अल्ट्रासाउंड इमेजिंग द्वारा चूहों में फेफड़ों के ट्यूमर प्रगति का पता लगाना
Summary
यह प्रोटोकॉल चूहों में KRAS फेफड़ों के ट्यूमर को प्रेरित करने के साथ-साथ अल्ट्रासाउंड इमेजिंग द्वारा गठित ट्यूमर की मात्रा को प्रेरित करने के लिए उठाए गए कदमों का वर्णन करता है। छोटे ट्यूमर बी लाइनों के रूप में शुरुआती टाइमपॉइंट में कल्पना कर रहे हैं। बाद के समय बिंदुओं पर, अल्ट्रासाउंड सॉफ्टवेयर में माप उपकरण द्वारा सापेक्ष ट्यूमर वॉल्यूम माप हासिल किए जाते हैं।
Abstract
प्रति वर्ष ~ 1.6 मिलियन पीड़ितों के साथ, फेफड़ों के कैंसर कैंसर के दुनिया भर में बोझ के लिए काफी योगदान देता है। फेफड़ों का कैंसर आंशिक रूप से इस तरह के KRAS oncogene, जो फेफड़ों के कैंसर के मामलों का ~25% का गठन के रूप में oncogenes में आनुवंशिक परिवर्तन से प्रेरित है । चिकित्सकीय रूप से KRAS संचालित फेफड़ों के कैंसर को लक्षित करने में कठिनाई आंशिक रूप से गरीब मॉडल है कि प्रयोगशाला में रोग की प्रगति की नकल कर सकते है होने से उपजा है । हम एक विधि का वर्णन करते हैं जो अल्ट्रासाउंड इमेजिंग के माध्यम से क्रे-इंडिकेबल एलएसएल-क्रास जी 12डी माउस मॉडल में प्राथमिक KRAS फेफड़ों के ट्यूमर के सापेक्ष मात्रा की अनुमति देता है। यह विधि फेफड़ों के परेंचिमा की चमक (बी)-मोड अधिग्रहण पर निर्भर करती है। इस मॉडल में शुरू में बनने वाले ट्यूमर को बी-लाइनके रूप में कल्पना की जाती है और अधिग्रहीत छवियों में मौजूद बी-लाइनों की संख्या की गणना करके निर्धारित किया जा सकता है। ये माउस फेफड़े की सतह पर गठित सापेक्ष ट्यूमर संख्या का प्रतिनिधित्व करेंगे। जैसे-जैसे समय के साथ गठित ट्यूमर विकसित होते हैं, उन्हें फेफड़ों के परेंचिमा के भीतर गहरी फांक के रूप में माना जाता है। चूंकि गठित ट्यूमर की परिधि अच्छी तरह से परिभाषित है, इसलिए ट्यूमर की लंबाई और चौड़ाई को मापने और ट्यूमर कैलिपर मापके के लिए उपयोग किए जाने वाले सूत्र में उन्हें लागू करके सापेक्ष ट्यूमर की मात्रा की गणना की जाती है। अल्ट्रासाउंड इमेजिंग एक गैर-आक्रामक, तेज और उपयोगकर्ता के अनुकूल तकनीक है जिसका उपयोग अक्सर चूहों में ट्यूमर क्वांटिफिकेशन के लिए किया जाता है। हालांकि अल्ट्रासाउंड छवियों को प्राप्त करते समय कलाकृतियों दिखाई दे सकते हैं, यह दिखाया गया है कि यह इमेजिंग तकनीक चूहों में ट्यूमर क्वांटिफिकेशन के लिए गणना टोमोग्राफी (सीटी) इमेजिंग जैसी अन्य इमेजिंग तकनीकों की तुलना में अधिक लाभप्रद है और बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग (BLI)। शोधकर्ताओं ने फेफड़ों के ट्यूमर दीक्षा और चूहों के विभिन्न समूहों के बीच प्रगति की तुलना करके इस तकनीक का उपयोग कर उपन्यास चिकित्सकीय लक्ष्यों की जांच कर सकते हैं ।
Introduction
दुनिया भर में कैंसर से संबंधित मौतों के प्रमुख कारण के रूप में, फेफड़ों के कैंसर उपचार के लिए अपवर्तक रहता है, मुख्य रूप से प्रासंगिक पूर्व नैदानिक मॉडल है कि प्रयोगशाला1में रोग संक्षिप्त कर सकते है की कमी के कारण । फेफड़ों के कैंसर के लगभग 25% मामले KRAS oncogene2में म्यूटेशन के कारण हैं । KRAS संचालित फेफड़ों के कैंसर अक्सर गरीब पूर्वानुमान और चिकित्सा के लिए कम प्रतिक्रिया के साथ जुड़ा हुआ है, इस रोग2में आगे के अध्ययन के महत्व पर प्रकाश डाला ।
हमने एक विधि को अनुकूलित किया जो KRAS फेफड़ों के कैंसर-प्रेरित प्रतिरक्षा-सक्षम चूहों में वास्तविक समय में फेफड़ों के ट्यूमर के विकास के सापेक्ष मूल्यांकन की अनुमति देता है। हम Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) चूहों का उपयोग करते हैं जिसमें KRAS G12D oncogene क्रे लेंटिवायरल वैक्टर3,4द्वारा व्यक्त किया जा सकता है । ये वैक्टर कार्बोनिक एंहाइड्रेज 2 द्वारा संचालित होते हैं, जिससे वायरल संक्रमण विशेष रूप से अल्वेलर एपिथेलियल कोशिकाओं5में हो सकता है। इसके अलावा, फेफड़ों के ट्यूमर की दीक्षा और प्रगति में तेजी लाने के लिए, लेंटिवायरल निर्माण भी एक U6/H1 प्रमोटर से P53 shRNA व्यक्त करता है (लेंटिवायरल निर्माण यहां Ca2Cre-shp53 के रूप में संदर्भित किया जाएगा)6। इस विधि की जैविक प्रासंगिकता चूहों में फेफड़ों के ट्यूमर के विकास के प्राकृतिक पाठ्यक्रम में निहित है क्योंकि चूहों में गैर-ऑर्थोटोपिक ट्यूमर के विद्वेष का विरोध किया गया है। ऑर्थोटोपिक विधि का उपयोग करने वाली एक बाधा माउस का त्याग किए बिना फेफड़ों के ट्यूमर के विकास की निगरानी कर रही है। इस सीमा को दूर करने के लिए, हमने इस माउस मॉडल में दो-आयामी (2डी) मोड में फेफड़ों के ट्यूमर की प्रगति के विश्लेषण की अनुमति देने के लिए अल्ट्रासाउंड इमेजिंग को अनुकूलित किया। 7 सप्ताह के बाद संक्रमण पर ट्यूमर शुरू अल्ट्रासाउंड छवियों में बी लाइनों के रूप में परिलक्षित होते हैं, जो गिना जा सकता है, लेकिन फेफड़ों पर मौजूद ट्यूमर की सही संख्या को प्रतिबिंबित नहीं करेगा । बी-लाइनों को फेफड़ों के परेंचिमा7,8में प्लीरल लाइन से उत्पन्न लेजर जैसी ऊर्ध्वाधर सफेद रेखाओं की विशेषता है। संक्रमण के 18 सप्ताह के बाद बड़े ट्यूमर की कल्पना की जा सकती है। इन ट्यूमर की सापेक्ष मात्रा अल्ट्रासाउंड पर किए गए 2डी माप से निर्धारित की जाती है।
यह विधि एलएसएल-KRAS G12D माउस मॉडल में फेफड़ों के ट्यूमर के विकास पर औषधीय दवाओं के प्रभाव की जांच कर रहे शोधकर्ताओं के लिए इष्टतम है। इसके अलावा, फेफड़ों के ट्यूमर प्रगति विभिन्न आनुवंशिक वंश के साथ चूहों के बीच तुलना की जा सकती है, फेफड़ों के ट्यूमर की मात्रा के विकास पर कुछ जीन/प्रोटीन की उपस्थिति या अनुपस्थिति के महत्व की जांच करने के लिए ।
Protocol
Representative Results
Discussion
हम एक विधि प्रदर्शित करते हैं जो अल्ट्रासाउंड द्वारा क्रे-इंड्यूबल एलएसएल-क्रास जी12डी माउस मॉडल में फेफड़ों के ट्यूमर के विकास का आकलन कर सकती है। इस विधि का उपयोग फेफड़ों के ट्यूमर के विकास पर औषधीय अ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम लेंटिवायरल Ca2Cre-shp53 वेक्टर के लिए डॉ आई वर्मा को धन्यवाद देते हैं । इस काम को कनाडा के स्वास्थ्य अनुसंधान संस्थान (सीएचआर एमओपी 137113) से एईके को धन द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| 0.45 μm Acrodisc Syringe Filters | Pall Corporation | PN 4614 | |
| 100-mm Cell Cultre Plate | CELLSTAR | 664 160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657 160 | |
| Amicon Ultra – 15 Centrifugal Filter Units | Merck Millipore Ltd. | UFC910024 | |
| BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
| CA2Cre-shp53 lentiviral vector | From Dr. I Verma Laboratory | ||
| DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
| FBS | Multicell | 80450 | |
| LSL-KRASG12D mouse | JAX Mice | 8179 | |
| MX550S; Centre Transmit: 40 MHz | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
| OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
| Pen/strep | Multicell | 450-201-EL | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
| VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |
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