Nøytral SO2 klynger av lav kinetisk energi (< 0,8 eV / bestanddeler) brukes til å desorb komplekse overflatemolekyler som peptider eller lipider for videre analyse ved hjelp av en ionfelle massespektrometer. Ingen spesiell prøveforberedelse er nødvendig, og sanntidsobservasjon av reaksjoner er mulig.
Desorpsjon/ionisering indusert av nøytralso2 klynger (DINeC) er ansatt som en veldig myk og effektiv desorpsjons-/ioniseringsteknikk for massespektrometri (MS) av komplekse molekyler og deres reaksjoner på overflater. DINeC er basert på en stråle av SO 2-klynger som påvirker prøveoverflaten ved lav klyngeenergi. Under klyngeoverflatepåvirkning blir noen av overflatemolekylene desorbed og ionisert via oppløsning i den påvirkende klyngen; som et resultat av denne oppløsende desorpsjonsmekanismen, er lav klyngeenergi tilstrekkelig og desorpsjonsprosessen er ekstremt myk. Både overflateadsorbates og molekyler som overflaten består av, kan analyseres. Klar og fragmenteringsfri spektras fra komplekse molekyler som peptider og proteiner oppnås. DINeC krever ingen spesiell prøveforberedelse, spesielt ingen matrise må påføres. Metoden gir kvantitativ informasjon om sammensetningen av prøvene; molekyler med overflatedekning så lavt som 0,1 % av en monolayer kan oppdages. Overflatereaksjoner som H/D-utveksling eller termisk nedbrytning kan observeres i sanntid, og kinetikken til reaksjonene kan utledes. Ved hjelp av en pulserende dyse for klyngestrålegenerering, kan DINeC effektivt kombineres med ionfellemassespektrometri. Den matrisefrie og myke karakteren av DINeC-prosessen i kombinasjon med MSn-egenskapene til ionefellen gir svært detaljert og entydig analyse av den kjemiske sammensetningen av komplekse organiske prøver og organiske adsorbates på overflater.
Overflatesensitive analyseteknikker er ofte basert på partikkelsonder som lavenergielektroner, atomer eller ioner som sterkt samhandler med solide prøver. Som en konsekvens viser de høy overflatefølsomhet og detaljert informasjon om overflatestruktur kan fås1. Kjemisk informasjon er imidlertid ofte begrenset. Som et eksempel kan røntgenfotoelektronspektroskopi gi kvantitativ informasjon om atomsammensetningen og på gjennomsnittlig kjemisk miljø av en gitt art (f.eks. karbonatomer i et organisk molekyl adsorbed på en overflate2). Mer detaljert informasjon om komplekse, overflateadsorbeinte molekyler, for eksempel deres detaljerte struktur eller bindingssteder, er imidlertid vanskelig å få tak i med standard overflateanalyseteknikker. På den annen side vokser behovet for slik informasjon med den økende interessen for overflatefunksjonalisering ved hjelp av organiske molekyler. De ekspanderende feltene av overflatesyntese3 eller overflatefunksjonalisering ved vedlegg av biomolekyler4,5 er to fremtredende eksempler. I alle disse feltene undersøkes grunnleggende spørsmål om interaksjoner mellom underlag og adsorbat-adsorbateannonser for å bedre forstå systemene. For disse undersøkelsene er maksimalt informasjon om adsorbedmolekylene ønskelig.
Delvis kan sekundær ion massespektrometri (SIMS) gi slik informasjon. Simmene er først svært følsomme. For det andre, som sputtered adsorbates og deres fragmenter oppdages ved hjelp av MS, informasjon langt utover atomsammensetning er oppnådd. Avhengig av arten av de kjemiske artene adsorbed på overflaten, kan det identifiseres ved sin molekylære masse og fragment mønster observert i massespekteret6. Fragmentene indusert av de primære ionene kan faktisk bidra til identifisering av det analyserte materialet. På den annen side, hvis primær-ion indusert modifikasjon (fragmentering, ion-induserte reaksjoner, blanding) av prøven er for sterk, er de fleste opplysninger om den opprinnelige tilstanden til prøven tapt. Dermed har det blitt gjort store anstrengelser for å redusere fragmentering i SIMS (f.eks. ved hjelp av ladede molekylære klynger som primære ioner7,8,9). Fragmentering dominerer imidlertid fortsatt SIMS-spektra med store makromolekyler og biologiske prøver10,noe som begrenser anvendelsen av SIMS i ulike felt.
Som et alternativ har vi vist desorpsjon / ionisering indusert av nøytrale klynger (DINeC) for å være en myk og matrisefri ioniseringsmetode som har blitt brukt for massespektrometrisk analyse av komplekse molekyler11,12,13,14,15,16,17. DINeC er basert på en stråle av molekylære klynger som består av 103 til 104 SO2 molekyler (Figur 1). Når klyngene påvirker prøven, samhandler de på ulike måter med molekylene på og i overflaten: for det første distribueres en del av klyngens kinetiske energi og aktiverer desorpsjon. Tilsvarende viktig oppløses desorbingmolekylet i klyngen under klyngeoverflateeffekt11,18,19 ( figur1 og figur 2). Med andre ord, basert på det høye dipoleøyeblikket til SO2,fungerer klyngene svært effektivt som en forbigående matrise for polare analytter. Som et resultat foregår desorpsjon av analytemolekylene ved klyngeenergier så lavt som 1 eV/molekyl og under. Den myke naturen til desorpsjonsprosessen støttes ytterligere av rask kjøling av systemet når SO2-klyngen knuser under og etter overflatestøt11,19. Som en konsekvens av disse ulike aspektene fortsetter klyngeindusert desorpsjon av komplekse molekyler som peptider, proteiner, lipider og fargestoffer uten fragmentering av desorbingmolekylene11,15; typisk massespektra viser den dominerende toppen på m/z-verdien av det intakte molekylet ([M+H]+ eller [M-H]–, Figur 3). Avhengig av antall og art av funksjonelle grupper i molekylet, flere ladede kationer av skjemaet [M + n· H]n+ observeres11,15,18. For biomolekyler foregår ionisering vanligvis via opptak eller abstraksjon av et proton i en grunnleggende eller sur funksjonell gruppe, henholdsvis11. Hvis vannmolekyler er tilstede i prøven, kan SO2 molekyler fra klyngen reagere med disse vannmolekylene som danner svovelsyre18. Sistnevnte kan fungere som en effektiv protonkilde som ytterligere fremmer ioniseringsprosessen i tilfelle ionisering via protonopptak (positiv ionmodus)13,18.
Figur 1: Skjematisk illustrasjon av klyngeindusert desorpsjon/ionisering og eksperimentelt oppsett. Cluster-indusert desorpsjon/ionisering utføres i et høyvakuumfartøy. En stråle av SO2 klynger (gule prikker) er produsert via supersonisk utvidelse av en SO2/ He gassblanding fra en pulserende dyse. Under klyngeoverflatepåvirkning blir overflatemolekyler desorbed og ionisert. Molekylære ioner (røde/oransje prikker) overføres via et partisk rutenett, en dobbel iontraktinnløp og octopolarionguider inn i ionefellen for massespektrometri. Typisk evidens viser dominerende topper på m/z-verdiene til de intakte molekylene, her: M1 (oransje) og M2 (rød) i positiv ionmodus. Blås opp: Under klyngeoverflatepåvirkning oppløses de desorbedmolekylene i den påvirkende klyngen eller et av fragmentene. Ytterligere knusende og fordampning av SO2 molekyler fører deretter til den nakne, intakte molekylære ionen som det oppdages i massespektrometeret. Se også Figur 2. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Øyeblikksbilder av molekylære dynamikksimuleringer som illustrerer klyngeindusert desorpsjon via oppløsning. (A) En SO2-klynge (300 molekyler) nærmer seg overflaten med 1250 m/s vinkelrett på overflaten der en dipeptid (asparaginsyre-arginin, ASP-ARG) adsorberes. (B) Under klyngeoverflatepåvirkning knuser klyngen. Adsorbed dipeptid samhandler med de omkringliggende SO2 molekyler som fører til oppløsning i en av klyngefragmenter. (C) Klyngefragmentene er frastøtt fra overflaten. Det merkede fragmentet (blå sirkel) bærer dipeptid som er desorbed i dette fragmentet. Dette tallet er endret fra referanse 19. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Representativt massespektrum og molekylær modell av angiotensin II. (A) Massespektra (øverste panel: positiv ionmodus, bunnpanel: negativ ion-modus) som oppnådd etter klyngeindusert desorpsjon/ionisering fra en angiotensin II-prøve. Prøven ble utarbeidet ved å slippe-støping den respektive løsningen på en Si wafer (dekket av sin naturlige oksid). De viktigste toppene er tildelt intakt biomolekyl, [M + H]+ og [M-H]–; ingen fragmenteringsmønstre observeres. Dimers ([2M+H]+, pil) indikerer videre den myke naturen til desorpsjonsprosessen. Det positive ionsignalet er mer intenst på grunn av påvirkning av SO 2-klyngene18. (B) Romfyllingsmodell og aminosyresekvens av angiotensin II. Hvite baller indikerer hydrogenatomer; svart: karbon; blå: nitrogen; rød: oksygen. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
DINeC kan brukes på alle typer solid prøve som er kompatibel med høyvakuumforhold. Ingen spesiell prøveforberedelse er nødvendig, spesielt ingen matrise må påføres før DINeC-MS målinger, i motsetning til matriseassistert laser desorpsjon / ionisering (MALDI) massespektrometri og relaterte teknikker20,21. Dette muliggjør sanntidsmålinger av kjemiske endringer i prøven med varierende eksperimentelle forhold som bakgrunnstrykk av reaktive arter i vakuumkammeret22 eller prøvetemperatur. Deteksjonsgrensen for DINeC-MS har vist seg å være i femtomolområdet11. Når det brukes på analyse av biomolekyler adsorbed på faste overflater i submonolayer regimet, en overflatedekning så lavt som 0,1% av en monolayer ble oppdaget23. I dette dekningsregimet avhenger signalintensiteten lineært på overflatedekning, og DINeC-MS kan brukes til kvantitativ analyse av overflatesammensetningen23. Ved blandede prøver er det mulig med en kvantitativ evaluering av prøvesammensetningen17,24,da det ikke observeres noen stor effekt av det kjemiske miljøet på ioniseringssannsynligheten (f.eks. i tilfelle av blandede lipid-/peptidprøver17). Dette står i klar kontrast til SIMMene, hvor ioniseringssannsynligheten for en gitt art vanligvis er sterkt påvirket av tilstedeværelsen av forskjellige kjemiske komponenter (den såkalte “matriseeffekten”25,26).
I tillegg til overflateanalyse kan kjemisk sammensetning i undergrunnsområdet undersøkes ved hjelp av dybdeprofilering17. Med dagens oppsett er typiske desorpsjonsrater av klyngeindusert desorpsjon av biomolekyler av rekkefølgen 10-3 nm/s. En høy dybdeoppløsning i området 1 til 2 nm er observert for blandede lipid-/peptidprøver17.
Et ytterligere bruksfelt er kombinasjonen av DINeC-MS med tynt lagkromatografi (TLC). Konvensjonelle TLC plater kan analyseres direkte ved hjelp av DINeC-MS. Posisjonsavhengig massespektra kan kjøpes fra TLC plater og dermed massespesifikke kromatorammer kan fås fra TLC plater27. Ingen re-elution av de separerte analytene er nødvendig, forskjellig fra TLC i kombinasjon med ESI28,29. Ingen matrise er nødvendig for DINeC-MS + TLC kombinasjonen heller, i motsetning til koblingen av TLC med MALDI28,29.
Desorpsjon elektrospray ionisering (DESI) er også en myk desorpsjons-/ioniseringsmetode for MS-applikasjoner30,31. De mest slående forskjellene mellom DINeC og DESI er: den kvantitative karakteren av DINeC23, kompatibiliteten med ultra-høyvakuumforhold (UHV), spesielt muligheten til å undersøke prøver forberedt og overført i UHV-forhold uten å brytevakuumet 23,samt muligheten til å effektivt desorb ikke-polare molekyler19.
I prinsippet kan DINeC som desorpsjons-/ioniseringskilde kobles til alle typer massespektrometer. Imidlertid har kombinasjonen med ionfellemassespektrometri to hovedfordeler: for det første tilsvarer pulsbredden og repetisjonshastigheten til en typisk pulserende klyngebjelke veldig godt til den usammenhengende akkumuleringstiden, samt spektralhastigheten til ionfellen15,32. For det andre fører dinecs myke natur til desorpsjon av intakte molekyler. I kombinasjon med MSn-egenskapene til ionfellemassespektrometri, gir dette en mest omfattende analyse av de undersøkte prøvene15.
I mange studier utført så langt, har en høy følsomhet av DINeC-MS på ulike stoffer blitt vist. Faktisk tillater dette målinger av analytter ned til en mengde substans i femtomolregimet11. På grunn av denne høye følsomheten må prøveforberedelse, spesielt substratrengjøring, utføres med svært rene kjemikalier for å unngå forurensning i DINeC-massespektrasen. Som det er tilfelle for mange analyseteknikker, bidrar en riktig bakgrunnsmåling fra et tomt substrat til å skille topper fra analyten og toppene som har sin opprinnelse i substrat / prøveforberedelse.
Selv om vi har vist at ioniseringssannsynligheten for et gitt analytemolekyl ikke er sterkt påvirket av tilstedeværelsen av co-adsorbates eller co-bestanddeler i blandede prøver17,24, kan ioniseringssannsynligheten variere fra substans til substans13. Dermed er det enda viktigere å arbeide under rene forhold som forurensninger, avhengig av deres ioniseringssannsynlighet, kan bidra til signalet mye sterkere enn analyten. Forhåndsformede ioner (f.eks. som finnes i tilfelle av mange syemolekyler), eller molekyler med funksjonelle grupper som viser en klar tendens til protonopptak eller deprotonasjon (dvs. baser eller syrer), viser vanligvis høy ioniseringssannsynlighet i DINeC-MS. Hvis ingen slik funksjonell gruppe er til stede i analyten, kan ioniseringssannsynligheten være lav. Prøvene kan deretter behandles ved å ionisere midler som trifluorsyre (f.eks. ved eksponering av prøven for damptrykket til ioniserende middel).
De representative resultatene som diskuteres i figur 4 og figur 5 viser anvendelsen av DINeC-MS for sanntidsundersøkelser av kjemiske reaksjoner ved hjelp av massespektrometri. Figur 6 illustrerer metodens submonolayer-følsomhet. Hvis de to egenskapene kombineres, kan kjemiske reaksjoner på overflater og deres produkter følges i sanntid23. Dette kan være spesielt av interesse for såkalt “on-surface syntese” som fører til montering av makromolekylære strukturer på overflater3,33,34,35,36. I dagens oppsett er observasjonen av slike overflatereaksjoner mulig på overflater med lavere reaktivitet som gull23 og andre edle metaller; eksperimentene er vanskeligere å utføres på svært reaktive overflater som silisiumflater37,da grunntrykket i desorpsjonskammeret er i 10-7-mbar-området. Nåværende aktiviteter løser denne begrensningen, og et UHV-kompatibelt DINeC-apparat bygges opp. Når det gjelder reaktive overflater, må samspillet mellom SO2 og substratoverflaten testes før målinger av overflateadsorbates og overflatereaksjoner.
Siden klyngestrålen er nøytral, kan den ikke fokuseres. Strålestørrelse på prøven er dermed gitt av geometrien til oppsettet og åpningen av skimmeren i bruk; typiske verdier for strålediameteren på prøven er en til flere millimeter. Som et resultat er bildebehandling ved å skanne prøven bare mulig med svært lav oppløsning. På den annen side, gitt av den høye ioniseringssannsynligheten13,bruker DINeC effektivt dedesorbedmolekylene. Dermed ser en kombinasjon av DINeC-MS og en ion-bildedetektor38 ut til å være svært attraktiv.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne anerkjenner økonomisk støtte fra Helmholtz International Center for FAIR (HICforFAIR) og Helmholtz Graduate School for Hadron and Ion Research (PS). Forfatterne takker prof. Rauschenbach (University of Oxford) og hans team for fruktbart samarbeid om kombinerte ES-IBD / DINeC eksperimenter.
Acetone rotisolv HPLC | Roth | 7328.2 | HPLC Gradient Grade |
Copper tape | |||
Ethanol rotisolv HPLC | Roth | p076.1 | HPLC Gradient Grade |
Helium | Praxair | 4800086706 | Purity 99.9999% |
Nitrogen | Praxair | 40728408 | Purity 99.5 – 100% |
Silicon Wafers | Active Business Company GmbH | G60007 | |
Sulfur dioxide | Air Liquide | P1734S10R0A001 | Purity 99.98% |
Water rotisolv LC-MS | Roth | HN43.1 | Ultra LC-MS |