Neutraal SO2 clusters van lage kinetische energie (< 0,8 eV/bestanddeel) worden gebruikt om complexe oppervlaktemoleculen zoals peptiden of lipiden te desorberen voor verdere analyse door middel van massaspectrometrie met behulp van een ionenvalmassaspectrometer. Er is geen speciale monstervoorbereiding vereist en real-time observatie van reacties is mogelijk.
Desorptie/ionisatie Geïnduceerd door Neutrale SO2 Clusters (DINeC) wordt gebruikt als een zeer zachte en efficiënte desorptie/ionisatietechniek voor massaspectrometrie (MS) van complexe moleculen en hun reacties op oppervlakken. DINeC is gebaseerd op een bundel van SO2 clusters die van invloed zijn op het monsteroppervlak bij lage clusterenergie. Tijdens cluster-oppervlakte-impact worden sommige oppervlaktemoleculen gedesorbeerd en geïoniseerd via oplosing in het impactcluster; als gevolg van dit opgeloste gemedieerde desorptiemechanisme is lage clusterenergie voldoende en is het desorptieproces uiterst zacht. Zowel oppervlakteadsorbaten als moleculen waaruit het oppervlak bestaat, kunnen worden geanalyseerd. Heldere en fragmentatievrije spectra uit complexe moleculen zoals peptiden en eiwitten worden verkregen. Dinec vereist geen speciale monsterbereiding, met name geen matrix hoeft te worden toegepast. De methode levert kwantitatieve informatie over de samenstelling van de monsters; moleculen aan een oppervlaktedekking van maar liefst 0,1 % van een monolayer kunnen worden gedetecteerd. Oppervlaktereacties zoals H/D-uitwisseling of thermische afbraak kunnen in real-time worden waargenomen en de kinetiek van de reacties kan worden afgeleid. Met behulp van een gepulseerde nozzle voor clusterbundelgeneratie kan DINeC efficiënt worden gecombineerd met ionenvalmassaspectrometrie. Het matrixvrije en zachte karakter van het DINeC-proces in combinatie met de MSn-mogelijkheden van de ionenval maakt een zeer gedetailleerde en ondubbelzinnige analyse mogelijk van de chemische samenstelling van complexe organische monsters en organische adsorbaten op oppervlakken.
Oppervlaktegevoelige analysetechnieken zijn vaak gebaseerd op deeltjessondes zoals laagenergetische elektronen, atomen of ionen die sterk interageren met vaste monsters. Als gevolg hiervan vertonen ze een hoge oppervlaktegevoeligheid en kan gedetailleerde informatie over de oppervlaktestructuur worden verkregen1. Chemische informatie is echter vaak beperkt. Zo kan x-ray foto-elektronenspectroscopie kwantitatieve informatie geven over de atoomsamenstelling en over de gemiddelde chemische omgeving van een bepaalde soort (bijvoorbeeld de koolstofatomen in een organisch molecuul dat op een oppervlak wordt geadsorbeerd2). Meer gedetailleerde informatie over complexe, oppervlakteadsorbedmoleculen, zoals hun gedetailleerde structuur of bindende sites, is echter moeilijk te verkrijgen met standaard oppervlakteanalysetechnieken. Anderzijds neemt de behoefte aan dergelijke informatie toe met de toenemende belangstelling voor oppervlaktefunctionalisatie door middel van organische moleculen. De uitdijende velden van on-surface synthese3 of oppervlaktefunctionalisatie door gehechtheid van biomoleculen4,5 zijn twee prominente voorbeelden. Op al deze gebieden worden fundamentele vragen over substraat-adsorbate en adsorbate-adsorbate interacties onderzocht om de systemen beter te begrijpen. Voor deze onderzoeken is een maximum aan informatie over de geadsordeerde moleculen wenselijk.
Voor een deel kan secundaire ionenmassaspectrometrie (SIMS) dergelijke informatie geven. Ten eerste is SIMS zeer oppervlaktegevoelig. Second, as the sputtered adsorbates and their fragments are detected by means of MS, information well beyond atomic composition is obtained. Afhankelijk van de aard van de chemische soort die op het oppervlak wordt geadsorbeerd, kan het worden geïdentificeerd aan de basis van de moleculaire massa en het fragmentpatroon dat in het massaspectrum wordt waargenomen6. De fragmenten veroorzaakt door de primaire ionen inderdaad kan helpen voor de identificatie van het geanalyseerde materiaal. Aan de andere kant, als primaire ionen geïnduceerde wijziging (fragmentatie, ionen-geïnduceerde reacties, mengen) van het monster te sterk is, gaat de meeste informatie over de oorspronkelijke toestand van het monster verloren. Er zijn dus grote inspanningen geleverd om de fragmentatie in SIMS te verminderen (bijvoorbeeld door geladen moleculaire clusters als primaire ionen7,8,9) te gebruiken. Fragmentatie domineert echter nog steeds SIMS-spectra van grote macromoleculen en biologische monsters10,waardoor de toepassing van SIMS op verschillende gebieden wordt beperkt.
Als alternatief hebben we aangetoond dat desorptie/ionisatie veroorzaakt door neutrale clusters (DINeC) een zachte en matrixvrije ionisatiemethode is die met succes is gebruikt voor massaspectrometrische analyse van complexe moleculen11,12,13,14,15,16,17. DINeC is gebaseerd op een bundel van moleculaire clusters die bestaan uit 103 tot 104 SO2 moleculen (Figuur 1). Wanneer de clusters invloed hebben op het monster, werken ze op verschillende manieren samen met de moleculen op en in het oppervlak: ten eerste wordt een deel van de kinetische energie van het cluster herverdeeld en activeert desorptie. Even zo belangrijk is dat het desorbingmolecuul in het cluster wordt opgelost tijdens cluster-oppervlakte-impact11,18,19 ( figuur1 en figuur 2). Met andere woorden, op basis van de hoge dipool moment van SO2, de clusters zeer efficiënt dienen als een voorbijgaande matrix voor polaire analyten. Als gevolg hiervan vindt de desorptie van de analytmoleculen plaats bij cluster-energieën zo laag als 1 eV/molecuul en lager. Het zachte karakter van het desorptieproces wordt verder ondersteund door snelle koeling van het systeem wanneer het SO2-cluster tijdens en na oppervlakte-impact11,19verbrijzelt . Als gevolg van deze verschillende aspecten verloopt cluster-geïnduceerde desorptie van complexe moleculen zoals peptiden, eiwitten, lipiden en kleurstoffen zonder enige fragmentatie van de desorbing moleculen11,15; typische massaspectra tonen de dominante piek bij de m/z-waarde van het intacte molecuul ([M+H]+ of [M-H]–, figuur 3). Afhankelijk van het aantal en de aard van functionele groepen in het molecuul, meerdere geladen kationen van het formulier [M + n· H]n+ worden waargenomen11,15,18. Voor biomoleculen vindt ionisatie meestal plaats via opname of abstractie van een proton bij respectievelijk een basis- of zure functionele groep, respectievelijk11. Als watermoleculen aanwezig zijn in het monster, kunnen SO2 moleculen uit het cluster reageren met deze watermoleculen die zwavelzuur vormen18. Deze laatste kan fungeren als een efficiënte protonbron die het ionisatieproces in geval van ionisatie via protonopname (positieve ionenmodus)13,18verder bevordert.
Figuur 1: Schematische illustratie van cluster-geïnduceerde desorptie/ionisatie en experimentele opstelling. Cluster-geïnduceerde desorptie/ionisatie wordt uitgevoerd in een hoogvacuümvat. Een straal van SO2 clusters (gele stippen) wordt geproduceerd via supersonische uitbreiding van een SO2/ Hij gasmengsel uit een gepulseerde mondstuk. Tijdens cluster-oppervlakte-impact worden oppervlaktemoleculen ontlast en geïoniseerd. Moleculaire ionen (rode/oranje stippen) worden overgebracht via een bevooroordeeld raster, een dubbele ionentrechterinlaat en octopolaire ionengidsen in de ionenval voor massaspectrometrie. Typische massaspectra tonen dominante pieken bij m/z-waarden van de intacte moleculen, hier: M1 (oranje) en M2 (rood) in positieve ionenmodus. Opblazen: Tijdens de impact van het clusteroppervlak worden de desorbedmoleculen opgelost in het impactcluster of een van de fragmenten. Verdere verbrijzeling en verdamping van SO2 moleculen leiden dan naar de kale, intacte moleculaire ion zoals gedetecteerd in de massaspectrometer. Zie ook figuur 2. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Momentopnamen van moleculaire dynamicasimulaties ter illustratie van cluster-geïnduceerde desorptie via oplosing. (A) Een SO2-cluster (300 moleculen) benadert het oppervlak met 1250 m/s loodrecht op het oppervlak waarop een dipeptide (aspartiumzuur-arginine, ASP-ARG) wordt geadsorbeerd. (B) Bij cluster-oppervlakte-impact versplintert het cluster. De adsorbeerde dipeptide interageert met de omliggende SO2 moleculen leidt tot het oplossen ervan in een van de clusterfragmenten. (C) De clusterfragmenten worden van het oppervlak afgestoten. Het geëtiketteerde fragment (blauwe cirkel) draagt het dipeptide dat in dit fragment wordt ontleed. Dit cijfer is gewijzigd van referentie 19. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatief massaspectrum en moleculair model van angiotensine II. (A) Massaspectra (bovenste paneel: positieve ionenmodus, onderste paneel: negatieve ionenmodus) zoals verkregen na cluster-geïnduceerde desorptie/ionisatie van een angiotensinII-monster. Het monster werd bereid door de desbetreffende oplossing op een Si-wafer (bedekt met het natuurlijke oxide) te laten vallen. De belangrijkste pieken worden toegewezen aan het intacte biomolecuul, [M+H]+ en [M-H]– ; er worden geen fragmentatiepatronen waargenomen. Dimers ([2M+H]+pijl) geven verder de zachte aard van het desorptieproces aan. Het positieve ionensignaal is intenser door de invloed van de SO2 clusters18. (B) Ruimtevullend model en aminozuursequentie van angiotensine II. Witte ballen wijzen op waterstofatomen; zwart: koolstof; blauw: stikstof; rood: zuurstof. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
DINeC kan worden toegepast op elke vorm van massief monster dat compatibel is met hoogvacuümomstandigheden. Er is geen speciale monstervoorbereiding nodig, met name geen matrix hoeft te worden toegepast vóór dinec-ms-metingen, in tegenstelling tot matrixondersteunde laserdesorptie/ionisatie (MALDI) massaspectrometrie en aanverwante technieken20,21. Dit maakt real-time metingen van chemische veranderingen van het monster mogelijk met verschillende experimentele omstandigheden, zoals achtergronddruk van reactieve soorten in de vacuümkamer22 of monstertemperatuur. De detectielimiet van DINeC-MS is aangetoond dat het in het femtomole-bereikligt 11. Bij toepassing op de analyse van biomoleculen die op vaste oppervlakken in het submonolayerregime worden geadsorbeerd, werd een oppervlaktedekking van 0,1% van een monolayer gedetecteerd23. In deze dekkingsregeling is de signaalintensiteit lineair afhankelijk van de oppervlaktedekking en kan DINeC-MS worden gebruikt voor kwantitatieve analyse van de oppervlaktesamenstelling23. In het geval van gemengde monsters is een kwantitatieve evaluatie van de monstersamenstelling mogelijk17,24, aangezien er geen groot effect van het chemische milieu op de ionisatiewaarschijnlijkheid wordt waargenomen (bijvoorbeeld in het geval van gemengde lipide/peptidemonsters17). Dit staat in schril contrast met SIMS, waarvoor de ionisatiewaarschijnlijkheid van een bepaalde soort doorgaans sterk wordt beïnvloed door de aanwezigheid van verschillende chemische componenten (het zogenaamde “matrixeffect”25,26).
Naast oppervlakteanalyse kan de chemische samenstelling in het ondergrondse gebied worden onderzocht door middel van diepteprofilering17. Met de huidige opstelling zijn de typische desorptiesnelheden van cluster-geïnduceerde desorptie van biomoleculen van de orde 10-3 nm/s. Een hoge diepteresolutie in het bereik van 1 tot 2 nm is waargenomen voor gemengde lipide / peptide monsters17.
Een ander toepassingsgebied is de combinatie van DINeC-MS met dunne laagchromatografie (TLC). Conventionele TLC-platen kunnen rechtstreeks worden geanalyseerd door middel van DINeC-MS. Positieafhankelijke massaspectra kunnen worden verkregen uit de TLC-platen en dus kunnen massaspecifieke chromatogrammen worden verkregen uit de TLC-platen27. Er is geen hereling van de gescheiden analyten nodig, anders dan TLC in combinatie met ESI28,29. Ook voor de DINeC-MS + TLC combinatie is geen matrix nodig, in tegenstelling tot de koppeling van TLC met MALDI28,29.
Desorptie elektrospray ionisatie (DESI) is ook een zachte desorptie/ionisatiemethode voor MS-toepassingen30,31. De meest opvallende verschillen tussen DINeC en DESI zijn: het kwantitatieve karakter van DINeC23, de verenigbaarheid met ultra-hoogvacuüm (UHV) omstandigheden, met name de mogelijkheid om monsters voorbereid en overgedragen in UHV-omstandigheden te onderzoeken zonder het vacuüm te breken23, evenals de mogelijkheid om niet-polaire moleculen efficiënt te desorberen19.
In principe kan DINeC als desorptie/ionisatiebron worden gekoppeld aan elk type massaspectrometer. De combinatie met ionenvalmassaspectrometrie heeft echter twee belangrijke voordelen: ten eerste komen de pulsbreedte en herhalingssnelheid van een typische gepulseerde clusterbundel zeer goed overeen met de discontinu accumulatietijd en de spectrale snelheid van de ionenval15,32. Ten tweede leidt de zachte aard van het DINeC-proces tot desorptie van intacte moleculen. In combinatie met de MSn-mogelijkheden van ionenvalmassaspectrometrie maakt dit een meest uitgebreide analyse van de onderzochte monstersmogelijk 15.
In veel studies die tot nu toe zijn uitgevoerd, is een hoge gevoeligheid van DINeC-MS op verschillende stoffen aangetoond. Dit maakt het inderdaad mogelijk om analyten te meten tot een hoeveelheid stof in het femtomole-regime11. Vanwege deze hoge gevoeligheid moet monsterpreparaat, met name substraatreiniging, worden uitgevoerd met zeer zuivere chemicaliën om besmetting in de DINeC massaspectra te voorkomen. Aangezien het voor veel analysetechnieken het geval is, helpt een goede achtergrondmeting van een leeg substraat pieken te scheiden van de analyt en pieken die hun oorsprong hebben in substraat/monstervoorbereiding.
Hoewel we hebben aangetoond dat de ionisatiewaarschijnlijkheid van een bepaald analytmolecuul niet sterk wordt beïnvloed door de aanwezigheid van co-adsorbaten of medebestanddelen in gemengde monsters17,24, kan de ionisatiewaarschijnlijkheid variëren van stof tot stof13. Zo is het nog belangrijker om onder schone omstandigheden te werken, omdat verontreinigingen, afhankelijk van hun ionisatiewaarschijnlijkheid, kunnen bijdragen aan het signaal dat veel sterker is dan de analyt. Voorgevormde ionen (bijvoorbeeld, zoals gevonden in het geval van veel kleurstofmoleculen), of moleculen met functionele groepen die een duidelijke neiging tot protonopname of deprotonatie (d.w.z. basen of zuren) vertonen, vertonen meestal een hoge ionisatiewaarschijnlijkheid bij DINeC-MS. Als er geen dergelijke functionele groep aanwezig is in de analyt, kan de ionisatiewaarschijnlijkheid laag zijn. De monsters kunnen vervolgens worden behandeld door ioniserende middelen zoals trifluorzuur (bijvoorbeeld door blootstelling van het monster aan de dampdruk van het ioniserende middel).
De representatieve resultaten die in figuur 4 en figuur 5 worden besproken, tonen aan dat DINeC-MS toepasbaar is voor real-time onderzoeken naar chemische reacties door middel van massaspectrometrie. Figuur 6 illustreert de submonolayergevoeligheid van de methode. Als de twee eigenschappen worden gecombineerd, chemische reacties op oppervlakken en hun producten kunnen worden gevolgd in real time23. Dit kan met name van belang zijn voor de zogenaamde “on-surface synthese” die leidt tot de assemblage van macromoleculaire structuren op oppervlakken3,33,34,35,36. In de huidige opzet is het observeren van dergelijke oppervlaktereacties mogelijk op oppervlakken met een lagere reactiviteit zoals goud23 en andere edele metalen; de experimenten zijn moeilijker uit te voeren op zeer reactieve oppervlakken zoals siliciumoppervlakken37, omdat de basisdruk in de desorptiekamer zich in het bereik van 10-7mbar bevindt. De huidige activiteiten hebben betrekking op deze beperking en er wordt een UHV-compatibel DINeC-apparaat opgebouwd. In het geval van reactieve oppervlakken moet de interactie tussen SO2 en het substraatoppervlak worden getest voorafgaand aan de metingen van oppervlakteadsorbaten en oppervlaktereacties.
Omdat de clusterbundel neutraal is, kan deze niet worden scherp. De grootte van de lichtbundel op het monster wordt dus bepaald door de geometrie van de opstelling en opening van de gebruikte skimmer; typische waarden voor de bundeldiameter op het monster is een tot enkele millimeters. Als gevolg hiervan is beeldvorming door het scannen van het monster alleen mogelijk met een zeer lage resolutie. Aan de andere kant, gegeven door de hoge ionisatie waarschijnlijkheid13, DINeC maakt efficiënt gebruik van de desorbed moleculen. Zo lijkt een combinatie van DINeC-MS en een ion-imaging detector38 zeer aantrekkelijk.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs erkennen financiële steun van het Helmholtz International Center for FAIR (HICforFAIR) en de Helmholtz Graduate School for Hadron and Ion Research (P.S.). De auteurs danken Prof. Rauschenbach (Universiteit van Oxford) en zijn team voor een vruchtbare samenwerking op het gebied van gecombineerde ES-IBD/DINeC experimenten.
Acetone rotisolv HPLC | Roth | 7328.2 | HPLC Gradient Grade |
Copper tape | |||
Ethanol rotisolv HPLC | Roth | p076.1 | HPLC Gradient Grade |
Helium | Praxair | 4800086706 | Purity 99.9999% |
Nitrogen | Praxair | 40728408 | Purity 99.5 – 100% |
Silicon Wafers | Active Business Company GmbH | G60007 | |
Sulfur dioxide | Air Liquide | P1734S10R0A001 | Purity 99.98% |
Water rotisolv LC-MS | Roth | HN43.1 | Ultra LC-MS |