Summary
Burada zebra balığı embriyoları Tg (vtg1: mCherry) östrojenik etkilerinin tespiti için kullanımı için ayrıntılı bir protokol dür. Protokol, balığın yayılmasını ve embriyoların tedavisini kapsar ve endokrin bozucu bileşiklerin (EDC) neden olduğu floresan sinyallerin saptanması, belgelenmesi ve değerlendirilmesini vurgular.
Abstract
Birçok endokrin bozan bileşikler vardır (EDC) ortamda, özellikle östrojenik maddeler. Bu maddelerin tespiti kimyasal çeşitliliği nedeniyle zordur; bu nedenle, östrojenik etkiye duyarlı biyomonitör/biyoindik organizmalar gibi giderek daha fazla etki algılayan yöntemler kullanılmaktadır. Bu biyomonitoring organizmalar çeşitli balık modelleri içerir. Bu protokol, edc tarafından indüklenen floresan sinyallerin tespiti, belgelenmesi ve değerlendirilmesi üzerinde durularak, balık ların yayılması ve embriyoların tedavisi de dahil olmak üzere, bir biyomonitoring organizma olarak zebra balığı Tg (vtg1: mCherry) transgenik hattın kullanımını kapsamaktadır. Çalışmanın amacı östrojenik etkileri tespit etmek için Tg (vtg1: mCherry) transgenik hat embriyolarının kullanımının gösteridir. Bu çalışma, iki östrojenik madde, α- ve β-zearalenol test ederek östrojenik etkilerin saptanması için transgenik zebra balığı embriyoları Tg (vtg1: mCherry) kullanımını belgeletir. Açıklanan protokol yalnızca tahlil ler tasarlamak için bir temeldir; test yöntemi, test uç noktalarına ve örneklere göre çeşitlendirilebilir. Ayrıca, diğer araştırma yöntemleri ile kombine edilebilir, bu nedenle transgenik hattın gelecekteki kullanımını kolaylaştırmak.
Introduction
Çevremizdeki en tehlikeli maddeler arasında yer alan önemli sayıda endokrin bozucu bileşik (EDC) bulunmaktadır. Bunlar esas olarak doğal kaynaklardan gelen suyu kirleten östrojenik bileşiklerdir. Gruba ait maddelerin kimyasal çeşitliliği, tespitleri için farklı analitik yöntemler gerektiğinden, varlıklarının test edilmesine neden olur. Kimyasal yapılarına göre bir maddenin aslında östrojen olarak hareket edip edemeyeceğini belirlemek çok zordur. Buna ek olarak, bu maddeler ortamda saf bir formda mevcut asla, bu yüzden etkileri diğer bileşikler, çok1etkilenebilir. Bu sorun, östrojenik etkiler gösteren biyomonitör/biyoindik organizmaların kullanımı gibi etki algılama yöntemleri ile çözülebilir2,3,4,5.
Son zamanlarda, hücre hattıçeşitli 6 ve maya tabanlı test sistemleri2,3 östrojenik etkileri tespit etmek için geliştirilmiştir. Ancak, bu genellikle sadece östrojen reseptörüne maddenin bağlanmasını tespit edebiliyoruz2,3. Buna ek olarak, organizmadaki karmaşık fizyolojik süreçleri modelleyemiyorlar veya yaşam evrelerinin hormona duyarlı evrelerini tespit edemiyorlar; bu nedenle, genellikle yanlış sonuçlara yol açar.
Bazı genlerin canlı organizmalarda östrojene duyarlı tepki verdiği bilinmektedir7. Gen ürünlerinin moleküler biyoloji yöntemleri ile saptanması protein veya mRNA düzeyi8,9'dada mümkündür, ancak genellikle hayvan kurban edilmeyi içerir. Hayvan koruma yasaları sıkı hale gelmiştir ve deneylerde kullanılan hayvanların sayısını ve acılarını en aza indiren veya hayvan modelinin başka bir model sistemi10ile değiştirilmesini en aza indiren alternatif test sistemleri için artan bir talep vardır. Floresan proteinlerin keşfi ve biyomarker hatlarının oluşturulması ile, transgenik teknolojiler iyi bir alternatif11sağlar. Bu çizgilerle, östrojene duyarlı bir genin aktivasyonu in vivo test edilebilir.
Omurgalılar arasında, çevresel risk değerlendirmesinde balık potansiyeli göze çarpar. Memeli modellerine göre pek çok avantaj sunarlar: sucul organizmalar oldukları için, tüm vücutlarındaki kirleticileri absorbe edebiliyoruz, çok sayıda yavru üretebiliyorlar ve bazı türlerinin kısa nesil süresi ile karakterize ediliyor. Onların endokrin sistem ve fizyolojik süreçleri diğer omurgalılar ve hatta memeliler ile büyük benzerlikler göstermek, insanlar da dahil olmak üzere12.
Balıklarda östrojenik etkilerin saptanması için çeşitli genler de bilinmektedir. En önemli östrojen reseptörleri aromataz-b, koryojenin-H, ve vitellogenin (vtg)7,13. Son zamanlarda, birkaç östrojen üreten biyosensör hatları da zebra balığı gibi laboratuvarda kullanılan balık modelleri oluşturuldu (Danio rerio)4,5,14,15,16,17. Biyosensör hatları oluştururken zebra balığının en büyük avantajı embriyove larvaların saydam gövdesidir, çünkü floresan muhabir sinyali hayvandan ödün vermeden in vivo'da kolayca incelenebilir10. Hayvan koruma ek olarak, aynı zamanda tedavinin farklı zamanlarda aynı bireyin reaksiyonu incelenmesi için izin verir gibi değerli bir özelliktir18.
Bu deneyler bir vitellogenin muhabiri transgenik zebra balığı hattı15kullanın. Tg(vtg1:mCherry) gelişimi için kullanılan transgen yapı uzun (3.4 kbp) doğal vitellojenin-1 organizatörü vardır. Östrojen reseptörü (ER) steroid / nükleer reseptör superfamily bir temsilcisi olan ligands tarafından aktive bir arttırıcı proteindir. ER yüksek yakınlık ile östrojen yanıt elemanları (EREs) olarak adlandırılan belirli DNA dizileri bağlanır ve estradiol ve diğer östrojenik maddelere yanıt olarak gen ekspresyonu transaktive, bu yüzden organizatör daha fazla ERE daha güçlü bir yanıt neden olur19. Tg(vtg1:mCherry) transgen yapısının promotör bölgesinde 17 ERE sitesi vardır ve yerli vtg geninin ekspresyonunu taklit etmeleri beklenmektedir15. Cinsel olarak olgunlaşmış kadınlarda floresan sinyalin sürekli bir ifadesi vardır. Ancak, erkeklerde ve embriyoda karaciğerdeki ifade sadece östrojenik maddelerle tedavi ile görülebilir(Şekil 1).
Şekil 1: Vtg1:mCherry transgenik erişkin zebra balığı ve 5 dpf embriyonun karaciğerinde 17-ß-estradiol (E2) indüksiyonu takiben kırmızı floresan sinyal. E2 ile tedavi edilen kadın ve erkekte (25 μg/L maruz kalma süresi:48hrs) karaciğerin güçlü floresansı pigmentli deride bile görülebilir. İşlenmemiş erkekte floresan sinyal görülmez (A). E2 indüksiyonu (50 μg/L maruz kalma süresi: 0-120 hpf) sonrasında, kontrol embriyolarında görünmeyen 5 dpf embriyonun karaciğerinde kırmızı floresan sinyal de görülebilir (B). Floresan sinyal yetişkin kadınlarda sürekli mevcut iken, öncelikle erkek ve çizginin embriyolar östrojenik etkileri tespit etmek için uygundur. (BF: parlak alan, mCherry: kırmızı floresan filtre görünümü, tek düz görüntüler, Ölçek çubuğu A: 5mm, ölçek çubuğu B: 250 μm) Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Endojen vitellojenin benzer, mCherry muhabiri sadece karaciğer ifade edilir. Vitellojenin sadece östrojen varlığında üretilen çünkü, kontrollerde hiçbir floresan sinyal yoktur. İfade sadece karaciğerde olduğundan, sonuçların değerlendirilmesi çok daha kolaydır15.
Bu hattın embriyolarının duyarlılığı ve kullanılabilirliği çeşitli östrojenik bileşik karışımlar üzerinde ve ayrıca çevresel örneklerde15,20, araştırılmış ve çoğu durumda doz-yanıt ilişkileri belgelenmiştir(Şekil 2). Ancak, son derece toksik durumunda, özellikle hepatotoksik, maddeler (örneğin, zearalenone), sadece çok zayıf floresan sinyal tedavi embriyoların karaciğer görülebilir ve neden maksimum yoğunluklu floresan sinyal çok küçük bir konsantrasyon aralığı içinde ulaşılabilir, hangi zor doz-etkisi ilişkileri kurmak için yapar20.
Şekil 2: Karaciğerin (B) 17-α-ethynilestradiol (EE2) maruz kalan doz-yanıt diyagramı (A) ve floresan görüntüleri (MCherry), içinde 5 dpf vtg1:mCherry larva. Sonuçlar, sinyal gücünden ve etkilenen alanın büyüklüğünden (±SEM, n = 60) oluşturulan entegre yoğunluk olarak ifade edilir. %100 gözlenen maksimum anlamına gelir. Floresan sinyal yoğunluğu konsantrasyonu ile kademeli olarak artmıştır. Ölçek çubuğu = 250 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Çevrede çeşitli östrojenik maddeler vardır, 17-β-estradiol (çevresel konsantrasyon: 0.1-5.1 ng/L)21, 17-α-ethynylestradiol (çevresel konsantrasyon: 0.16-0.2 μg/L)22, zearalenone (çevresel konsantrasyon: 0.095-0.22 μg/L)23, bisfenol-A (çevresel konsantrasyon: 0.45-17.2 mg/L)24. Bu maddeleri mCherry transgenik embriyolar yardımıyla saf aktif bir formda test ederken, floresan işaret tespiti için en düşük gözlenen etki konsantrasyonları (LOEC) 17-ß-estradiol için 100 ng/L, 17-α-ethynilestradiol için 1 ng/L, zearalenone için 100 ng/L ve bisfenol-A (96-120 hpf tedavi) için 1 mg/Lidi. Tg(vtg1:mCherry) transgenik hattı doğrudan maruz kaldıktan sonra atık su örneklerinde östrojeniitenin saptandırılabiliyor. Çizgi olarak yaygın olarak kullanılan maya östrojen testi, bioluminiscent maya östrojen (BLYES) testi15kadar hassastır. Bu hattın yardımıyla, zearalenone kaynaklı toksisite karşı beta-siklodekstrinlerin koruyucu etkileri kimyasal karışımları kullanılarak teyit edilmiştir20.
Yakın tarihli bir raporda transgenik hattın in vivo kullanımı iki östrojenik zearalenon (ZEA) metaboliti, α- ve β-zearalenol (α-ZOL ve β-ZOL)25. Protokol taban çizgisi, çeşitli bileşiklerin veya çevresel örneklerin Tg(vtg1:mCherry) embriyoları üzerindeki östrojenik etkilerini incelemek için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan Protokolü Macar Hayvan Refahı Kanunu uyarınca onaylandı ve tedavi edilen bireyler serbest beslenme aşamasına gelmeden önce tüm çalışmalar tamamlandı.
1. Embriyo hasadı ve tedavisi
- 25,5 ± 0,5 °C, pH = 7 ± 0,2, 525 ± 50 μS/m arasında iletkenlik, oksijen seviyesi ≥80 doygunluk ve 14 saat Açık ve 10 saat karanlık döngüde Tg(vtg1:mCherry) zebra balıklarını koruyun.
- Sistem suyu ile miyon tankları doldurun ve yumurta hasat önce öğleden sonra mısrama için balık kurmak.
- Erkek ve dişi balıkları tankın içine yerleştirin ve bölücü yardımıyla ayırın.
- Ertesi sabah ışık lar yanarken bölücüyü tanklardan çıkarın. Her 15-20 dakikada bir yumurta için miyon tankları kontrol edin.
- Bir çay süzgeci veya yoğun dokuma ince örgü kullanarak tüm embriyolar hasat ve E3 tampon (5 mM sodyum klorür, 0,17 mM potasyum klorür, 0,33 mM kalsiyum klorür, 0,33 mM magnezyum sülfat) veya berrak sistem suyu ile büyük bir Petri çanak içine birleştirin.
- Embriyoları 25,5 ± 0,5 °C'ye ayarlanmış kuvöze yerleştirin.
- 1-1,5 saat sonra, döllenmemiş veya yetersiz bölünen yumurtaları plastik bir aktarım borusu ile bir diseksiyon mikroskobu altında çıkarın ve atın.
NOT: Döllenmemiş yumurtalar opak; döllenmiş yumurtalar saydamdır. Gelişimin daha sonraki bir aşamasında tedaviye başlamak için, tedavi edilen bireylerin normal gelişimine dikkat edin. - Seçilen embriyoları, test maddesinin farklı konsantrasyonlarıyla etiketlenmiş ve doldurulmuş tedavi damarlarına (örn. Petri kaplarında veya doku kültürü plakalarında) yerleştirin.
- Deney bitene kadar embriyoları 25.5 ± 0.5 °C'de kuluçkaya yatırın.
NOT: Embriyolar çeşitli östrojenik bileşiklere karşı önemli bireysel duyarlılık la reaksiyona sokabilirler, bu nedenle deneyi doğru değerlendirmek için en az üç tekrar tedavide en az 15 embriyo kullanılması önerilir. Konteyner seçerken, bir embriyo gelişimi su26en az 200 μL gerektirdiğini unutmayın. Bu deneyde embriyolar 25.5 ± 0.5 °C'de 120 hpf'ye kadar inkübedildi. - Tedavi konsantrasyonunu korumak için nekse ise test çözeltisini yenileyin. Embriyolara zarar vermemek için test çözümlerini değiştirirken dikkatli olun.
NOT: Deney sırasında mortalite veya öldürücü semptomları araştırmak da mümkündür. Güvenilir sonuçlar elde etmek için kullanılan konsantrasyonlar mümkün olduğunca kararlı kalmalıdır. Bu test çözümleri yenileyerek kolayca elde edilebilir. Ferahlatıcı sıklığı test maddesine bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle, çözüm güncellemelerinin sıklığını belirlemek için test maddesinin konsantrasyonunun analitik ölçümlerle kontrol edilmesi tavsiye edilir.
2. Larvaların fotoğraf alabına hazırlanması
- ÖNCEDEN MS-222 (triain-metan-sülfonat) ile %4 metilselüloz hazırlayın.
- Bunun için 4 mg/mL MS-222 ila 100 mL çift distile su ilave edin ve çözeltiyi 4 °C'ye getirin. Sonra metilselüloz 4 g ekleyin. Bir manyetik karıştırıcı ile karıştırın, sonra 4 ° C gecede bırakın.
- Ertesi gün, tekrar karıştırın ve çözüm kullanıma hazır olmalıdır. Metilselüloz tamamen çözülmemişse 4 °C'ye geri koyun ve birkaç saat daha bekleyin.
- Bir Pasteur pipet ile tedavi grubu başına 5 cm Petri çanak içine 5 günlük larva yerleştirin.
- Tedavi çözeltisini larvadan plastik bir pipetle çıkarın ve Petri kabını %0,02 MS-222 anestezik solüsyon ile 2 mL doldurun.
NOT: Anestezi genellikle bir dakikadan kısa sürede etkilidir. Larvalar dokunmaya tepki olarak yüzemezlerse anestezi yedirilirler. Aşırı dozda MS-222 larvaları öldürebilir. - Özel olarak tasarlanmış 10 cm Petri kabının her karesini %4 metilselüloz ile MS-222 ile doldurun(Şekil 3).
NOT: Petri kabının alt kısmında plastik levhalar (1 mm yükseklik, 5 mm genişliğinde) kullanılarak iki adet 1,5 x 1,5 cm karelik alanlar yapıştırın. Yirmi larva bir meydanda yan yana yerleştirilebilir. Bunun yerine özel olarak tasarlanmış Petri çanak, başka bir düşük kenar konteyner embriyoların konumunu düzeltmek için kullanılabilir.
Şekil 3: 1,5 x 1,5 cm genişliğinde yapıştırılmış, 1 mm kalınlığında plastik levha kareler fotoğraf için larva hazırlama ile 10 cm Petri çanak. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
- Anestezi edilmiş larvaları iki kareden birinde biraz su yla metilselüloza aktarın. İlk kareden larvaları ikinci meydana aktarın.
NOT: Bu transfer yardımıyla fotoğrafçılıkta kullanılan %4'lük metilselüloz seyreltilmeyecek ve görüntüleme sırasında larvalar dönmez. - İkinci karede larvaları sol tarafına döndürün ve yönlendirin ve 2 cm'ye kadar kesilmiş bir mikroloader pipet ucu yla yavaşça selülozun dibine bastırın.
NOT: Larvalarda yaralanmaya neden oldukları için diğer pipet uçlarını kullanmayın.
3. Mikroskopi
NOT: Fotoğrafçılık hayvanları öldürmez. Hayvanlar metilselüloz onları kaldırarak ve tatlı sistem su veya arıtma çözeltisi yerleştirerek uyandırılabilir, böylece aynı kişi tedavi sırasında birkaç kez incelenebilir.
- İfade edilen muhabirin sinyalini değerlendirmek için embriyoları aynı görüş ve ayarlarla görüntüleyin.
NOT: Optimal embriyo konumlandırma için adım 2.6'ya bakın. El yazmasındaki fotoğraflar açıklanan koşullar altında çekildi. Parlak alan: 60x büyütme, 6 ms exposition, Iris 100%, Gain:1.1, floresan fotoğraflar: 60x büyütme, 300 ms sergi, Iris: 100%, Kazanç:1, mCherry filtre, floresan ışık kaynağı: cıva metal halide ampul. Floresan stereomikroskop, özel kamera ve mikroskop için yazılım fotoğraf çekmek için kullanılmıştır. - Petri kabını mikroskop un sahnesine yerleştirin.
- Embriyonun karaciğerine odaklanın ve ilgili yazılımı kullanarak parlak bir alan görüntüsü yakalayın.
- Mikroskobu mCherry filtresine çevirin ve ilgili yazılımı kullanarak floresan ışık altında karaciğerin floresan görüntüsünü alın.
NOT: Karanlıkta tüm floresan adımlarını gerçekleştirin. Bu görüntülerin analizinde yardımcı olacak gibi, parlak alan ve floresan görüntüleri yakalama arasında büyütme, odak veya embriyo konumunu değiştirmeyin. - Deneydeki tüm embriyolar görüntülenene kadar 3.3 ve 3.4 adımlarını tekrarlayın.
4. Entegre yoğunluğun belirlenmesi
NOT: Floresan sinyal mukavemetini karşılaştırmak için en iyi göstergelerden biri entegre yoğunluk değeridir (yani, alanın ürünü ve ortalama gri değeri). Tümleşik yoğunluğunu belirlemenin en kolay yollarından biri ImageJ programı27'yikullanmaktır. Program internet üzerinden kullanılabilir ve bilgisayara yüklenebilir.
- Open ImageJ sonra ya sürükleyerek ve görüntü bırakarak veya Dosya' ya tıklayarak analiz edilecek floresan görüntü yükleyin| Aç.
- Resim üzerine tıklayın| Renk| RGB renk grafiğine göre floresan filtre tarafından yapılan görüntüyü bölmek için Kanalları bölün.
- Kırmızı kanal görüntü spektrumuyla çalışın, diğer kanalları kapatın.
- Yanlış sinyallerin değerlendirmeye müdahale etmemesi için görüntüde benzer büyüklükte bir eliptik alan belirleyin. Oval araçları kullanarak, vurgulanan karaciğer alanı üzerinde mümkün olduğunca doğru bir elips çizin.
- Sinyal zayıfsa karaciğerin yerini belirlemek için ışık mikroskobu görüntülerini (yani floresan görüntünün parlak alan çifti) kullanın.
- Analyze'a tıklayın| Sinyal gücünü ve etkilenen alanın boyutunu belirlemek için ölçün. Tümleşik yoğunluk değeri yazılım (grafikteki IntDen sütunu) tarafından otomatik olarak hesaplanır.
- Tedavi grubundaki tüm embriyoların floresan görüntüleri analiz edilene kadar 4.1-4.6 adımlarını tekrarlayarak analize devam edin.
- Verileri kaydedin ve tümleşik yoğunluk değerlerini çözümle.
NOT: Analiz sırasında görüntülerde her zaman aynı alan boyutunu seçin. Analiz edilecek alanın boyutu büyütme, görüntü çözünürlüğü, çekim için diğer ayarlar, vb bağlıdır. Analiz, analiz için kişisel makrolar kullanılarak hızlandırılabilir veya daha doğru hale getirilebilir. Örneğin, seçili alanın incelenen görüntülerde her zaman aynı olduğundan emin olmak için makrolar kullanılabilir. Belirli fotoğraf ayarlarına göre en iyi görüntü analizine olanak tanıyan makrolar oluşturmak için ayrıntılı açıklamalar ImageJ web sitesinde bulunur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu el yazmasında sunulan deneyde, iki östrojenik maddenin etkileri Tg(vtg1:mCherry) zebra balığı embriyolarında 5 gün boyunca döllenmeden başlayarak beş konsantrasyonda test edilmiştir. Maddeler nedeniyle maruz kalma süresinin sonunda balığın karaciğerinde floresan sinyallerin görünüp görünmediğini ve iki maddenin östrojeninde farklılıklar olup olmadığını araştırdık. Sonuçlar floresan görüntüler ve tümleşik yoğunluk değerleri temelinde değerlendirildi. Genel olarak, her iki madde de bireylerin hayatta kaldığı test konsantrasyonlarında maruz kalma süresinin sonunda transgenin ekspresyonuna neden oldu. İşlenmemiş kontrol balıklarında floresan sinyal görülmedi.
α-ZOL durumunda, en yüksek test konsantrasyonunda (8 μM) tüm bireyler ölmüştür, bu nedenle bu durumda floresan sinyal incelenemez. Daha düşük konsantrasyonlarda (0.5 μM–4 μM), embriyoların karaciğerinde güçlü bir floresan sinyali gözlendi(Şekil 4A). Floresan yoğunluğu nda ve floresan bölgelerin boyutunda anlamlı bir fark gözlenmedi (p < 0.05). α-ZOL entegre yoğunluk değerleri(Şekil 4C),maddenin floresan sinyal indüklediğine işaret eder. Entegre yoğunluk değerleri ile tedaviler arasında anlamlı bir fark saptamamadı (p < 0.05). Ortalama entegre yoğunluk 31,26 ± 13,95 (0,5 μM) ile 34,25 ± 15,36 (4 μM) arasında değişmektedir.
Β-ZOL ile tedavi sırasında mortalite belgelenmemektedir ve tüm tedavi konsantrasyonlarında madde transjen aktivitesine neden olmaktadır. Floresan ların yoğunluğu ve floresan alanın büyüklüğü, floresan görüntülerde görüldüğü gibi konsantrasyon arttıkça artmıştır(Şekil 4B). Α ve β-ZOL'un floresan görüntüleri görsel olarak karşılaştırıldığında, iki maddenin aynı tedavi konsantrasyonlarında β-ZOL için hem sinyal gücü hem de floresan alanın büyüklüğü gözle görülür şekilde daha zayıftı. β-ZOL(Şekil 4D)entegre değerleri incelenirken, ortalama entegre yoğunluk değeri en düşük ve en yüksek tedavi konsantrasyonları arasında neredeyse iki katına çıkmıştır. Ancak β-ZOL durumunda bireysel konsantrasyonların entegre yoğunluk değerleri arasında anlamlı bir fark yoktu (p < 0.05). Ortalama entegre yoğunluk 15,86 ± 4,08 (0,5 μM) ile 21,73 ± 5,94 (8 μM) arasında değişmektedir.
Şekil 4: Karaciğerdeki floresan sinyallerin yoğunluğundan ve 5 günlük Tg(vtg1:mCherry) transgenik zebra balığı embriyolarında α ve β-zearalenol tedavisinin neden olduğu etkilenen alanın büyüklüğünden elde edilen entegre yoğunluk değerlerinin sunumu. Deneyde, biyomarker zebra balığı serisinin östrojene duyarlı embriyoları (her tedavi konsantrasyonunda her üç grupta grup başına 20 larva) 0.5 μM-8μM α- ve β-ZOL konsantrasyonları ile 5 gün boyunca döllenmeden itibaren tedavi edildi. Α-ZOL (A) ve β-ZOL(B)için balık ciğerlerinin görüntüleri, maddelerin floresan sinyalin görünümünü tetiklediğini açıkça göstermektedir. Tümleşik yoğunluk verileri ortalama ± standart sapma (SD = hata çubuğu) olarak sunulur. Veriler, dışlanan aykırı ları tanımlamak için yinelemeli Grubbs ile analiz edildi. Shapiro-Wilk normallik testi ile veriler normallik açısından kontrol edildi ve parametrik yöntemlerin gereklerine uygunluk sağlandı. Dunnett'in testini takip eden tek yönlü ANOVA kullanılarak istatistiksel analizler yapıldı. Entegre yoğunluk değerleri incelenmiş, α-ZOL (C) ve β-ZOL(D)(p < 0.05) olgularında tedaviler arasında anlamlı bir fark saptanmamaz. Ölçek çubuğu = 200 μm. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Α-ZOL, iki maddenin aynı tedavi konsantrasyonlarından elde edilenFigure 5entegre yoğunluk değerlerini inceleyerek, floresan görüntülerde gözlenen sinyal güçlü yan ları arasındaki farklarla tutarlı olan β-ZOL'a göre her olguda daha yüksek entegre yoğunluk ortalamaları sunmuştur. Tüm tedavi konsantrasyonlarında anlamlı farklar (0.5 μM, p = 0.0011; 1 μM, p = 0.0003; 2 μM, p = 0.0329; ve 4 μM, p = 0.0325) bulundu.
Şekil 5: α- ve β-zearalenol entegre yoğunluk değerlerinin karşılaştırılması. Tümleşik yoğunluk verileri ortalama ± standart sapma SD = hata çubuğu olarak sunulur. Veriler, dışlanan aykırı ları belirlemek için yinelemeli Grubbs ile analiz edildi. Shapiro-Wilk normallik testi ile veriler normallik açısından kontrol edildi ve parametrik yöntemlerin gereklerine uygunluk sağlandı. Her konsantrasyonda (0.5 μM, p = 0.0011; 1 μM, p = 0.0003; 2 μM, p = 0.0329; ve 4 μM, p = 0.0325) α-ZOL ve β-ZOL arasında eşleşmemiş t-testi ile anlamlı farklar doğrulandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Toksikolojik çalışmalarda östrojenik etkiler için biyomonitör/biyogöstergelerin kullanımı yaygınlaştırılmıştır. In vivo modeller olağanüstü bir rol oynar, çünkü vitro testlerin aksine, onlar sadece bir hücre veya reseptör tepkisi hakkında bilgi sağlamak değil, aynı zamanda organizmada karmaşık süreçlerin araştırılmasına izin. Östrojenik etkileri incelemek için çeşitli transgenik çizgiler zebra balığından üretilmiştir, bunlardan biri bu çalışmalar için Tg (vtg1:mCherry) kullanılmıştır. Burada açıklanan yöntem saf, aktif maddeler vivo östrojen aktivitesini tespit etmek için bu hattın embriyoların test için bir protokol göstermektedir.
Erkekler ve çizginin embriyolar da östrojenik etkileri tespit etmek için uygundur, ancak embriyolar kullanılabilirlik teşvik çeşitli avantajları vardır. Özellikle, vücut şeffaf, bu yüzden karaciğerde floresan sinyal kolayca görülebilir. Zebra balığı karaciğeri döllenmeden 6 saat sonra (6 hpf) gelişmeye başlar ve 50 saat (50 hpf) sonra çalışmaya başlar. İlk olarak, karaciğerin sol lobu oluşur, ve 96 saat (96 hpf) karaciğer sağ lob da görünür. Karaciğerin son şekli yaklaşık gün 5 (120 hpf)28,29tarafından geliştirilmiştir. Karaciğer bir embriyo 2-3 gün yaşından itibaren endojen vitellojenin üretmek mümkün14, Hangi Tg floresan sinyalin görünümü ile çakışıyor (vtg1:mCherry) hattı15. Bu nedenle, deneyler tasarlarken, bir floresan sinyal sadece o zaman embriyo karaciğer bekleyebilirsiniz dikkate alınmalıdır. 5 günlük embriyoların karaciğeri zaten nispeten geniş bir alanda iyi tanımlanmıştır, floresan sinyal kolayca bir stereomikroskop altında tespit edilebilir nerede. Bu, hayvanları koruma yasalarına tabi olmayan test protokollerinin geliştirilmesini mümkün kılar. Vitellogenin, ve benzer şekilde floresan protein, embriyoların karaciğer15sol lob tarafından üretilmektedir. Bu nedenle, floresan sinyali incelerken veya fotoğraf çekerken embriyoların mekansal yönelimi en güçlü sinyalin tespiti için önemlidir. Bu yüzden protokolde embriyolar solda yer aldı. Temsili sonuçlardan da görülebileceği gibi, bir test örneğinin östrojenik etkisi karaciğerdeki floresan sinyalle açıkça belirtilir, böylece sonuçlar görsel olarak da değerlendirilebilir. Sonuçların sayısallaştırılması gerekiyorsa, ImageJ programı tarafından tanımlanan tümleşik yoğunluk değeri uygundur. Ancak, doğru değerlendirme için, görüntülerin deneme sırasında aynı ayarlarla alınması ve vurgulanan floresan alanların boyutunun her görüntüde aynı olması vazgeçilmezdir. Embriyoların kesin konumlandırılması ile birlikte, bunlar protokoldeki en kritik adımlardır. Embriyolarda transgenin ekspresyonunun, endojen vitellojenin üretimine benzer şekilde, bireysel duyarlılıkta büyük bir dağılım ve farklılıklar gösterdiğini belirtmek önemlidir. Bazı durumlarda, bu denemeler tasarlarken dikkate alınmalıdır sonuçlar, büyük farklılıklara neden olabilir.
Tedavi konsantrasyonları belirlenmesinde önemli bir yönü embriyoların hücreleri, ve dolayısıyla karaciğer hücreleri, vitellogenin indüksiyon bir düşüşe yol açabilir son derece toksik maddelerin yüksek konsantrasyonlarda zarar görebilir. Bu nedenle, testler LC10 1515altındaki konsantrasyonlarda yapılmalıdır.
Östrojene duyarlı balık hatlarının birbirlerine duyarlılığını karşılaştırmak zor bir iştir, çünkü şimdiye kadar açıklanan çizgiler farklı protokollere göre test edilmiştir5,14,15,16. Bu protokolde test hattı saf aktif maddeler, karışımları ve çevresel örneklerin durumlarda doz-etkisi ilişkileri tespit yeteneğine sahiptir ve elde edilen sonuçlar BLYES testleri ve HeLa hücreleri15,ile sonuçları ile iyi ilişkili ,20.
Zearalenone15de dahil olmak üzere, ajanlar test etmek için hattın embriyoların yarar kanıtlanmıştır. Bu çalışmada toksinin α- ve β-zearalenol olmak üzere iki metaboliti test edildi. Literatür verilerine göre α-ZOL β-ZOL30'dan daha toksiktir ve östrojeni de31'dir. Bu sonuçlar çalışmalarımız tarafından doğrulanmaktadır. Böylece, çizginin embriyolar üzerinde çalışmalar da diğer östrojenik maddelerin östrojenik etkilerini karşılaştırmak için uygundur.
Gıda zincirinde Mikotoksin kontaminasyonu küresel bir sorundur, bu nedenle çeşitli prosedürler hayvan yemi ve insan gıda25,,32mikotoksin düzeylerini azaltmak için geliştirilmiştir. En umut verici çözümlerden biri mikroorganizmalar veya enzimleri tarafından mikotoksin biyobozunmasıdır. Mikotoksin dekontaminasyonunu azaltmak veya ortadan kaldırmak için hasat sonrası önemli bir yöntem olabilir. Çok sayıda bakteriyel suşların ZEA bozunma yeteneği şimdiye kadar literatürde test edilmiştir, ancak, toksin yüksek bozulma kanıtlamak son araştırma bulguları nadiren metabolitleri olumsuz etkisini belirtmek33. Bu hattın embriyolar teorik organik madde içeriği15ile örneklerin östrojenik etkilerini test etmek için uygun olduğundan, ZEA biyobozunma ürünleri ve aşağılayıcı suşların niteliği test yardımcı olabilecek bir tedavi protokolü geliştirilebilir.
Bu protokol, planlanan test bitiş noktalarına (örn. maruz kalma başlangıç ve uzunluk) ve test edilecek numunelere (örn. karışımlar veya çevresel numuneler) göre birçok şekilde değiştirilebilir ve diğer test yöntemleriyle (örn. moleküler yöntemler) tamamlanabilir. Böylece, Tg(vtg1:mCherry) hattının kullanımının östrojenisite testlerinin bir modeli ve standart test yöntemleri haline geldiğini umuyoruz.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Ulusal Araştırma, Geliştirme ve İnovasyon Ofisi (NKFIH) tarafından Ulusal Araştırma, Geliştirme ve Yenilik Fonu'ndan (NKFIA) desteklenmiştir; Hibe Sözleşmesi: NVKP_16-1-2016-0003, EFOP-3.6.3-VEKOP-16-2017-00008 avrupa birliği tarafından ortaklaşa finanse edilen proje ve Yenilik ve Teknoloji Bakanlığı tarafından verilen Szent István Üniversitesi'nin NKFIH-831-10/2019 Tematik Mükemmellik Programı.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 24 well tissue culture plate | Jet Biofil | TCP011024 | |
| Calcium-chloride (CaCl2) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 16383-0-27-39 | |
| GraphPad Prism 6.01 software | GraphPad Software Inc. | ||
| ImageJ software | National Institutes of Health, USA | Public access software, downloadable from: http://imagej.nih.gov/ | |
| Leica Application Suite X calibrated software | Leica Microsystems GmbH. | We used the softver described in the experiments, but any photographic software complies with the tests | |
| Leica M205 FA stereomicroscope, Leica DFC 7000T camera | Leica Microsystems GmbH. | We used the equipments described in the experiments, but any fluorescent stereomicroscope is suitable for the tests | |
| Magnesium-sulphate (MgSO4) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 20342-0-27-38 | |
| mCherry filter | Leica Microsystems GmbH. | ||
| Mehyl-cellulose | Sigma Aldrich Ltd. | 274429 | |
| Microloader pipette tip | Eppendorf GmbH. | 5242956003 | |
| Pasteur pipette | VWR International LLC. | 612-1684 | |
| Petri-dish | Jet Biofil | TCD000060 | |
| Potassium-chloride (KCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 18050-0-01-33 | |
| Sodium-chloride (NaCl) | Reanal Laborvegyszer Ltd. | 24640-0-01-38 | |
| Tricane-methanesulfonate (MS-222) | Sigma Aldrich Ltd. | E10521 |
References
- Sumpter, J. P. Endocrine Disrupters in the Aquatic Environment : An Overview. Acta Hydrochimica et Hydrobiologica. 33 (1), 9-16 (2005).
- Routledge, E. J., Sumpter, J. P. Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen. Environmental Toxicology and Chemistry. 15 (3), 241-248 (1996).
- Sanseverino, J., et al. Use of Saccharomyces cerevisiae BLYES Expressing Bacterial Bioluminescence for Rapid, Sensitive Detection of Estrogenic Compounds. Applied and Environmental Microbiology. 71 (8), 4455-4460 (2008).
- Fetter, E., et al. Effect-directed analysis for estrogenic compounds in a fluvial sediment sample using transgenic cyp19a1b-GFP zebrafish embryos. Aquatic Toxicology. 154, 221-229 (2014).
- Gorelick, D. A., Halpern, M. E. Visualization of estrogen receptor transcriptional activation in zebrafish. Endocrinology. 152 (7), 2690-2703 (2011).
- Rider, C. V., Hartig, P. C., Cardon, M. C., Wilson, V. S. Development of a competitive binding assay system with recombinant estrogen receptors from multiple species. Toxicology Letters. 184 (2), 85-89 (2009).
- Gunnarsson, L., Kristiansson, E., Förlin, L., Nerman, O., Larsson, J. Sensitive and robust gene expression changes in fish exposed to estrogen - a microarray approach. BMC Genomics. 8 (149), 1-9 (2007).
- Vander Ven, L. T. M., et al. Vitellogenin expression in zebrafish Danio rerio evaluation by histochemistry, immunohistochemistry, and in situ mRNA hybridisation. Aquatic Toxicology. 65 (1), 1-11 (2003).
- Bakos, K., et al. Developmental toxicity and estrogenic potency of zearalenone in zebrafish (Danio rerio). Aquatic Toxicology. 136-137, 13-21 (2013).
- Strähle, U., et al. Zebrafish embryos as an alternative to animal experiments - A commentary on the definition of the onset of protected life stages in animal welfare regulations. Reproductive Toxicology. 33 (2), 128-132 (2012).
- Tsang, M. Zebrafish : A Tool for Chemical Screens. Birth Defects Research, Part C. 90 (3), 185-192 (2010).
- Hill, A. J., Teraoka, H., Heideman, W., Peterson, R. E. Zebrafish as a model vertebrate for investigating chemical toxicity. Toxicological Sciences. 86 (1), 6-19 (2005).
- Lee, C., Na, J. G., Lee, K., Park, K. Choriogenin mRNA induction in male medaka, Oryzias latipes as a biomarker of endocrine disruption. Aquatic Toxicology. 61 (3-4), 233-241 (2002).
- Chen, H., et al. Generation of a fluorescent transgenic zebrafish for detection of environmental estrogens. Aquatic Toxicology. 96 (1), 53-61 (2010).
- Bakos, K., et al. Estrogen sensitive liver transgenic zebrafish (Danio rerio) line (Tg(vtg1:mCherry)) suitable for the direct detection of estrogenicity in environmental samples. Aquatic Toxicology. 208, 157-167 (2019).
- Abdelmoneim, A., Clark, C., Mukai, M. Fluorescent reporter zebrafish line for estrogenic compound screening generated using a CRISPR/Cas9-mediated knock-in system. Toxicological Sciences. 173 (2), 336-346 (2019).
- Tong, S. K., et al. A cyp19a1b-GFP (aromatase B) transgenic zebrafish line that expresses GFP in radial glial cells. Genesis. 47 (2), 67-73 (2009).
- Segner, H. Zebrafish (Danio rerio) as a model organism for investigating endocrine disruption. Comparative Biochemistry and Physiology, Part C: Toxicology and Pharmacology. 149 (2), 187-195 (2009).
- Klinge, C. M. Estrogen receptor interaction with estrogen response elements. Nucleic Acids Res. 29 (14), 2905-2919 (2001).
- Faisal, Z., et al. Protective effects of beta-cyclodextrins vs. zearalenone-induced toxicity in HeLa cells and Tg(vtg1:mCherry) zebrafish embryos. Chemosphere. 240, 1-11 (2020).
- Kolpin, D. W., et al. Pharmaceuticals, hormones, and other organic wastewater contaminants in U.S. streams, 1999-2000: A national reconnaissance. Environmental Science and Technology. 36 (6), 1202-1211 (2002).
- Kuch, H. M., Ballschmiter, K. Determination of endocrine-disrupting phenolic compounds and estrogens in surface and drinking water by HRGC-(NCI)-MS in the picogram per liter range. Environmental Science and Technology. 35 (15), 3201-3206 (2001).
- Lundgren, M. S., Novak, P. J. Quantification of phytoestrogens in industrial waste streams. Environmental Toxicology and Chemistry. 28 (11), 2318-2323 (2009).
- Masoner, J. R., Kolpin, D. W., Furlong, E. T., Cozzarelli, I. M., Gray, J. L. Landfill leachate as a mirror of today’s disposable society: Pharmaceuticals and other contaminants of emerging concern in final leachate from landfills in the conterminous United States. Environmental Toxicology and Chemistry. 35 (4), 906-918 (2016).
- Panel on Additives and Products or Substances used in Animal Feed (FEEDA). EFSA Statement on the establishment of guidelines for the assessment of additives from the functional group ‘substances for reduction of the contamination of feed by mycotoxins' 1 EFSA. EFSA Journal. 8 (7), 1-8 (2010).
- Braunbeck, T., et al. Towards an alternative for the acute fish LC(50) test in chemical assessment: the fish embryo toxicity test goes multi-species - an update. Altex. 22 (50), 87-102 (2005).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Ober, E. A., Field, H. A., Stainier, D. Y. R. From endoderm formation to liver and pancreas development in zebrafish. Mechanisms of Development. 120 (1), 5-18 (2003).
- Tao, T., Peng, J. Liver development in zebrafish (Danio rerio). Journal of Genetics and Genomics. 36 (6), 325-334 (2009).
- Shier, W. T., Shier, A. C., Xie, W., Mirocha, C. J. Structure-activity relationships for human estrogenic activity in zearalenone mycotoxins. Toxicon. 39 (9), 1435-1438 (2001).
- Panel, E., Chain, F. Appropriateness to set a group health-based guidance value for zearalenone and its modified forms EFSA Panel on Contaminants in the Food Chain (CONTAM). EFSA Journal. 14, 4425 (2016).
- Binder, E. M. Managing the risk of mycotoxins in modern feed production. Animal Feed Science and Technology. 133 (1-2), 149-166 (2007).
- Risa, A., Krifaton, C., Kukolya, J., Kriszt, B., Cserháti, M., Táncsics, A. Aflatoxin B1 and Zearalenone-Detoxifying Profile of Rhodococcus Type Strains. Current Microbiology. 75 (7), 907-917 (2018).
