Denne protokol beskriver de skridt, der er taget for at fremkalde KRAS lungetumorer i mus samt kvantificering af dannede tumorer ved ultralydsscanning. Små tumorer visualiseres i tidlige tidspunkter som B-linjer. På senere tidspunkter, relative tumor volumen målinger opnås ved måleværktøjet i ultralyd software.
Med ~ 1,6 millioner ofre om året, lungekræft bidrager enormt til den verdensomspændende byrde af kræft. Lungekræft er til dels drevet af genetiske ændringer i onkogener som KRAS oncogene, som udgør ~ 25% af lungekræft tilfælde. Vanskeligheden ved terapeutisk målretning KRAS-drevet lungekræft skyldes til dels at have dårlige modeller, der kan efterligne udviklingen af sygdommen i laboratoriet. Vi beskriver en metode, der tillader relativ kvantificering af primære KRAS lungetumorer i en Cre-inducible LSL-KRAS G12D musemodel via ultralydsscanning. Denne metode er afhængig af lysstyrke (B)-mode erhvervelse af lunge parenkym. Tumorer, der oprindeligt er dannet i denne model er visualiseret som B-linjer og kan kvantificeres ved at tælle antallet af B-linjer til stede i de erhvervede billeder. Disse ville repræsentere den relative tumor nummer dannet på overfladen af musen lunge. Som de dannede tumorer udvikle sig med tiden, de opfattes som dybe kløfter i lungerne parenkym. Da omkredsen af den dannede tumor er veldefineret, beregning af den relative tumor volumen opnås ved at måle længden og bredden af tumoren og anvende dem i formlen anvendes til tumor kaliper målinger. Ultralydsscanning er en ikke-invasiv, hurtig og brugervenlig teknik, der ofte bruges til tumorkvantificeringer i mus. Selv om artefakter kan forekomme, når de opnår ultralydbilleder, har det vist sig, at denne billeddannelsesteknik er mere fordelagtig for tumorkvantificeringer i mus sammenlignet med andre billeddannelsesteknikker såsom computertomografi (CT) billeddannelse og bioluminescensscanning (BLI). Forskere kan undersøge nye terapeutiske mål ved hjælp af denne teknik ved at sammenligne lungetumor indledning og progression mellem forskellige grupper af mus.
Som den hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan, lungekræft forbliver ildfaste til behandlinger, primært på grund af mangel på relevante prækliniske modeller, der kan opsummere sygdommen i laboratoriet1. Omkring 25% af lungekræft tilfælde skyldes mutationer i KRAS oncogene2. KRAS-drevet lungekræft er ofte forbundet med dårlig prognose og lav respons på behandling, fremhæver betydningen af yderligere undersøgelser i denne sygdom2.
Vi optimerede en metode, der gør det muligt at evaluere lungetumorvæksten i realtid i KRAS lungekræft-induceret immun-kompetente mus. Vi bruger Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) mus, hvor KRAS G12D oncogene kan udtrykkes ved Cre lentivirale vektorer3,4. Disse vektorer er drevet af carbonic anhydrase 2, så virusinfektion en der skal finde sted specifikt i alveolær epitelceller5. Hertil kommer, at fremskynde indledningen og progression af lungetumorer, den lentivirale konstruktion udtrykker også P53 shRNA fra en U6/H1 promotor (den lentivirale konstruktion heri vil blive omtalt som Ca2Cre-shp53)6. Den biologiske relevans af denne metode ligger i det naturlige forløb af lungetumor udvikling hos mus i modsætning til xenografts af ikke-ortotopiske tumorer i mus. En hindring ved hjælp af ortotopisk metode overvåger lungetumor vækst uden at ofre musen. For at overvinde denne begrænsning optimerede vi ultralydsscanning en e-scanning for at muliggøre analyse af lungetumorprogression i todimensionel (2D) tilstand i denne musemodel. Påbegyndelse af tumorer på 7 uger efter infektion afspejles som B-linjer i ultralyd billeder, som kan tælles, men vil ikke afspejle det nøjagtige antal tumorer til stede på lungerne. B-linjer er karakteriseret ved laser-lignende lodrette hvide linjer som følge af pleural linje i lungeparenkym7,8. Store tumorer kan visualiseres efter 18 ugers infektion. Den relative mængde af disse tumorer er kvantificeret ved 2D målinger udført på ultralyd.
Denne metode er optimal for forskere, der undersøger effekten af farmakologiske lægemidler på lungetumorvækst i LSL-KRAS G12D musemodellen. Desuden kan lungetumor progression sammenlignes mellem mus med forskellige genetiske slægter, at undersøge betydningen af tilstedeværelsen eller fraværet af visse gener / proteiner på udviklingen af lungetumor volumen.
Vi demonstrerer en metode, der kan vurdere lungetumorvækst i Cre-inducible LSL-KRAS G12D musemodel ved ultralyd. Denne metode kan bruges til at vurdere effekten af farmakologiske hæmmere på lungetumor vækst. Det kan også bruges til at sammenligne lungetumor vækst mellem mus med forskellige genetiske baggrunde. Ved hjælp af denne teknik kræver ikke specialiserede beregningsmæssige færdigheder, men det er vigtigt at være systematisk i antallet af rammer, der anvendes til analyse for at give mulighed for en korre…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Dr. I. Verma for den lentivirale Ca2Cre-shp53 vektor. Arbejdet blev støttet af midler fra canadian Institutes of Health Research (CIHR MOP 137113) til AEK.
0.45 μm Acrodisc Syringe Filters | Pall Corporation | PN 4614 | |
100-mm Cell Cultre Plate | CELLSTAR | 664 160 | |
6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657 160 | |
Amicon Ultra – 15 Centrifugal Filter Units | Merck Millipore Ltd. | UFC910024 | |
BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
CA2Cre-shp53 lentiviral vector | From Dr. I Verma Laboratory | ||
DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
FBS | Multicell | 80450 | |
LSL-KRASG12D mouse | JAX Mice | 8179 | |
MX550S; Centre Transmit: 40 MHz | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
Pen/strep | Multicell | 450-201-EL | |
pMD2.G | Addgene | 12259 | |
PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |