Detectie van longtumorprogressie bij muizen door echografie
Summary
Dit protocol beschrijft de stappen die zijn genomen om KRAS longtumoren bij muizen te induceren, evenals de kwantificering van gevormde tumoren door echografie. Kleine tumoren worden gevisualiseerd in vroege tijdpunten als B-lijnen. Op latere tijdpunten worden relatieve tumorvolumemetingen bereikt door het meetinstrument in de echografiesoftware.
Abstract
Met ~ 1,6 miljoen slachtoffers per jaar, longkanker draagt enorm bij aan de wereldwijde last van kanker. Longkanker wordt deels gedreven door genetische veranderingen in oncogenes zoals de KRAS oncogene, die ~ 25% van de gevallen van longkanker vormt. De moeilijkheid in het therapeutisch richten op KRAS-gedreven longkanker komt deels voort uit het hebben van slechte modellen die de progressie van de ziekte in het lab kunnen nabootsen. We beschrijven een methode die de relatieve kwantificering van primaire KRAS longtumoren in een Cre-inducible LSL-KRAS G12D muis model via echografie mogelijk maakt. Deze methode is gebaseerd op de helderheid (B)-modus verwerving van de long parenchyma. Tumoren die in eerste instantie worden gevormd in dit model worden gevisualiseerd als B-lijnen en kunnen worden gekwantificeerd door het tellen van het aantal B-lijnen aanwezig in de verworven beelden. Deze zouden het relatieve tumornummer vertegenwoordigen dat op de oppervlakte van de muislong wordt gevormd. Als de gevormde tumoren ontwikkelen met de tijd, ze worden gezien als diepe gespleten haarvaten in de long parenchyma. Aangezien de omtrek van de gevormde tumor goed gedefinieerd is, wordt het berekenen van het relatieve tumorvolume bereikt door de lengte en breedte van de tumor te meten en toe te passen in de formule die wordt gebruikt voor tumorrempermetingen. Echografie is een niet-invasieve, snelle en gebruiksvriendelijke techniek die vaak wordt gebruikt voor tumorkwantificeringen bij muizen. Hoewel artefacten kunnen verschijnen bij het verkrijgen van echografiebeelden, is aangetoond dat deze beeldvormingstechniek voordeliger is voor tumorkwantificeringen bij muizen in vergelijking met andere beeldvormingstechnieken zoals computertomografie (CT) beeldvorming en bioluminescentiebeeldvorming (BLI). Onderzoekers kunnen nieuwe therapeutische doelen met behulp van deze techniek te onderzoeken door het vergelijken van longtumor initiatie en progressie tussen verschillende groepen muizen.
Introduction
Als de belangrijkste oorzaak van kankergerelateerde sterfgevallen wereldwijd, blijft longkanker vuurvast voor behandelingen, voornamelijk door gebrek aan relevante preklinische modellen die de ziekte in het lab kunnen samenvatten1. Ongeveer 25% van de gevallen van longkanker is het gevolg van mutaties in het KRAS-oncogene2. KRAS-gedreven longkanker wordt vaak geassocieerd met een slechte prognose en een lage respons op therapie, wijzend op het belang van verdere studies in deze ziekte2.
We hebben een methode geoptimaliseerd die de relatieve evaluatie van de groei van longtumoren in real time mogelijk maakt bij kras-longkanker-geïnduceerde immuun-competente muizen. We gebruiken Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) muizen waarbij het KRAS G12D oncogene kan worden uitgedrukt door Cre lentivirale vectoren3,4. Deze vectoren worden aangedreven door koolzuurhoudende anhydrase 2, waardoor de virale infectie specifiek kan plaatsvinden in alveolar epitheelcellen5. Bovendien, om de initiatie en progressie van longtumoren te versnellen, drukt de lentivirale constructie ook P53 shRNA uit van een U6/H1 promotor (de lentivirale constructie hierin zal ca2Cre-shp53 worden genoemd)6. De biologische relevantie van deze methode ligt in het natuurlijke verloop van de ontwikkeling van longtumoren bij muizen in tegenstelling tot xenografts van niet-orthotopische tumoren bij muizen. Een obstakel met behulp van de orthotopische methode is het monitoren van de groei van de longtumor zonder de muis op te offeren. Om deze beperking te overwinnen, hebben we echografie geoptimaliseerd om de analyse van de progressie van longtumoren in de tweedimensionale (2D) modus in dit muismodel mogelijk te maken. Initiëren van tumoren op 7 weken na de infectie worden weerspiegeld als B-lijnen in echografie beelden, die kunnen worden geteld, maar zal niet weerspiegelen het exacte aantal tumoren aanwezig op de long. B-lijnen worden gekenmerkt door laserachtige verticale witte lijnen die voortvloeien uit de pleuralijn in de longparenchyma7,8. Grote tumoren kunnen worden gevisualiseerd na 18 weken infectie. Het relatieve volume van deze tumoren wordt gekwantificeerd door 2D-metingen gedaan op echografie.
Deze methode is optimaal voor onderzoekers die het effect van farmacologische geneesmiddelen op de groei van longtumoren in het LSL-KRAS G12D muismodel onderzoeken. Bovendien kan de progressie van longtumoren worden vergeleken tussen muizen met verschillende genetische geslachten, om het belang van de aanwezigheid of afwezigheid van bepaalde genen/eiwitten op de ontwikkeling van het longtumorvolume te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
We demonstreren een methode die de groei van longtumoren in het Cre-inducible LSL-KRAS G12D muismodel kan beoordelen aan de hand van echografie. Deze methode kan worden gebruikt voor de evaluatie van het effect van farmacologische remmers op de groei van longtumoren. Het kan ook worden gebruikt om de groei van longtumoren tussen muizen van verschillende genetische achtergronden te vergelijken. Het gebruik van deze techniek vereist echter geen gespecialiseerde rekenvaardigheden, maar het is belangrijk om systematisch te z…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Dr. I. Verma voor de lentivirale Ca2Cre-shp53 vector. Het werk werd ondersteund door fondsen van de Canadian Institutes of Health Research (CIHR MOP 137113) aan AEK.
Materials
| 0.45 μm Acrodisc Syringe Filters | Pall Corporation | PN 4614 | |
| 100-mm Cell Cultre Plate | CELLSTAR | 664 160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657 160 | |
| Amicon Ultra – 15 Centrifugal Filter Units | Merck Millipore Ltd. | UFC910024 | |
| BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
| CA2Cre-shp53 lentiviral vector | From Dr. I Verma Laboratory | ||
| DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
| FBS | Multicell | 80450 | |
| LSL-KRASG12D mouse | JAX Mice | 8179 | |
| MX550S; Centre Transmit: 40 MHz | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
| OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
| Pen/strep | Multicell | 450-201-EL | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
| VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |
References
- Eisenstein, M. Personalized medicine: Special treatment. Nature. 513, 8 (2014).
- Karachaliou, N., et al. KRAS mutations in lung cancer. Clinical Lung Cancer. 14 (3), 205-214 (2013).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes & Development. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocol. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Chen, J., Lecuona, E., Briva, A., Welch, L. C., Sznajder, J. I. Carbonic anhydrase II and alveolar fluid reabsorption during hypercapnia. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 38 (1), 32-37 (2008).
- Xia, Y., et al. Reduced cell proliferation by IKK2 depletion in a mouse lung-cancer model. Nature Cell Biology. 17 (4), 532 (2015).
- Demi, L., et al. Determination of a potential quantitative measure of the state of the lung using lung ultrasound spectroscopy. Scientific Reports. 7, 12746 (2017).
- Mohanty, K., et al. Characterization of the Lung Parenchyma Using Ultrasound Multiple Scattering. Ultrasound in Medicine and Biology. 43, 993-1003 (2017).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Saraogi, A. Lung ultrasound: Present and future. Lung India. 32 (3), 250-257 (2015).
- Gargani, L., Volpicelli, G. How I do it: lung ultrasound. Cardiovascular Ultrasound. 12, 25 (2014).
- Soldati, G., et al. On the Physical Basis of Pulmonary Sonographic Interstitial Syndrome. Journal of Ultrasound in Medicine. 35 (10), 2975 (2016).
- Raes, F., et al. High-Resolution Ultrasound and Photoacoustic Imaging of Orthotopic Lung Cancer in Mice: New Perspectives for Onco-Pharmacology. PLoS One. 11 (4), 15 (2016).
- Lakshman, M., Needles, A. Screening and quantification of the tumor microenvironment with micro-ultrasound and photoacoustic imaging. Nature Methods. 12 (4), 372 (2015).
- Chichra, A., Makaryus, M., Chaudhri, P., Narasimhan, M. Ultrasound for the Pulmonary Consultant. Clinical Medicine Insights: Circulatory Respiratory and Pulmonary Medicine. 10, 9 (2016).
