Summary
Ce protocole décrit les étapes prises pour induire des tumeurs pulmonaires de KRAS chez les souris aussi bien que la quantification des tumeurs formées par l’imagerie d’ultrason. Les petites tumeurs sont visualisées dans les premiers temps comme des lignes B. À des moments plus tard, des mesures relatives de volume de tumeur sont réalisées par l’outil de mesure dans le logiciel d’ultrason.
Abstract
Avec 1,6 million de victimes par an, le cancer du poumon contribue énormément au fardeau mondial du cancer. Le cancer du poumon est en partie entraîné par des altérations génétiques chez les oncogènes tels que l’oncogène KRAS, qui représente environ 25 % des cas de cancer du poumon. La difficulté de cibler thérapeutiquement le cancer du poumon à base de KRAS provient en partie d’avoir de mauvais modèles qui peuvent imiter la progression de la maladie en laboratoire. Nous décrivons une méthode qui permet la quantification relative des tumeurs pulmonaires primaires de KRAS dans un modèle de souris DeL-KRAS G12D cre-inductible par l’intermédiaire de l’imagerie par ultrasons. Cette méthode repose sur l’acquisition de la luminosité (B)-mode du parenchyme pulmonaire. Les tumeurs qui sont initialement formées dans ce modèle sont visualisées comme des lignes B et peuvent être quantifiées en comptant le nombre de lignes B présentes dans les images acquises. Ceux-ci représenteraient le nombre relatif de tumeur formé sur la surface du poumon de souris. Pendant que les tumeurs formées se développent avec le temps, elles sont perçues comme fissures profondes dans le parenchyme de poumon. Puisque la circonférence de la tumeur formée est bien définie, le calcul du volume relatif de tumeur est réalisé en mesurant la longueur et la largeur de la tumeur et en les appliquant dans la formule utilisée pour des mesures de calibrage de tumeur. L’imagerie par ultrasons est une technique non invasive, rapide et conviviale qui est souvent utilisée pour les quantifications tumorales chez la souris. Bien que des artefacts puissent apparaître lors de l’obtention d’images à ultrasons, il a été démontré que cette technique d’imagerie est plus avantageuse pour les quantifications tumorales chez la souris que pour d’autres techniques d’imagerie telles que l’imagerie par tomodensitométrie (TDM) et l’imagerie par bioluminescence (BLI). Les chercheurs peuvent étudier de nouvelles cibles thérapeutiques en utilisant cette technique en comparant l’initiation et la progression des tumeurs pulmonaires entre différents groupes de souris.
Introduction
En tant que principale cause de décès liés au cancer dans le monde, le cancer du poumon reste réfractaire aux traitements, principalement en raison de l’absence de modèles précliniques pertinents qui peuvent récapituler la maladie en laboratoire1. Environ 25% des cas de cancer du poumon sont dus à des mutations dans l’oncogène KRAS2. Le cancer du poumon kraS-conduit est souvent associé au pronostic pauvre et à la basse réponse au traitement, soulignant l’importance de plus amples études dans cette maladie2.
Nous avons optimisé une méthode qui permet l’évaluation relative de la croissance de tumeur de poumon en temps réel dans les souris immunisées-compétentes cancer-induites de KRAS de CANCER- Nous utilisons des souris Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) dans lesquelles l’oncogène KRAS G12D peut être exprimé par les vecteurs lentiviraux Cre3,4. Ces vecteurs sont entraînés par l’anhydrase carbonique 2, permettant à l’infection virale de se produire spécifiquement dans les cellules épithéliales alvéolaires5. En outre, pour accélérer l’initiation et la progression des tumeurs pulmonaires, la construction lentiviral exprime également P53 shRNA d’un promoteur U6/H1 (la construction lentiviral ici sera dénommée Ca2Cre-shp53)6. La pertinence biologique de cette méthode réside dans le cours naturel du développement de tumeur pulmonaire chez les souris par opposition aux xénogreffes des tumeurs non orthotopiques chez les souris. Un obstacle utilisant la méthode orthotopic surveille la croissance de tumeur de poumon sans sacrifier la souris. Pour surmonter cette limitation, nous avons optimisé l’imagerie par ultrasons pour permettre l’analyse de la progression des tumeurs pulmonaires en mode bidimensionnel (2D) dans ce modèle de souris. Les tumeurs initiatrices à 7 semaines après l’infection sont reflétées comme B-lignes dans les images d’ultrason, qui peuvent être comptées, mais ne refléteront pas le nombre exact de tumeurs présentes sur le poumon. Les lignes B sont caractérisées par des lignes blanches verticales de laser provenant de la ligne pleurale dans le parenchyme pulmonaire7,8. Les grandes tumeurs peuvent être visualisées après 18 semaines d’infection. Le volume relatif de ces tumeurs est quantifié par des mesures 2D faites sur l’ultrason.
Cette méthode est optimale pour les chercheurs qui étudient l’effet des médicaments pharmacologiques sur la croissance des tumeurs pulmonaires dans le modèle de souris LSL-KRAS G12D. En outre, la progression de tumeur de poumon peut être comparée entre les souris avec différentes lignées génétiques, pour examiner l’importance de la présence ou de l’absence de certains gènes/protéines sur le développement du volume de tumeur de poumon.
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Protocol
Les études sur les animaux ont été réalisées conformément au Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux (CCIO) de l’Université McGill et les procédures ont été approuvées par le Comité du bien-être animal de l’Université McGill (protocole d’utilisation des animaux no 2009-5754).
1. Génération de CA2Cre-shp53 Titre lentiviral
REMARQUE: Le protocole suivant est le même que celui décrit dans Xia et al.6, avec des modifications mineures.
- Préparation du lentivirus (pour 15 cm x 10 cm plats)
- Le jour 1, plaque zona les cellules HEK293T saines (7,5 x 106 cellules par plat de 10 cm) avec 10 ml du milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), 10 % de sérum bovin fœtal (SFB) et 1 % de stylo/streptocoque. Culture dans un incubateur de CO2 à 37 oC et 5 %.
- Préparer le mélange pour la transfection calcium-phosphate (mélange pour 15 plaques). Préparer le tube A contenant 225 g (15 g/plaque) du vecteur lentiviral (Ca2Cre-shp53), 75 g (5 g/plaque) de plasmide PsPAX2 (contenant des gènes HIV-1 gag et HIV-1 pol), 75 g (5 g/plaque) de plasmique spLD (contenant du gène VSV-G) pour l’emballage, une concentration finale de 0,15 M de CaCl2 et remplir le tube de H2O distillé jusqu’à 3,75 ml. Préparer le tube B contenant 3,75 ml de 2x hePES-tamponné saline (HBS; 50 mM HEPES, pH 7.05, 280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1.5 mM Na2HPO4'2H2O, et 12 mM D-dextrose).
- Vortex tube A et l’ajouter dans le sens déroulant au tube B sous le vortex continu.
REMARQUE : Le volume total sera de 7,5 ml. - Incuber à température ambiante dans l’obscurité pendant 20 à 30 min.
- Environ 9 h après le placage des cellules, ajouter 500 l du mélange de transfection dans le milieu cellulaire (7,5 mL/15 plats : 0,5 ml par plat).
- Faire tourbillonner doucement chaque plat pour mélanger, et couver tous les plats à 37 oC, 5% CO2.
- Le jour 2, 12 à 18 h après la transfection, remplacez les médias par 10 ml de sérirum réduit sans antibiotiques (Tableau des matériaux) par plat de 10 cm. Remettre la vaisselle dans l’incubateur de CO2 à 37 oC et 5 %.
- Le jour 3, collectez les supports contenant des lentivirus exprimant Ca2Cre-shp53 et filtrez à travers des filtres de 0,45 m. Réapprovisionnez les médias avec des supports sériques réduits sans antibiotiques frais.
REMARQUE : Les supports collectés peuvent être conservés à 4 oC pendant au plus 3 jours. - Le jour 4, collectez, pour la deuxième fois, le support contenant le lentivirus et filtrez à travers un filtre de 0,45 m. Conserver à 4 oC (pour une température ne pas plus de 3 jours).
- Combinez les supernatants de virus à partir des étapes 1.1.8 et 1.1.9. Concentrez-les à travers des unités de filtre centrifuges(Tableau des matériaux)en centrifugeant à 1 372 x g pendant 30 min à 4 oC. Répétez le processus jusqu’à ce que tous les supports collectés soient passés dans les colonnes.
REMARQUE : Après chaque centrifugation, 100 à 200 l de filtrate concentré peuvent être récoltés. - Recueillir et mélanger les filtrates concentrés dans un tube glace de 15 ml. Bien mélanger les lentivirus concentrés, puis aliquot (p. ex., 100 l/tube). Conserver à -80 oC.
- Titration lentivirale
REMARQUE : Des fibroblastes embryonnaires immortalisés de souris (MEF) exprimant un allèle loxP-flanked de protéine fluorescente verte (GFP) sont employés dans ce protocole pour la quantification du titer viral. Cependant, n’importe quelle ligne de cellule avec un allele de loxP-GFP devrait être appropriée pour cette étape.- Cellules de culture exprimant un allele loxP-flanked de GFP avec DMEM, 10% FBS et 1% stylo/strep torat à 37 oC, 5% CO2.
- Plaque 2 x 105 cellules dans deux puits de 50 mm d’une plaque de 6 puits.
REMARQUE : Les cellules d’un puits seront utilisées pour l’infection lentivirale tandis que celle de l’autre sera utilisée comme contrôle négatif. - Le lendemain, réapprovisionnez les cellules avec 2 ml de DMEM, 10% FBS, et 1% stylo/streptocoque 2 h avant l’infection lentivirale.
- Ajouter 20 ll du lentivirus CA2Cre-shp53 (le volume peut varier au besoin) dans l’infection lentivirale bien.
- Après 3 jours de culture, déterminez la fréquence des cellules GFP-positives induites par la Cre par cytométrie d’écoulement, comme indiqué dans la figure 1. Laver les cellules avec de la saline tamponnée par le phosphate (PBS), détacher par trypsinisation et recueillir les cellules par centrifugation à 112 x g.
- Laver les cellules deux fois avec du PBS. Enfin, suspendez les cellules dans 100 'L de PBS. Déterminer le pourcentage de cellules positives GFP par un analyseur de cellules (Tableau des matériaux).
- Calculez le téter infectieux/fonctionnel de lentivirus en utilisant la formule suivante :
où F est la fréquence des cellules GFP-positives et calculée en soustrayant la fréquence des cellules GFP-positives après l’infection (Fi) de la fréquence des cellules GFP-positives (arrière-plan) avant l’infection (Fc) comme indiqué dans la figure 1 (F - Fi-Fc), Cn est le nombre de cellules plaquées (2 x 105), V est le volume de l’inoculum (mL), et DF est le facteur de dilution du virus.
REMARQUE : La concentration infectieuse/fonctionnelle est de 2 x 106 TU/mL.
2. Intubation intratrachéale des lentivirus chez les souris LSL-KRASG12D
REMARQUE : La méthode d’intubation intratrachéale a été utilisée comme décrit dans le protocole publié par Vandivort et autres9. Dans ce protocole, les souris LSL-KRASG12D souris dans C57BL/6 fond sont utilisés à l’âge de 6 à 8 semaines. Un tableau de procédure de travail fait maison est utilisé comme décrit dans Vandivort et al.9. Le tableau est placé devant l’expérimentateur dans un espace de travail pratique (environ 1 m2).
- Préparer un spiromètre en enlevant le piston d’une seringue de 1 ml et en chargeant 60 ll de PBS dans la seringue.
- Fixer une pointe de cathéter de 22 G dans la seringue et réserver.
- Anesthésier les souris par injection intrapéritonéale d’un cocktail de 1 l/g de poids corporel de la souris de la kétamine (50 mg/mL)/xylazine (5 mg/mL)/acepromazine (1 mg/mL). Assurer une sédation adéquate de la souris par un faible taux respiratoire (1 respiration tous les 2 s).
- Aspirez 20 l de lentivirus CA2Cre-shp53 dans un pipettor et réservez.
- Placez la souris sous sédatif sur le tableau de procédure de travail en accrochant ses incisifs supérieurs dans le fil de la planche.
REMARQUE : Le dorsum de la souris doit être plat contre la plate-forme. - Tapez la partie caudale de la cavité thoracique sur la plate-forme pour assurer l’alignement de la souris pendant la procédure.
- Ajuster un enlumineur à col de chair de poule entre 80 et 100 % d’intensité et placer la lumière à 1 2 cm de la surface de la peau.
- De derrière la plate-forme, tirer la langue hors de la cavité buccale de la souris à l’aide de forceps stériles.
- Tout en fixant la langue, insérez un dépresseur dans la cavité buccale de la souris, puis relâchez la langue.
- Placez le gooseneck sur les bronches de la tige principale pour éclairer la trachée.
REMARQUE : La trachée peut être visible par l’action de la respiration, causant la fluctuation de la lumière. - Lorsque la trachée est clairement vue, insérez le spiromètre préparé (seringue avec PBS et cathéter) dans le chemin trachéal.
- Retirez le dépresseur et observez la montée et la chute de PBS dans la seringue à chaque respiration.
REMARQUE : Il s’agit d’un indicateur indiquant que le cathéter est correctement positionné dans la trachée. - Retirez la seringue contenant du PBS tout en maintenant le cathéter à l’intérieur de la trachée comme position précédente.
- Déposez le lentivirus CA2Cre-shp53 de 20 L au centre du cathéter.
- Tout en maintenant le cathéter en place, injectez 300 L d’air dans le cathéter à l’aide d’une seringue vide pour assurer une bonne distribution du lentivirus dans les poumons.
- Maintenez le cathéter en place et réinsérez le spiromètre dans le cathéter.
REMARQUE : L’élévation et la chute de la bulle PBS assureront le succès de la procédure. - Retirer le cathéter et le ruban adhésif. Placer l’animal dans un endroit chaud et sec jusqu’à ce qu’il soit relancé.
3. Imagerie par ultrasons des tumeurs pulmonaires chez les souris
REMARQUE : L’imagerie par ultrasons a été réalisée après 7 et 18 semaines d’intubation lentivirale à l’aide du système énuméré dans le Tableau des matériaux; cependant, n’importe quel modèle peut être utilisé pour l’analyse.
- Un jour avant l’imagerie, retirez la fourrure de la poitrine de la souris intubée.
REMARQUE: La souris doit être sédative au cours de cette étape en les plaçant dans une chambre d’induction de 3% isoflurane et 2L/minute O2. - Le jour de l’imagerie, configurez l’espace de travail comme le montre la figure 2. Allumez la pompe chauffante pour le gel à ultrasons et le moniteur de température.
- Mettre en place un incubateur chaud de 33 oC pour placer les souris en post-imagerie.
- Placez le moteur tridimensionnel (3D)(figure 2F) sur le système ferroviaire intégré.
- Assurez-vous que le moteur 3D et le système de montage transducteur sont en place en toute sécurité.
- Connectez un transducteur préféré (fréquence : 40 MHz ; Figure 2E et Tableau des matériaux) pour les mesures tumorales perpendiculaires au moteur 3D.
- Démarrer une nouvelle étude sur le logiciel d’échographie.
- Sélectionnez Navigateur d’étude, puis sélectionnez Nouveau en bas de l’écran.
- Sélectionnez Nouvelle étude, une nouvelle fenêtre apparaîtra qui permet l’ajout d’un nom d’étude en plus de plus d’informations sur l’étude, c’est-à-dire la date de l’étude, le nom du chercheur, etc.
- Remplissez l’information dans le nom de la série,c.-à-d. l’iD animal, la souche, le poids, la date de naissance, etc.
- Sélectionnez Done, le programme changera pour le mode B.
- Placez une lampe chauffante dans une position pratique au-dessus de la plate-forme animale.
- Placez la souris dans la chambre d’induction (3,5% isoflurane).
REMARQUE : L’anesthésiation appropriée est confirmée par l’inconscience de la souris, et le taux respiratoire plus lent d’environ 1 souffle par 2 secondes. - Lorsque la souris est sous sédatif, changer la connexion de la machine anesthésique à diriger vers la plate-forme animale, réduire l’isoflurane à 2,5%.
- Placez la souris sur la plate-forme animale en decubitus ventral, avec sa cavité buccale dirigée vers le tube anesthésique.
- Appliquer du lubrifiant sur les yeux de la souris.
- Placez la souris dans le dorsal decubitus et collez ses mains et ses pieds fermement sur la plate-forme animale.
- Appliquer une petite couche de gel à ultrasons sur le coffre de la souris.
- Abaissez la sonde d’acquisition à l’aide du bouton de commande de hauteur pour toucher la surface de la poitrine de la souris. Placez la sonde de telle sorte que le cœur de la souris soit approximativement centré.
- Utilisez les micro-boutons pour acquérir des images de tout le coffre, des deux extrémités, dans l’orientation transversale idéalement la collecte de 500 images par souris (le nombre d’images peut varier en fonction du choix personnel).
- Une fois l’imagerie terminée, retirer le gel de la poitrine de la souris et placer la souris dans l’incubateur chaud.
4. Analyse 2D des images échographiques
- Après l’ouverture des cadres acquis sur le logiciel d’ultrason, scannez les cadres pour les tumeurs.
- Pour les petites tumeurs initiatrices, comptez périodiquement le nombre de lignes B toutes les 10 images pour toute la longueur des 500 images acquises.
Par conséquent, les lignes B sont comptées dans un total de 50 images, chaque image est séparée par 10 images. Les lignes B sont caractérisées par des lignes droites blanches longitudinales traversant entièrement l’écran. - Pour les mesures 2D des grandes tumeurs, sélectionnez l’outil linéaire et mesurez la largeur et la longueur de la tumeur présente.
- Pour calculer le volume des tumeurs, utilisez la formule suivante :
où L et W sont la longueur et la largeur de la tumeur, respectivement.
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Representative Results
Après l’obtention d’un taquet infectieux lentiviral de 2 x 106 TU/mL (figure 1), le lentivirus Ca2Cre-shp53 a été injecté par voie intratrachéque lorsque les souris LSL-KRAS G12D ont atteint un âge approprié (6 à 8 semaines)9. L’imagerie par ultrasons a été réalisée après 7 semaines d’infection lors de l’initiation des tumeurs (Figure 3B). L’imagerie a été faite à 7 semaines afin d’inclure les divers types de lésions précurseurs qui se produisent dans le modèle de souris LSL-KRASG12D, allant de l’hyperplasie à l’adénome3 comme indiqué dans la figure 4A après 8 semaines d’infection. L’imagerie plus tôt que 6 semaines n’assurera pas l’inclusion des tumeurs adénoma-formantes dans l’analyse3. Ces lésions précurseurs sont visualisées comme des lignes B dans l’échographie et peuvent être comptées à l’œil car elles peuvent être identifiées comme des faisceaux étroits de lumière blanche traversant verticalement l’écran et sont le résultat d’un reflet fort de l’onde d’ultrason (Figure 3B)10. Les lignées B représentent de petites tumeurs qui se trouvent à la surface des poumons; les tumeurs étant lancées dans les structures plus profondes du poumon telles que près de la trachée ne seront pas reflétées comme B-lignes. Le nombre de tumeurs initiées sur la surface pleurale peut être quantifié en comptant les lignes B, car elles sont trop petites pour les mesures de volume. Nous avons acquis 500 cadres couvrant la zone pulmonaire complète chez 5 souris. Les lignes B étaient comptées toutes les 10 images; ainsi, ils ont été comptés dans un total de 50 images par souris qui couvrent les 500 images complètes acquises. L’intrigue de dispersion de la figure 3D montre la somme des lignées B comptées dans chaque 10 images (100 images) pour 5 souris. Le nombre de lignes B par souris est ensuite résumé pour inclure les lignées B présentes dans la zone pulmonaire complète. La quantité moyenne de lignées B représentant des tumeurs chez les cinq souris était de 141,6 à 41,52 (figure 3E). La figure 3A montre une image échographique acquise d’un poumon de souris non infecté, à titre de comparaison.
Selon Jackson et coll.3, 16 semaines après l’intubation comprend l’adénome ainsi que l’adénocarcinome, qui sont des types de tumeur d’intérêt dans le cancer du poumon KRAS. Pour assurer l’inclusion de ces types de tumeurs lors de l’analyse des mesures de volume par ultrasons dans notre modèle, nous avons photographié les poumons des souris à 18 semaines après l’infection. Afin de quantifier le volume des grandes tumeurs par ultrasons, nous avons utilisé l’analyse 2D sur le logiciel d’ultrason. Les grandes tumeurs apparaissent comme des fissures profondes interrompant la surface pleurale comme le montre l’image de la figure 3C. Quand une tumeur est repérée, nous mesurons la longueur (L) et la largeur (W) de la tumeur, en utilisant l’outil de mesure du logiciel d’ultrason. Une fois obtenus, L et W sont appliqués dans la formule conventionnelle utilisée pour calculer le volume tumoral (étape de protocole 4.4). Nous avons analysé le volume tumoral de 10 souris, comme le montre la figure 3F, où le nombre de tumeurs formées chez chaque souris variait de 5 à 26 tumeurs. Les volumes de toutes les tumeurs formées par souris sont ensuite résumés pour représenter le volume tumoral par souris. Pour cette analyse, nous supposons que les tumeurs formées dans les poumons des souris sont de forme épileptique, donc la largeur de la tumeur est considérée comme perpendiculaire au plan d’imagerie. La quantification relative du volume peut être effectuée lorsque la taille linéaire des tumeurs atteint 0,3 mm (longueur ou largeur). Après avoir analysé le parenchyme pulmonaire de 10 souris, le volume tumoral moyen obtenu était de 31,8 à 6,61 mm3 (figure 3G). L’analyse de coloration de l’hématoxylin et de l’éosine (H et E) sur les sections pulmonaires a confirmé la formation de grosses tumeurs à 20 semaines après l’infection (figure 4B) et la formation confirmée de l’adénome et de l’adénocarcinome. Il convient de noter qu’à mesure que la croissance tumorale progresse, différentes tumeurs pourraient fusionner pour former de grandes tumeurs, comme le montre la figure 4B. Bien que le logiciel d’ultrason permet l’analyse 3D des tumeurs, ce type d’analyse s’est avéré difficile dans notre modèle, principalement en raison du mouvement dynamique élevé des tumeurs primaires formées qui est compatible avec le glissement de poumon (mouvement de la ligne pleurale avec la respiration) aussi bien que les battements cardiaques11. Nous avons raisonné que l’analyse 2D fournirait la cohérence dans les mesures relatives de volume de tumeur, particulièrement en comparant la progression de tumeur de poumon entre différents groupes de souris.
Figure 1 : Analyse cytométrie des flux des MEF avec un Allele GFP LoxP. Images cytométrie séquentiels représentatives montrant la fréquence des FPM positifs qui ne sont pas infectés (Fc) (A) et infectés (Fi) avec le lentivirus Ca2Cre-shp53 (B). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Espace de travail du système ferroviaire intégré d’imagerie par ultrasons. (A) Micro-knob x-axe. (B) Micro-knob à axe Y. (C) Plate-forme animale. (D) Bouton de commande de hauteur de la tête-probe de balayage. (E) Transducteur. (F) moteur 3D. (G) Lampe chauffante. (H) Tube d’anesthésique. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Images à ultrasons représentatives des poumons de souris avant et après l’induction de la tumeur pulmonaire. (A) Image d’une section pulmonaire de souris non infectée. Les flèches rouges pointent vers les côtes (R) et la surface pleurale (PS) du poumon. (B) Image d’un poumon de souris 7 semaines après l’induction de tumeur par intubation intratrachéale du lentivirus. Les flèches indiquent des lignes B reflétant de petites tumeurs sur la surface pulmonaire. (C) Image d’une section de poumon de souris 18 semaines après induction de tumeur. Les lignes bleues indiquent des mesures de la longueur (L : mm) et de la largeur (W : mm) de la tumeur montrée. (D) Scatter plot showing B-line quantification in 10 images spanning 500 frames (chaque image est séparée par 10 images). (E) Quantification du nombre relatif de tumeur dans les poumons à 7 semaines après l’induction. (F) Scatter parcelle montrant le volume relatif des différentes tumeurs formées dans les poumons de 10 souris à 18 semaines après l’infection. (G) Quantification du volume de tumeur pulmonaire chez la souris (n - 10). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Coloration représentative des sections pulmonaires LSL-KRAS G12D. (A) Section pulmonaire à 8 semaines après l’infection à un grossissement de 500 m. Les flèches pointent vers des lésions précurseurs formées à ce moment-là, qui sont reflétées comme des lignes B dans l’ultrason. Les flèches noires pointent vers des lésions amplifiées à 60 m. (B) Section pulmonaire à 20 semaines après l’infection à un grossissement de 2 mm. Les pointes de flèche de la même couleur montrent différentes tumeurs qui ont fusionné ensemble. Les flèches montrent des tumeurs agrandies à 60 m. S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Nous démontrons une méthode qui peut évaluer la croissance de tumeur de poumon dans le modèle de souris de LSL-KRAS G12D de Cre-inductible par ultrason. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer l’effet des inhibiteurs pharmacologiques sur la croissance des tumeurs pulmonaires. Il peut également être utilisé pour comparer la croissance des tumeurs pulmonaires entre les souris de différents milieux génétiques. L’utilisation de cette technique ne nécessite pas de compétences informatiques spécialisées, cependant, il est important d’être systématique dans le nombre d’images utilisées pour l’analyse pour permettre une comparaison appropriée si la méthode est utilisée pour comparer différents groupes de souris.
L’intubation intratrachéale de 2 x 106 TU/mL Ca2Cre-shp53 chez les souris LSL-KRAS G12D a conduit à la formation de lésions précurseurs après 7 semaines d’infection. Celles-ci apparaissent sous forme de lignes blanches longitudinales sur les images sonographiques et s’appellent lignes B (Figure 3B)12. Le nombre moyen de lignes B par souris était de 141,6 à 41,52(figure 3E). Nous avons choisi de visualiser les tumeurs initiatrices à 7 semaines après l’infection puisque ce point temporel inclurait divers types de lésions de précurseur ; hyperplasie adénomause atypique, hyperplasie épithéliale et adénome3. La formation de lésions précurseurs sur le poumon a été vérifiée par la coloration de H et E après 8 semaines d’infection lentivirale (figure 4A). Après 18 semaines d’intubation virale, les tumeurs sont assez grandes pour permettre des mesures de volume 2D dans le logiciel d’ultrason (Figure 3C). L’analyse des images échographiques a été faite au point de 18 semaines afin d’inclure la quantification de l’adénome bien développé et de l’adénocarcinome3. La formation de ces types de tumeurs a été confirmée à 20 semaines après l’infection par l’analyse de coloration de H et E (figure 4B). Les mesures de volume 3D sont également possibles par le logiciel d’ultrason mais exigent le niveau élevé d’expertise. Le titre décrit dans ce protocole est optimal pour la formation des tumeurs de poumon qui peuvent être correctement visualisées et quantifiées en 2D.
D’autres techniques d’imagerie peuvent également être utilisées pour surveiller la croissance des tumeurs pulmonaires chez les souris, telles que l’imagerie par tomodensitométrie et LE BLI13. Cependant, la formation image de CT exige livrant une dose de rayonnement à la tumeur, qui pourrait affecter la croissance de tumeur sur des essais répétés13. En outre, il nécessite l’utilisation d’agents de contraste pour des mesures précises de tumeur13. BLI est une technique d’imagerie importante qui est souvent utilisée pour quantifier la prolifération tumorale; cependant, sa principale limitation est sa dépendance aux activités métaboliques et la présence d’ATP et O213. L’avantage de l’imagerie par ultrasons réside dans le fait qu’il s’agit d’une technique non invasive, non irradiante, rapide et peu coûteuse pour l’acquisition d’images du parenchyme pulmonaire13. L’ultrason a été précédemment employé pour surveiller la croissance des tumeurs humaines orthotopic xénogreffes dans le poumon et le pancréas des souris13,14. Raes et coll. ont réussi à surveiller longitudinalement la croissance d’une seule tumeur pulmonaire humaine implantée près de la surface diaphragmique postérieure chez les souris parultrasons 13. La différence dans le modèle de souris G12D de LSL-KRAS a le développement spontané des tumeurs de poumon qui peuvent être surveillées de l’initiation à la progression et ce développement peut être comparé entre les groupes de souris. En outre, il y a de nombreuses tumeurs développées sur le poumon du modèle de souris G12D de LSL-KRAS, qui finissent par se développer, et pourraient même fusionner ensemble pour former de grandes tumeurs (figure 4B). Ceci a exhorté la nécessité d’employer une méthode qui peut surveiller l’initiation et la progression de tumeur de poumon dans ce modèle de souris. Nous avons optimisé l’analyse de mode 2D de luminosité (B) pour permettre l’évaluation quantitative des tumeurs pulmonaires développées dans ce modèle de souris.
Une limitation possible avec l’imagerie par ultrasons est la présence de faux positifs15. Ceux-ci sont vus quand une surface fortement réfléchissante est présente (diaphragme ou foie) qui interrompt la trajectoire du faisceau et pourrait créer un objet virtuel imitant un vrai objet15. De telles images pourraient être de fausses tumeurs mais peuvent être contournées après l’examen approprié ; une grosse tumeur est généralement dynamique alors qu’un objet virtuel serait statique.
L’imagerie par ultrasons pour le modèle de souris LSL-KRAS est idéale en raison de la nature non invasive de cette technique. La méthode d’analyse utilisée dans notre laboratoire pour surveiller la progression des tumeurs pulmonaires dans le modèle de souris LSL-KRAS est rapide et conviviale.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous remercions le Dr I. Verma pour le vecteur lentiviral Ca2Cre-shp53. Les travaux ont été appuyés par des fonds des Instituts de recherche en santé du Canada (BSI13) à l’AEK.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.45 μm Acrodisc Syringe Filters | Pall Corporation | PN 4614 | |
| 100-mm Cell Cultre Plate | CELLSTAR | 664 160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657 160 | |
| Amicon Ultra - 15 Centrifugal Filter Units | Merck Millipore Ltd. | UFC910024 | |
| BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
| CA2Cre-shp53 lentiviral vector | From Dr. I Verma Laboratory | ||
| DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
| FBS | Multicell | 80450 | |
| LSL-KRASG12D mouse | JAX Mice | 8179 | |
| MX550S; Centre Transmit: 40 MHz | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
| OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
| Pen/strep | Multicell | 450-201-EL | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
| VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |
References
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