Upptäckt av lungtumörprogression hos möss av ultraljudsavbildning
Summary
Detta protokoll beskriver de åtgärder som vidtagits för att inducera KRAS lungtumörer hos möss samt kvantifiering av bildade tumörer genom ultraljudsavbildning. Små tumörer visualiseras i tidiga timepoints som B-linjer. Vid senare tidpunkter uppnås relativa tumörvolymmätningar genom mätverktyget i ultraljudsprogrammet.
Abstract
Med ~ 1,6 miljoner offer per år, bidrar lungcancer oerhört till den globala bördan av cancer. Lungcancer drivs delvis av genetiska förändringar i onkogener som KRAS oncogene, som utgör ~ 25% av lungcancer fall. Svårigheten att terapeutiskt rikta KRAS-driven lungcancer beror delvis på att ha dåliga modeller som kan efterlikna utvecklingen av sjukdomen i labbet. Vi beskriver en metod som tillåter relativ kvantifiering av primära KRAS lungtumörer i en Cre-inducerad LSL-KRAS G12D mus modell via ultraljud imaging. Denna metod bygger på ljusstyrka (B)-mode förvärv av lungparenkymen. Tumörer som ursprungligen bildas i denna modell visualiseras som B-linjer och kan kvantifieras genom att räkna antalet B-linjer som finns i de förvärvade bilderna. Dessa skulle representera det relativa tumörnumret som bildas på ytan av muslungan. Som de bildade tumörer utvecklas med tiden, de uppfattas som djupa klyftor inom lungparenkymen. Eftersom omkretsen av den bildade tumören är väl definierad, beräkna den relativa tumörvolymen uppnås genom att mäta längden och bredden på tumören och tillämpa dem i formeln som används för tumör bromsok mätningar. Ultraljud imaging är en icke-invasiv, snabb och användarvänlig teknik som ofta används för tumör kvantifieringar hos möss. Även artefakter kan visas när du får ultraljud bilder, har det visat sig att denna bildteknik är mer fördelaktigt för tumör kvantifieringar hos möss jämfört med andra bildtekniker såsom datortomografi (CT) bildbehandling och bioluminescensavbildning (BLI). Forskare kan undersöka nya terapeutiska mål med hjälp av denna teknik genom att jämföra lungtumör initiering och progression mellan olika grupper av möss.
Introduction
Som den främsta orsaken till cancerrelaterade dödsfall över hela världen, lungcancer är fortfarande eldfasta till behandlingar, främst på grund av brist på relevanta prekliniska modeller som kan sammanfatta sjukdomen i labbet1. Omkring 25% av lungcancer fall beror på mutationer i KRAS oncogene2. KRAS-driven lungcancer är ofta förknippad med dålig prognos och låg reaktion på terapi, belyser vikten av ytterligare studier i denna sjukdom2.
Vi optimerade en metod som möjliggör relativ utvärdering av lungtumörtillväxt i realtid i KRAS lungcancer-inducerad immun-kompetentmöss. Vi använder Lox-Stop-Lox KRAS G12D (LSL-KRAS G12D) möss där KRAS G12D oncogene kan uttryckas av Cre lentivirala vektorer3,4. Dessa vektorer drivs av kolsyraanhydras 2, vilket gör att virusinfektion en exakt i alveolar epitelceller5. Dessutom, för att påskynda inledande och progression av lungtumörer, den lentivirala konstruktionen uttrycker också P53 shRNA från en U6/H1 promotor (den lentivirala konstruktionen häri kommer att kallas Ca2Cre-shp53)6. Den biologiska relevansen av denna metod ligger i den naturliga kursen av lungtumörutveckling hos möss i motsats till xenografts av icke-ortopediska tumörer hos möss. Ett hinder med hjälp av ortopediska metoden är att övervaka lungtumör tillväxt utan att offra musen. För att övervinna denna begränsning optimerade vi ultraljudsavbildning för att möjliggöra analys av lungtumörprogression i tvådimensionellt (2D) läge i denna musmodell. Initiera tumörer vid 7 veckor efter infektion återspeglas som B-linjer i ultraljud bilder, som kan räknas, men kommer inte att återspegla det exakta antalet tumörer som finns på lungan. B-linjer kännetecknas av laser-liknande vertikala vita linjer som härrör från pleura linjen i lungparenkymen7,8. Stora tumörer kan visualiseras efter 18 veckors infektion. Den relativa volymen av dessa tumörer kvantifieras av 2D-mätningar gjorda på ultraljud.
Denna metod är optimal för forskare som undersöker effekten av farmakologiska läkemedel på lungtumörtillväxt i LSL-KRAS G12D-musmodellen. Dessutom kan lungtumörprogression jämföras mellan möss med olika genetiska härstamningar, för att undersöka vikten av närvaron eller frånvaron av vissa gener/proteiner på utvecklingen av lungtumörvolym.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi visar en metod som kan bedöma lungtumörtillväxt i Cre-induceradLSL-KRAS G12D musmodell med ultraljud. Denna metod kan användas för att utvärdera effekten av farmakologiska hämmare på lungtumörtillväxt. Det kan också användas för att jämföra lungtumörtillväxt mellan möss av olika genetiska bakgrunder. Med hjälp av denna teknik kräver inte specialiserade beräkningsfärdigheter, men det är viktigt att vara systematisk i antalet ramar som används för analys för att möjliggöra en korrekt jämför…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi tackar Dr I. Verma för den lentivirala Ca2Cre-shp53 vektorn. Arbetet stöddes av medel från Canadian Institutes of Health Research (CIHR MOP 137113) till AEK.
Materials
| 0.45 μm Acrodisc Syringe Filters | Pall Corporation | PN 4614 | |
| 100-mm Cell Cultre Plate | CELLSTAR | 664 160 | |
| 6-well Cell Culture Plate | CELLSTAR | 657 160 | |
| Amicon Ultra – 15 Centrifugal Filter Units | Merck Millipore Ltd. | UFC910024 | |
| BD LSR-Fortessa | BD Biosciences | 649225B 3024 | |
| CA2Cre-shp53 lentiviral vector | From Dr. I Verma Laboratory | ||
| DMEM | Multicell | 319-005-CL | |
| FBS | Multicell | 80450 | |
| LSL-KRASG12D mouse | JAX Mice | 8179 | |
| MX550S; Centre Transmit: 40 MHz | FUJIFILM VisualSonics | 51070 | |
| OptiMEM | gibco | 11058-021 | |
| Pen/strep | Multicell | 450-201-EL | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| PsPAX2 | Addgene | 12260 | |
| VEVO-3100 | FUJIFILM VisualSonics | 51072-50 |
References
- Eisenstein, M. Personalized medicine: Special treatment. Nature. 513, 8 (2014).
- Karachaliou, N., et al. KRAS mutations in lung cancer. Clinical Lung Cancer. 14 (3), 205-214 (2013).
- Jackson, E. L., et al. Analysis of lung tumor initiation and progression using conditional expression of oncogenic K-ras. Genes & Development. 15 (24), 3243-3248 (2001).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocol. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Chen, J., Lecuona, E., Briva, A., Welch, L. C., Sznajder, J. I. Carbonic anhydrase II and alveolar fluid reabsorption during hypercapnia. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 38 (1), 32-37 (2008).
- Xia, Y., et al. Reduced cell proliferation by IKK2 depletion in a mouse lung-cancer model. Nature Cell Biology. 17 (4), 532 (2015).
- Demi, L., et al. Determination of a potential quantitative measure of the state of the lung using lung ultrasound spectroscopy. Scientific Reports. 7, 12746 (2017).
- Mohanty, K., et al. Characterization of the Lung Parenchyma Using Ultrasound Multiple Scattering. Ultrasound in Medicine and Biology. 43, 993-1003 (2017).
- Vandivort, T. C., An, D., Parks, W. C. An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice. Journal of Visualized Experiments. (108), e53771 (2016).
- Saraogi, A. Lung ultrasound: Present and future. Lung India. 32 (3), 250-257 (2015).
- Gargani, L., Volpicelli, G. How I do it: lung ultrasound. Cardiovascular Ultrasound. 12, 25 (2014).
- Soldati, G., et al. On the Physical Basis of Pulmonary Sonographic Interstitial Syndrome. Journal of Ultrasound in Medicine. 35 (10), 2975 (2016).
- Raes, F., et al. High-Resolution Ultrasound and Photoacoustic Imaging of Orthotopic Lung Cancer in Mice: New Perspectives for Onco-Pharmacology. PLoS One. 11 (4), 15 (2016).
- Lakshman, M., Needles, A. Screening and quantification of the tumor microenvironment with micro-ultrasound and photoacoustic imaging. Nature Methods. 12 (4), 372 (2015).
- Chichra, A., Makaryus, M., Chaudhri, P., Narasimhan, M. Ultrasound for the Pulmonary Consultant. Clinical Medicine Insights: Circulatory Respiratory and Pulmonary Medicine. 10, 9 (2016).
