערה: אנליזה דיסקרימינטית שבוצעה על וקטור כלשהו של ניתוח רכיב עיקרי (PCA-DA10), הקרנה על ציונים סמויים ואחריו ניתוח מבדיל (PLS-da), תמיכה מכונות וקטורים (svm)11 הם דגמים המשמשים לעתים קרובות בתחום, וכל אחד מציג שיקולים סטטיסטיים שונים. יש לבצע עיבוד מקדים של נתונים כתוצאה מכך.
  7. השתמש בלמידה ממוחשבת המתאימה למטרות הנסיוניות. כאן, הקרנה על מבנה חבוי (PLS) מודל בנויה באמצעות אזור טביעת אצבע ספקטרלית של ראמאן ספקטרום (600-1710 ס"מ-1)11,12. ממוצע-המרכז את הנתונים בהתאם לצורך. עבור אימות צולב של המודל, ניתן להחיל טכניקות שונות.
    הערה: הנה, מוחל אימות צלב ונציאני עיוור עם 10 פיצולים. יש לבדוק את מורכבות המודל (מספר הרכיבים או המשתנה הנסתר) כך שהמודל הטוב ביותר ממזער את ערך השגיאה הריבועי הממוצע (RMSE). נמצא כי שלושה וקטורים סמויים (LVs) סיפק את האפליה הטובה ביותר עם ערכת הנתונים שלנו.
  8. לזהות אילו פסגות ספקטרליות לתרום לאפליה של התאים (למשל, על ידי התוויית ניקוד של חשיבות משתנה בהקרנה [VIP] עבור כל מספר גל ראמאן או את הגודל של מקדם הרגרסיה).
    הערות: תוצאת ה-VIP של משתנה מחושבת כסכום משוקלל של היחסים בריבוע בין רכיבי PLS-DA והמשתנה המקורי. פרטים לגבי PLS ואלגוריתם VIP ציונים ניתן למצוא את הספרות11,12.

5. הגדרת דגימה של תא יחיד ופרוצדורות

  1. לתקן את מערכת דגימת התא על מיקרוסקופ ראמאן כפי שמוצג באיור 1. חברו את המיקרומניפולציה התלת-ממדית למחזיק הנימי זכוכית המצורף למזרק ריק לדגימת מציצה על-ידי החלת לחץ שלילי (איור 1).
  2. הגדר את המיקרוסקופ לשדה הגדלה גבוהה (40x) כדי להתבונן בקצה נימי הזכוכית וודא שהוא אינו שבור. שלוט במיקום של נימי הזכוכית באמצעות המיקרומניפולציה (x-, y-ציר z). ודא שעצת הקפילר ממורכזת בשדה התצוגה, ולאחר מכן הזז את הקפילר על ציר z כדי לתת סיווג לתבשיל התרבות מאוחר יותר.
    הערה: מיקרודגימה של התאים מבוצעת על ידי נימי זכוכית עבור תאים עם קטרים בין 10-15 μm. קפילר עם גודל משעמם של ~ 5 יקרומטר מומלץ. אם הגודל נשא קטן מדי, העצה נימי יהיה מחובר על ידי התא, ואם הוא גדול מדי, את הרגישות של מדידות MS מאוחר יותר עלולים להיות בסכנה.
  3. מניחים את צלחת המדגם/צלחת על הבמה של המיקרוסקופ, להתאים את ההגדלה ולהתמקד, לבחור את תא היעד על מנת הרשת, ולהעביר אותו למרכז התצוגה. לאחר מכן, הורידו בזהירות את נימי הזכוכית באמצעות המיקרומניפולציה (ציר z) עד שהקצה מגיע לפוקוס.
    הערה: הקפד לא להזיז את הקפילר בצירי ה-x ו-y עד שהנימי יהיה בפוקוס.
  4. תחת התבוננות מיקרוסקופית, לגעת תא בודד היעד עם טיפ נימי, ואז להתחיל להחיל לחץ שלילי באמצעות המזרק כדי ללכוד את התא בתוך הקצה נימי. הקלט הליך זה על-ידי לקיחת תמונה או וידאו כדי לבדוק את העיתוי ולמצוץ את המיקום של התא בדיוק, במידת הצורך.
  5. הזיזו את הנימים למעלה על ציר z. אז, לנתק את הקפילר מבעל נימי באמצעות מלקחיים לקראת ניתוח MS.

6. מדידות ספקטרומטר מסה

  1. כיול הדיוק ההמוני של כלי MS בהתאם להמלצות היצרן. לאחר הכיול, ודא ששגיאת המסה אינה גדולה מ-3 דפים לדקה.
  2. מטב את כלי MS לפרמטרים המתאימים ביותר עבור מכשיר הריבית.
    הערה: במקרה של טמוקסיפן וניתוח 4-OHT, הפרמטרים של המכשיר מוגדרים להלן: הטמפרטורה קפיצית: 400 ° c, תרסיס מתח: 1500 V, היעד בקרת רווח אוטומטי (AGC): 5.00 E + 06, S-עדשה RF ברמת: 90%, ה-SIM טווח: 347-397 m/z, הזמן ה200 ms, החלטה SIM: 140,000 FWHM, MS/MS טווח: 50-400 m/z, MS/MS היעד AGC: 2.00 E + 05, MS/MS זמן ההזרקה מקסימום: 100 ms, MS/MS החלטה: 17,500 FWHM, ms/ms בידוד חלון: 1 m/z, MS/טרשת נפוצה התנגשות (בשעה)
  3. הגדרת שיטת רכישה אוטומטית עם משך של 5 דקות למצב ה-SIM כדי להשיג כימות יחסית, ושיטת MS/MS אחרת לזיהוי חיובי של התרופה ואת המטטבוליט שלה. יש להגדיר את הפרמטרים של שיטת הרכישה לערכים המוטבים שהוזכרו בשלב 6.2.
  4. הכינו את הממיסים. מתחת למכסה המנוע הרכב הממס תלוי באנליטה של הריבית. כאן, הממס אורגני בשימוש מורכב 80% meoh, 10% dmso, ו 0.1% החומצה פורמית.
  5. מערבבים תקן פנימי מתאים עם הממס האורגני לפני המדידות. בניסוי זה, 5.31 nM של d5-טמוקסיפן משמש כסטנדרט פנימי.
  6. כדי להימנע מתוצאות חיוביות מוטעות, מחלקים את המדיה המקיפה את התאים שטופלו בתרופה באמצעות קפילר בגודל 1 יקרומטר עם התבוננות מיקרוסקופית מתמדת כדי להימנע מדגימת חלקים סלולריים.
  7. הוסף 2 μl של הממס יינון לקצה רחב של נימי המכיל את התקשורת באמצעות פיפטה המצורפת טיפים מטעין. לאחר מכן, לנתח את המדיה שנדגמו על ידי MS, לבדוק את הנוכחות של הניתוח של הריבית (בדרך כלל, זה לא צריך להיות ניתן לזיהוי).
  8. הוסף 2 μl הממס יינון לקפילר המכיל את התא, לתקן את הנימים למתאם התרסיס ננואלקטלי (nano-ESI) מחובר ספקטרומטר מסה מתאים, ולהתחיל את שיטת הרכישה האוטומטית.

7. עיבוד וניתוח נתונים בספקטרומטר מסה

הערה: ניתן להשתמש בכל תוכנה מתאימה לביצוע ניתוח נתונים. עם זאת, אם החוקרים מעוניינים לבצע ניתוח נתונים באמצעות תוכנה שאינה מסופקת על-ידי ספק MS, אז יש להמיר את הנתונים הגולמיים מתבנית הספק הקניינית לתבנית פתוחה או כקובץ טקסט ראשון (שנעשה כאן).

  1. נרמל את הנתונים על-ידי חלוקת אזור השיא של האנליטה של הריבית (s) של התקן הפנימי מאותה סריקת MS. לאחר מכן, התחבר לשינוי יחסי השיא כדי להקטין את ההטיה.
  2. התווה את העוצמה המנורמלת של התרופה או את המטלילייט שלו בתור מזימת הרשת או עקומת הדחיסות כדי להמחיש את ההתפלגות בין תאים בודדים. כאן, משתמשים בתוכנה סטטיסטית R, יחד עם חבילת ggplot2.
  3. לחשב את התרופה מטבוליזם ליחס התרופה בלתי מטבוליזם על ידי חלוקת השפע של מטבוליזם התרופה על ידי זה של מולקולת ההורה הבלתי מטבוליזם בכל תא (כלומר, 4-OHT ו טמוקסיפן, בהתאמה.
    הערה: הקורלציה בין וריאציות של פסגות ראמאן מסוים של ריבית הווריאציות בפסגות MS של התרופה או מטבוליטים שלה ניתן ללמוד. זוהי תוספת לקורלציה אפשרית בין הסם עצמו לבין המטטבוליט שלו בתאים בודדים. ניתן לעשות זאת על-ידי חישוב מקדם המתאם פירסון באמצעות מבחן דו-זנבי. יש לשקול גם גישות מתקדמות יותר אינטגרטיבית.

Representative Results

ניתוח תא בודד של אינטראקציות תרופות (ספיגת, חילוף החומרים ואפקטים) חיוני לחשוף כל האוכלוסייה החבויה או התרופות עמידים משנה, כמו גם הבנה של ההשפעות של טרוגניות הסלולר. בפרוטוקול זה, שתי טכניקות משלימות שימשו כדי למדוד את האינטראקציות הנ ל בתאים בודדים: ספקטרוסקופיית ו-MS. ראמאן במהירות מזהה תאים המושפעים על ידי תרופות המבוססות על סמנים ספקטרליות של תגובת התרופה. MS משמש לניטור ספיגת ומטבוליזם של הסם באופן סלקטיבי וחצי כמותי. תאים הוקרן לראשונה על ידי ספקטרוסקופיה ראמאן ולאחר מכן שנדגמו בנפרד עבור ניתוח על ידי MS.

ניתוח השוואתי של הספקטרום הממוצע של כל תנאי (עם ובלי טיפול בסמים) מוצג באיור 2. ספקטרום הממוצע של שני התנאים שונים בבירור בפסגות שונות, אשר זוהו בעבר והוקצו תרכובות מולקולריות2. במיוחד, הפסגות ב 1000 ס מ- (מוקצות תרכובות ארומטיות כגון פנילאלנין ו טירולך) להראות הבדלים חזקים. המשמעות של ההבדל הסטטיסטי צריך להיות מוערך על ידי ניתוח רב משתנים נוספים.

ערכת הנתונים היתה לאחר מכן להכשיר מודל PLS (שלבים 4.5-4.8) מיועד להבדיל בין שני טיפולי תאים (עם תרופה: n = 290, ללא סמים: n = 115). היכולת הניבוי לסווג את התאים המתורבתות בנוכחות טמוקסיפן הגיעו 100% רגישות ו 72% ספציפיות בנתוני הבדיקה (לא ידוע ממודל מאולף מחוצה אימות). רגישות היא מדד של התוצאות החיוביות האמיתיות המזוהות בצורה נכונה על-ידי המודל, בעוד שהספציפיות היא מדד של התשלילים הממשיים המזוהים על-ידי המודל. דגמים חלופיים כגון SVMs, LDAs, ורשתות עצביות עשויים לספק תוצאות דומות או טובות יותר, למרות השוואה מקיפה לא בוצעה במחקר זה.

בהתבסס על מודל PLS, ציוני ה-VIP חושבו, אשר מייצגים את החשיבות של אורכי גל (משמרות ראמאן) להפלות את התנאים ניסיוני (איור 3). חשוב מכך, הפסגות הגבוהות ביותר של פרופילי ה-VIP התכתב עם פסגות ראמאן שבהן נראו הבדלים חזקים בין שני הטיפולים. זה אישר את ההבדלים המולקולריים הספציפיים בין תאים מטופלים ולא מטופלים. כתוצאה מכך, חוקרים יכולים לזהות סמנים ספקטרלי אפשריים המשקפים את התגובה של תאים בודדים לטיפול בסמים. ניתן לבדוק בסמנים אלה עוד כדי לאמת את הרלוונטיות הביולוגית שלהם ואת ההכללה בתנאים שונים וקווי תאים.

בשידור חי תא בודד המסה (LSC-MS) מערכת היתה אפשרות לזהות הן את התרופה מטבוליטים שלה בודד, תרופות מטופלים HepG2 תאים שנמדדו בעבר על ידי ספקטרוסקופיית ראמאן. בנוסף, ניתן להשתמש ב-MS טנדם כדי לאשר את המבנה של שתי המולקולות. לאחר זיהוי חיובי, השפע היחסי של הסם ומטבוליטים נמדדו בכל תא ולעומת פסגות הרקע בתאים לא מטופלות. וריאציה חזקה נצפתה בשפע טמוקסיפן, תופעה זו היה אפילו יותר מבוטא במקרה של המטטבוליט שלה, 4-OHT (איור 4). הקשר בין שפע טמוקסיפן לבין מטבוליטים נחקרו גם, שבו מתאם חיובי משמעותי נמצא בין שני (r = 0.54, p = 0.0001, n = 31).

Figure 1
איור 1: מערכת איסוף תאים רכוב על במת מיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: הספקטרום הממוצע של תאים שטופלו בסמים (עם טממוקסיפן: n = 295) ותאים לא מטופלים (ללא טמוקסיפן: n = 115). פסגות ראמאן ניתן לזהות מתוך הספרות. רוב ההבדלים ספקטרלי חזק הם משמעותיים מבחינה סטטיסטית (ANOVA, p ≤ 0.5) כמתואר בעבר4. איור זה השתנה מפרסום קודם4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: עשרות VIP שחולצו מן המודל PLS חזוי. ציוני VIP משקפים את אורכי הגל התורמים להבחנה בין שתי הכיתות במודל. רוב הפסגות מתאימות למולקולות ספציפיות שנצפו כסמנים ספקטרליות של השפעות הסמים על תאים שטופלו בסמים. איור זה השתנה מפרסום קודם4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הפצת שפע טמוקסיפן והמטטבוליט שלה. התפלגות שפע של טמוקסיפן והמטאווליט שלה, 4-OHT (נמדד ברמת תא בודד) לעומת פסגות אנדוגני בתאים מטופל (שליטה). איור זה השתנה מפרסום קודם4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

בכתב היד הזה, נבחר מקרה פשוט שבו HepG2 תאים נחשפו (או לא) לטמוקסיפן. היכולת של ספקטרוסקופיית ראמאן ומערכת ספקטרומטר המסה ממחישה כדי לפקח על ההשפעות של טמוקסיפן על התאים. ספקטרוסקופיית ראמאן מאפשר זיהוי של סמנים פוטנציאליים שיקפו תגובה כללית של תאים בודדים לחשיפה לסמים. כמה טרוגניות בין תאים בודדים נצפתה, טוען כי כמה תאים לא הגיבו לחשיפה לסמים. מצד שני, LSC-MS היה מסוגל לבצע ניתוח ממוקד של התרופה ואת מטבוליזם שלה ברמה תא בודד, שבו רמה גבוהה של טרוגניות נצפתה בתרופה ואת השפע מטבוליזם שלה. טרוגניות זה עוזר להסביר מדוע תאים מסוימים מושפעים התרופה בעוד אחרים הם לכאורה לא, למרות התאים שמקורם באוכלוסייה אחידה לכאורה12.

בין היבטים מסוימים של טכניקה זו הדורשת תשומת לב, חשוב להעריך את איכות הגדרת המיקרוסקופ ועיבוד האותות כדי להבטיח את הנתונים. אם עיבוד מקדים של הספקטרום מתבצע בקפידה, יש להגדיל את וריאציות האות במקסימום של כל שיא. לעומת זאת, הבסיס והקצה של הספקטרום צריכים לחפוף בין תנאי התא שנבדקו. היבט חשוב נוסף הוא מודל רב-משתנים המשמש לחקר הבדלים בין טיפולים. יש להעריך בקפידה את המודלים ואת פרמטרי המודל כדי להבטיח ניתוח מדויק ומדויק. אחד היתרונות של המודל PLS, בניגוד לרשתות עצביות, הוא שזה מאפשר גישה למשקולות הקשורות לכל אורך הגל (ראמאן משמרות) הבחנה הטובה ביותר את התנאים נבדק על ידי המודל.

למרות הספקטרוסקופית ראמאן מפלה בהצלחה את תגובת התרופה, יש להדגיש כי טכניקה זו מוגבלת בשימוש בה כדי לספק פרשנות ביולוגית. זה נובע בעיקר המורכבות של האות ספקטרלי, אשר כוללת תערובת של אלפי מולקולות. לפיכך, נדרשת חקירה נוספת להערכת וריאציות שיטתית בין עוצמות ווריאציות ספקטרליות של ראמאן בריכוזים של סמים. כמו כן, מחקרים דומים של קווי תאים אחרים נדרשים להעריך את ההכללה של סמנים ספקטרלי הקשורים טמוקסיפן.

יתר על כן, זה עשוי להיות עניין לבצע מדידות רקמות החיים כדי להעריך פרמקודינמיקה וללמוד כיצד סמים לחדור ולזרום בתוך כל תא. יתרה מזאת, יש לציין כי צעד הדגימה ב-LSC-MS תלוי מאוד במיומנות של המפעיל. פרמטרים כגון רזולוציה מרחבית, מיקום התא בתוך נימי לאחר הדגימה, וחוזק התפוקה הם לגמרי תלויים, אשר מגביל את האימוץ בקנה מידה גדול של LSC-MS. למרות שמערכות דגימה אוטומטיות עשויות להקל על הבעיה. יתר על כן, בעוד LSC-MS מצטיין בדיגום מחסיד או תאים צפים במדינות הילידים שלהם, היא מבצעת גרוע יותר בתאי דגימה מוטבע בסעיפים רקמות. הדבר נובע מהנטייה של עצה נימי הדגימה להישבר אם צפיפות המדגם גבוהה. לכן, גישה נוספת כגון בדיקה בודדת עשויה להיות מתאימה יותר במקרים כאלה14,15.

מאז התאים המשמשים כאן הם שנדגמו בתנאי הסביבה עם הכנה לדוגמה מינימלית, LSC-MS ניתן לשלב בקלות עם טכנולוגיות אחרות, כפי שמוצג על ידי שילוב שלה עם ראמאן בפרוטוקול זה. שילוב דומה נוסף עם הולוגרפיה תלת-ממדית מאפשר להשיג כימות מוחלטות של מטבוליטים סלולאריים ברמה התאית16. בנוסף, שילוב עם cy, הזרמת ביוטונסה אפשרה לגלות ביואריטים מטבולית בתאים סרטניים במחזור בודדים של חולי סרטן נוירובלסטומה17,18.

בעתיד, בשל ההתעניינות הגוברת האחרונה בשילוב מערכות נתונים מדפוסי הדמיה19, זה עשוי להיות גם עניין ללמוד את הווריאציות הסיסטמיות בין אותות ראמאן לבין תוצאות ספקטרומטר המסה (כמו גם שיטות אחרות omics) באמצעות גישות חישוביות אינטגרטיבית. מעניין, כבר מצאנו כמה חלשים אך משמעותיים ליניארי היחסים בין העוצמות של פסגות ראמאן מזוהה על ידי ציוני VIP שפע של טמוקסיפן או מטבוליזם שלה ברמה תא יחיד כפי שזוהה על ידי MS4. נתונים אלה עשויים להציע קשר מטבולי בין פרופילי MS וספקטרום ראמאן והאפשרות לחזות ערכים אלה.

Disclosures

המחברים אינם מצהירים על ניגודי אינטרסים.

Acknowledgments

המחברים מודים טושיו Yanagida על תמיכתו ו RIKEN קרנות שיתוף פעולה פנימי המיוחס ד ר ארנו גרמונד.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.1% penicillin-streptomycin Nacalai Tesque 09367-34
35mm glass bottom grid dish Matsunami
4-Hydroxy Tamoxifen standard Sigma-Aldrich 94873
532 nm diode pumped solid-state laser Ventus, Laser Quantum
BIOS-L101T-S motorized microscope stage OptoSigma
CT-2 cellomics coated sampling capillaries HUMANIX
d5-Tamoxifen standard Cambridge Isotope Laboratories
Dimethyl sulfoxide LC-MS grade Nacalai Tesque D8418
Dulbecco's Modified Eagle's medium Sigma-Aldrich D5796
Eppendorf GELoader tips Eppendorf
fetal bovine serum Hyclone laboratories SH3006603
FluoroBrite DMEM Thermo Fisher Scientific
Formic acid LC-MS grade Sigma-Aldrich 33015
HepG2 cell line (RCB1886) RIKEN cell bank center RCB1886
MC0-19A1C Incubator Sanyo Electric Co. MC0-19A1C
Methanol LC-MS grade Sigma-Aldrich 1060352500
MMO-203 3-D Micromanipulator Narshige MMO-203
NA:0.95, UPL40 water-immersion Olympus objective lens Olympus
Nanoflex nano-ESI adaptor Thermo Fisher Scientific ES071
On-stage incubator ibidi
Pierce LTQ Velos ESI calibration solution Thermo Fisher Scientific 88323
PIXIS BR400 cooled CCD camera Princeton Instruments
Q-Exactive Orbitrap Thermo Fisher Scientific
Rat-tail collagen coating solution Cell Applications Inc.
Tamoxifen standard Sigma-Aldrich 85256

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Altschuler, S. J., et al. Cellular heterogeneity: do differences make a difference? Cell. 141, (4), 559-563 (2010).
  2. Ali, A., et al. Single-cell metabolomics by mass spectrometry: Advances, challenges, and future applications. TrAC Trends in Analytical Chemistry. (2019).
  3. Bunnage, M., et al. Target validation using chemical probes. Nature Chemical Biology. 9, (4), 195-199 (2013).
  4. Ali, A., et al. Single-Cell Screening of Tamoxifen Abundance and Effect Using Mass Spectrometry and Raman-Spectroscopy. Analytical Chemistry. 91, (4), 2710-2718 (2019).
  5. Wu, H., et al. In vivo lipidomics using single-cell Raman spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, (9), 3809-3814 (2011).
  6. Okada, M., et al. Label-free Raman observation of cytochrome c dynamics during apoptosis. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, (1), 28-32 (2012).
  7. Palonpon, A. F., et al. Raman and SERS microscopy for molecular imaging of live cells. Nature Protocols. 8, (4), 677-692 (2013).
  8. Butler, H. J., et al. Using Raman spectroscopy to characterize biological materials. Nature Protocols. 11, (4), 664-687 (2016).
  9. Mark, H., Workman, J. Jr Chemomtrics in Spectroscopy. Second Edition, Academic Press. (2018).
  10. Lieber, C. A., Mahadevan-Jansen, A. Automated method for subtraction of fluorescence from biological Raman spectra. Applied Spectroscopy. 57, 1363-1367 (2003).
  11. Germond, A., et al. Raman spectral signature reflects transcriptomic features of antibiotic resistance in Escherichia coli. Communications Biology. 1, 85 (2018).
  12. Wold, S., et al. Partial Least Squares Projections to Latent Structures (PLS) in Chemistry. Encyclopedia of Computational Chemistry. (2002).
  13. Chong, I. G., Jun, C. H. Performance of some variable selection methods when multicollinearity is present. Chemometrics and Intelligent Laboratory Systems. 78, (2005).
  14. Inde, Z., Dixon, S. J. The impact of non-genetic heterogeneity on cancer cell death. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology. 53, (1), 99-114 (2018).
  15. Pan, N., et al. The single-probe: a miniaturized multifunctional device for single cell mass spectrometry analysis. Analytical chemistry. 86, (19), 9376-9380 (2014).
  16. Rao, W., et al. Applications of the Single-probe: Mass Spectrometry Imaging and Single Cell Analysis under Ambient Conditions. Journal of Visualized Experiments. (112), e53911 (2016).
  17. Ali, A., et al. Quantitative Live Single-cell Mass Spectrometry with Spatial Evaluation by Three-Dimensional Holographic and Tomographic Laser Microscopy. Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 32, (2), 125-127 (2016).
  18. Abouleila, Y., et al. Live single cell mass spectrometry reveals cancer-specific metabolic profiles of circulating tumor cells. Cancer Science. 110, 697-706 (2018).
  19. Hiyama, E., et al. Direct Lipido-Metabolomics of Single Floating Cells for Analysis of Circulating Tumor Cells by Live Single-cell Mass Spectrometry. Analytical Sciences: the International Journal of the Japan Society for Analytical Chemistry. 31, (12), 1215-1217 (2015).
  20. Ryabchykov, O., et al. Fusion of MALDI Spectrometric Imaging and Raman Spectroscopic Data for the Analysis of Biological Samples. Frontiers in Chemistry. 6, 257 (2018).
ספקטרוסקופיית ראמאן משולבת ופלטפורמת ספקטרומטר המסה ללימוד תא יחיד קליטת סמים, מטבוליזם, ואפקטים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ali, A., Abouleila, Y., Germond, A. An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects. J. Vis. Exp. (155), e60449, doi:10.3791/60449 (2020).More

Ali, A., Abouleila, Y., Germond, A. An Integrated Raman Spectroscopy and Mass Spectrometry Platform to Study Single-Cell Drug Uptake, Metabolism, and Effects. J. Vis. Exp. (155), e60449, doi:10.3791/60449 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter