Vitale fluorescerende farvestoffer er essentielle værktøjer til analyser af levende celler i moderne svampe cellebiologi. Dette papir beskriver anvendelsen af etablerede og mindre kendte fluorescerende farvestoffer til sporing af plasma membran dynamik, endo-/exocytose og cellevæg morfogenesis i filamentøse svampe.
Anvendelsen af membran og cellevæg selektive fluorescerende farvestoffer til levende celle billeddannelse analyser af organelle dynamik i svampeceller startede for to årtier siden, og siden da fortsætter med at bidrage meget til vores forståelse af de filamentøse svampe Livsstil. Dette papir giver en praktisk vejledning til udnyttelse af de to membran farvestoffer FM 1-43 og FM 4-64 og de fire cellevæg pletter Calcofluor hvid M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine hurtig Scarlet 48 og Congo rød. Fokus er på deres lavdosis applikation til at konstatere artefakt-fri farvning, deres Co-Imaging egenskaber, og deres kvantitative evaluering. De præsenterede metoder gælder for alle filamentøse svampe prøver, der kan tilberedes i de beskrevne måder. De grundlæggende farvnings tilgange kan tjene som udgangspunkt for tilpasninger af arter, der kan kræve forskellige dyrkningsbetingelser. Første, biofysiske og biokemiske egenskaber gennemgås som deres forståelse er afgørende for at bruge disse farvestoffer som virkelig vitale fluorescerende pletter. For det andet, trin-for-trin protokoller præsenteres, at detaljerne i forberedelsen af forskellige svampe prøvetyper for fluorescerende Live-Cell Imaging. Endelig illustrerer eksempler på eksperimenter forskellige tilgange til: (1) identificere defekter i den spatio-temporale organisering af endokytose i genetiske mutanter, (2) relativt karakterisere delt og distinkt samlokalisering af GFP-mærkede målproteiner i endocytic pathway, (3) identificere morfogenetiske cellevæg defekter i en genetisk mutant, og (4) overvåge cellevæg Biogenese i realtid.
For tyve år siden blev den måde, hvorpå hyphal morfogenese og den underliggende molekylære cellebiologi kunne visualiseres i filamentøse svampe, revolutioneret ved anvendelse af membranen selektiv fluorescerende Fei Mao Dye FM 4-641. Senere, fordelen ved chitin-bindende farvestof Calcofluor hvid som vital fluorescerende markør for svampe cellevæg dynamik blev realiseret2. Siden da er både farvestoffer og varianter heraf blevet en iboende del af analyser af organisk dynamik i levende celle billeder i svampe og fortsætter med at give hidtil uset indsigt i den filamentøse svampe livsstil. Dette papir beskriver anvendelsen af etablerede og mindre kendte fluorescerende farvestoffer til sporing af plasma membran dynamik, endo-og exocytose og cellevæg morfogenesis i filamentøse svampe. Endocytose tracking assays tillade forskellige celle biologiske spørgsmål i forbindelse med den generelle undersøgelse af endokytose, der skal behandles3. Til dette, lokalisering, hastighed og rækkefølge af farvede rum ved FM farve tilsætning registreres ved timelapse mikroskopi og kvantitativt sammenlignet mellem de testede svampe stammer4. Cellevæg farvestoffer afgrænse den ydre grænse af cellen og tillade sporing af morfogenetiske hændelser, herunder polariseret hyphal tip vækst2, hyphal forgrening5, hyphal fusion6,7 og septum formation8. Endvidere, de letter kvantificeringen af lokaliserede cellevæg deposition og identifikation af defekter under cellevæg Biogenese9. Fordi detaljeret viden om de biokemiske og biofysiske egenskaber af enhver fluorescerende markør er en grundlæggende forudsætning for sin vellykkede in vivo ansøgning, disse egenskaber er først opsummeret for de seks farvestoffer featured i denne artikel.
Membran selektive farvestoffer
FM (Fei Mao) styryl farvestoffer er små amfifilic molekyler, der ikke kan passere igennem, men reversibelt associere med den ydre folder af lipid-lænden af biologiske membraner10. De er næsten ikke-fluorescerende i vandig opløsning, men bliver intenst fluorescerende ved plasma membran integration, genererer fremragende signal-til-støj (S/N)-nøgletal11. Disse egenskaber gør dem ideelle til visualisering af plasma membranen og intracellulær organelle dynamik, herunder sporing af endo-og exocytose12. Den grønne fluorescerende FM 1-43 og den røde fluorescerende FM 4-64 er de to mest udbredte fluorescerende membran markører til disse formål. SynaptoGreen C4 og SynaptoRed C2 er generiske molekyler fra alternative leverandører, der kan bruges synonymt i stedet for FM 1-43 og FM 4-64 hhv.
Styryl farvestoffer består af tre centrale strukturelle regioner: (1) den lipofile hale, der letter indsættelse af farvestoffet i lipid-billaget, (2) fluoroforet kernen, der bestemmer farvestoffets spektrale egenskaber og udgøres af to aromatiske ringe forbundet med en til tre dobbeltbindinger, og (3) det positivt ladede hydrofile hoved, der forhindrer fuldstændig indsættelse og gennemtrængning af farvestoffet via membranen (figur 1a).
Jo længere den lipofile hale, jo højere er farvestoffet hydrofobicitet og dermed bindende affinitet til membranen, men den nedre er dens vandopløselighed og membran de-farvning sats. Som følge heraf producerer forskellige FM-farvevarianter forskellige farvnings dynamik og mønstre. Den højere hydrofobiby af den C4-tailed FM 1-43 giver et stærkere og mere stabilt fluorescens signal ved plasma membraner og interne organeller hurtigere end den kortere C2-tailed FM 4-64, når det anvendes ved ækvimolære koncentrationer (figur 2).
Vigtigere, den konstante og høje Association/dissociation satser for begge FM-farvestoffer11 med gennemsnitlige retentionstider på 1 – 6 s pr individuelle farvestof molekyle13 reducere chancerne for lokaliseret forstyrrelse af membran funktion, for eksempel gennem ændring af membran fluiditet eller tvungen permanent interaktion af membran proteiner. Dette er formentlig den vigtigste grund til, at disse molekyler kan bruges som vitale farvestoffer. Ikke desto mindre er FM-farve koncentrationer over 50 μM giftige for svampe-og planteceller2,14, og evidens fra af-2-tobaks protoplaster indikerer, at mere end 20 μm FM-farvestof fører til plasma membran mætning14. Derfor er det tilrådeligt ikke at overskride denne grænse, især i betragtning af, at fremragende billeddannelse er opnået med så lidt som 2 – 5 μM15,16.
Især de spektral egenskaber af FM-farvestoffer varierer meget afhængigt af den særlige membran mikromiljø (anmeldt14). Generelt adskiller excitation og emissions spektre af FM-farvestoffer i rene opløsningsmidler (som normalt er angivet i produktinformationen) sig markant fra det i cellulære miljøer og kan i de fleste tilfælde ikke høres direkte ved valg af indstillinger for billedbehandling med levende celler. Excitation/emission Maxima af FM 1-43 og FM 4-64, for eksempel, bliver blå-forskudt med 37/46 nm og 43/64 nm, henholdsvis når de bindes til svampe membraner i forhold til deres opløsninger i methanol (tabel 1).
De banebrydende fundamentale for brugen af FM 4-64 og FM 1-43 til sporing af plasma membran, endo-/exocytose og organelle dynamik, herunder spitzenkörper og mitokondrier, er allerede blevet udførligt dokumenteret for en bred vifte af filamentøse svampearter tidligere2,4,17,18,19. Anbefalede billedbehandlings indstillinger for begge FM-farvestoffer, der virker i forskellige filamentøse svampearter, er afbildet i figur 1b. Tekniske begrænsninger af det tilgængelige udstyr eller særlige cellulære og eksperimentelle betingelser, såsom kulturmedium, pH eller temperatur, kan dog kræve nogle tilpasninger. Heldigvis opererer FM-farvestoffer over et bredt spektralområde, og meget gode billedbehandlings resultater opnås ved spændende FM 1-43 med 514 nm eller FM 4-64 med 488 nm. Derfor skal de optimale billedbehandlings indstillinger bestemmes individuelt for hver prøvetype og påtænkt anvendelse.
Den betydelige Stoke skift på mere end 135 nm FM 4-64 giver fremragende, samtidige Co-Imaging med fluorophores udsender grønt lys; Dette er ofte udnyttes til at evaluere intracellulære lokalisering dynamik af grønne fluorescerende protein (gfp)-mærket fusions proteiner i forhold til plasma membranen og endocytic pathway9,20.
Cellevæg-selektive farvestoffer
Calcofluor White M2R (CFW), også markedsført som fluorescerende Brightener 28, er formentlig den bedst kendte fluorescerende farvestof, der anvendes til at plette cellevæggene af bakterier, svampe, alger, højere planter og insekter. Oprindeligt brugt som optisk blegning agent i papir, tekstil og vaskemiddel industri, dens fordele for den kliniske diagnose af svampeinfektioner blev realiseret tidligt på21,22. Fordi CFW intercalates uigenkaldeligt ind i den spirende chitin kæde det forstyrrer normal chitin microfibril forsamling under cellevæg Biogenese derved generere cellevæg stress23. Dette udløser igen en cellevæg skade reparation mekanisme, der fører til lokalt forhøjet cellevæg deposition som følge af glucan og chitin syntase aktivering24,25. Dette fænomen kan forekomme med ethvert farvestof, der opererer ved stabilt binding til cellevæg polymerer, er koncentrationsafhængig og er mest mærkbar på hyphal tips, der repræsenterer den mest produktive voksende og dermed mest følsomme dele af mycelium (figur 3). En omfattende oversigt over de molekylære maskiner, der reagerer på cellevæg skader er for nylig blevet givet26.
Overdoseret farvestof i kombination med fototoksicitet kan føre til hurtig cellelyse af hyphal rum (film 1). Ikke desto mindre, øget følsomhed over for farvestoffer koncentrationer, der er “Vital” i den vilde type kan udnyttes til at identificere defekter i cellevæg biosyntese af gentab-af-funktion mutanter9. For CFW og Congo Red (CR), en anden tekstil farvestof også kendt som Direct Red 28 og ansat som α-og β-chitin-specifik cellevægbejdsen for svampe og insekter27,28, tærskelkoncentrationer, der stærkt inducerer chitin synthaser er blevet bestemt med > 60 μm CFW og > 70 μM CR, mens koncentrationer <15 μM af begge farvestof ikke ændre eller hæmme svampevækst29,30,31. Hickey et al. placerede denne tærskelkoncentration for CFW ved 25 μM2. Derfor er det tilrådeligt at bruge farvestoffer koncentrationer ≤ 5 μM at udelukke stress-relaterede artefakter og sikre at bruge disse molekyler som virkelig “vitale fluorescerende farvestoffer”2,32. Dette gælder også for Solophenyl Flavine 7GFE 500 (SPF) og Pontamine fast Scarlet 4B (PFS), synonymt med direkte gul 86 og direkte rød 23, henholdsvis to andre nyttige cellevæg farvestoffer, hvis ansøgning om svampe er blevet rapporteret for første gang mere end et årti siden33. Men på trods af deres bemærkelsesværdige spektral egenskaber34,35, har brugen af begge farvestoffer siden da været meget begrænset36,37. Som tidligere vist for 1,5 μM CFW2, 2 μm SPF er tilstrækkelige til at løse cellevæg dynamik under indfødte forhold med meget høj tidsmæssig opløsning (film 2). De samme resultater kan opnås med 2 μM CR eller PFS.
Sammen, disse fire farvestoffer, CFW, SPF, PFS og CR, omfatter et sæt af cellevæg-selektive fluorescerende markører, der dækker næsten den komplette synlige emission lys spektrum (400 – 700 nm) udnyttes på moderne fluorescerende mikroskoper (figur 4). Den betydelige stigning i fluorescens intensitet ved binding til cellevæg polymerer er iboende til alle fire og genererer fremragende S/N-nøgletal. Dette igen tillader at holde farvestof koncentrationer og excitation lysintensitet meget lav og gør det muligt at udføre cellevæg farvning som “lav dosis” Live-Cell Imaging teknik2. Fordi disse cellevæg farvestoffer er plasma membran uigennemtrængelige, de samtidig fungerer som levende/døde pletter. Især på grund af deres ekstremt brede emissionslysspektre skal visse begrænsninger med hensyn til co-Imaging egenskaber af CFW og SPF med andre fluorophorer nøje overvejes.
Denne artikel fortsætter det banebrydende arbejde, der etablerede brugen af forskellige fluorescerende farvestoffer som vitale organelle markører for filamentøse svampe i begyndelsen af 2000 ‘ erne2,4,43, og forsøg på at diskutere de fotopysiske og celle biologiske egenskaber af FM-farvestoffer og udvalgte cellevæg farvestoffer i større detaljer end før. Især med hensyn til uønskede cellulære virkninger, såsom membran mætning eller cellevæg skader, der forekommer over visse farvestof koncentrationer. Hvad der tidligere er blevet betragtet som ikke-giftige på cellulært niveau er nu betragtes giftige på det molekylære niveau. Selv om disse virkninger kan være meget subtile og ikke direkte indlysende ved indlysende ændringer i organelle eller celle adfærd, enhver mulig interferens af farvestof ansøgning andet end visualisering skal minimeres for undersøgelsen af indfødte molekylære funktion. Heldigvis, forbedret følsomhed og Quantum effektivitet af moderne detektorer, såsom silicium lavine fotodiode detektorer (si-apd’er)44 eller airyscan område detektor45, lette brugen af endnu lavere farvestof mængder end før. Et andet centralt mål i artiklen er at eksemplificere Co-Imaging egenskaber af disse farvestoffer med andre fluorophorer, vigtigst af alt, de af GFP som den hyppigst anvendte fluorescerende protein i biologi. Dette bør støtte udformningen af billeddiagnostiske eksperimenter, der har til formål at korrelere den subcellulære lokalisering dynamik af fluorescerende fusions proteiner til dem af svampe cellevæggen, plasma membranen eller endo-og exocytose pathway osv.
Billeddannelse under naturlige og stressfri forhold er nøglen til erhvervelse af pålidelige data. Nogle praktiske overvejelser vedrørende kulturmedium og prøveforberedelse har til formål at give et udgangspunkt for at finde de optimale betingelser, der muliggør artefakt-fri, lang tids observation af sunde, ustressede celler med det højeste S/N-forhold muligt for en given prøve. Der er ingen universel måde at opnå pålidelige og meningsfulde Imaging resultater. Det er uløseligt forbundet med den tilgang, at biologisk variation af prøven, subjektivitet og forventninger i mikroskopist, samt billede efter behandling har betydelig indflydelse på data erhvervelse og tolkning, hhv. Derfor er den praktiske oplevelse af microscopist, hendes/hans intime viden om cellebiologi af svampen under undersøgelse, samt dygtige prøveforberedelse til at skabe betingelser som ‘ naturlig ‘ og uforstyrret som muligt i en lab indstilling, er altafgørende for at erhverve og evaluere billeddata, der sandfærdigt afspejler de undersøgte cellulære fænomener. Som en tommelfingerregel, forekomsten af uønskede bivirkninger af fluorescerende farvestoffer, der spænder fra den subtile og dermed ikke åbenbart synlig aktivering af plasma membran eller cellevæg re-modellering stress respons veje til den ligetil cytotoksiske induktion af celle autolyse, kan kun forebygges sikkert ved at anvende lave farvestoffer koncentrationer ≤ 2 μM.
Anvendelsen af fluorescerende farvestoffer er enkel, men deres særpræg er dårligt karakteriseret. En vigtig styrke ved at bruge fluorescerende farvestoffer er den forberedende enkelhed af forsøgsprotokoller. Dyrkning og prøveudtagning af svampen, tilsætning af farvestof (r), og montering på mikroskop scenen er (med praksis) ligetil. Justering af de grundlæggende billedbehandlings indstillinger, herunder excitation og emission bølgelængder, eksponeringstider, tidsforløb indstillinger osv., Følg simple biofysiske regler af mikroskopet og biologiske regler af de anvendte fluorescerende farvestoffer inde i cellerne. Tabel 1 har til formål at støtte identifikationen af den mest egnede farvestof eller farvekombination til forsøg. Desuden er fluorescerende farvestoffer rimeligt prissat, let tilgængelige med pålidelig høj kvalitet og dermed sikre meget reproducerbar anvendelse.
To store begrænsninger ved brug af membran eller cellevæg selektive fluorescerende farvestoffer er (ofte) begrænset kendskab til deres præcise farvnings egenskaber, som i de fleste tilfælde er ikke-specifikke på organelle og molekylært niveau, og deres koncentrationsafhængige uønskede bivirkninger. FM-farvestoffer er specifikke for lipidbilayers, der deltager i endo-og exocytose. Men netop hvilke subcellulære organeller bliver successivt mærket under de testede betingelser er ikke umiddelbart indlysende og kræver sammenligning af forskellige FM farvevarianter, og co-mærkning med yderligere organelle-specifikke markører. Præference for FM 1-43 for mitokondrie membraner, i forhold til FM 4-64, er et eksempel. Cell Wall selektive farvestoffer viser varierende specificitet for de tre store polymerer af svampe cellevæggen. CFW menes at være en ikke-specifik plet for β-glucaner og chitin, SPF menes at være mest selektive for β-1, 4-glucaner, og CR menes at være yderst selektiv for α-og β-chitiner. Oplysninger om den bindende specificitet af PFS til svampe cellevæg polysaccharider er i øjeblikket ikke tilgængelig. Det forhold, som svampe celle vægpolymer mest effektivt mærkes med i en given farve koncentration hos de svampearter, der undersøges, er ikke let at besvare, og anvendelsen af detaljerede målinger, som er erhvervet in vitro eller in vivo i andre organismer eller andre svampearter, skal overvejes meget nøje. Desværre, disse oplysninger er sparsomme og meget spredt i litteraturen35,42,46. Nyere optegnelser, der ville følge på tidligere undersøgelser33 for at give ny indsigt i de præcise farvning egenskaber af featured farvestoffer specifikt i svampe er i øjeblikket ikke tilgængelige.
Billedbehandlings kontrol er afgørende for at evaluere farvnings mønstre og cellulær respons nøjagtigt. Sandsynligvis den mest udfordrende del, dog, er at kende cellebiologi af svampen så godt, at de registrerede ændringer i den subcellulære lokalisering af membran og cellevæg selektive fluorescerende farvestoffer, ændringer i cellulære arkitektur eller hyphal vækstmønster kan udelukkende og trygt være relateret til de tilsigtede virkninger af den eksperimentelle behandling. Til dette er det afgørende at have gode Kontroller sammen med alle nye Live-Cell Imaging eksperiment. Disse omfatter ubehandlet vildtype som negativ billedbehandlings kontrol for at udelukke baggrunds autofluorescens og detektor støj fra det erhvervede billede og for at have en morfologisk Komparator, når du arbejder med mutanter. Endvidere, en positiv billeddannelse kontrol, for eksempel en stamme, der udtrykker GFP eller RFP i cytoplasmaet eller et andet velkendt fluorescerende markør protein, er afgørende for at indstille excitation lysintensiteten til det krævede minimum og har en celle vitalitet kontrol. Når disse kontroller er indstillet, er brugen af fluorescerende farvestoffer ikke begrænset til visualiseringsopgaver, men deres koncentrationsafhængige farvnings dynamik samt koncentrationsafhængige bivirkninger kan udnyttes analytisk; for eksempel, for kvantitativt overvågning cellevæg biosyntese i realtid eller for identifikation af mutant-specifikke fænotyper i modtagelighed assays47.
Forbedrede fremtidige applikationer afhænger af en detaljeret funktionel analyse af farvestof farvnings egenskaber. En stor vedvarende udfordring er at forbedre og automatisere kvantitative billedanalyser for at fremme funktionel evaluering af den subcellulære dynamik i membran-og cellevæg selektive fluorescerende farvestoffer i filamentøse svampe. Til dette, omfattende, kvantitative samlokaliserings undersøgelser af disse farvestoffer med kendte organelle og cellevæg polymer markører i kombination med mutant stammer mangelfuld i bestemte transportveje eller der mangler specifikke strukturelle komponenter er først påkrævet. Flere endokytose markører til komparative analyser med FM-farvestoffer er tilgængelige48,49, og med hensyn til de stadig dårligt karakteriseret bindende karakteristika af cellevæg farvestoffer i svampe, anvendelse af fluorescently-mærkede glucan-specifikke antistoffer50 kan give en mulighed for at løse dette problem.
The authors have nothing to disclose.
Der er grund til at takke den tyrolske videnskabs fond (TWF) for at yde Grant #256524 til AL, til Wiens videnskabs-og teknologi fond (WWTF) for at yde Grant #LS13-086 til SZ, og til publikations fonden på universitetet i Innsbruck for at understøtte åben adgang publikation. Forfatterne takker også Department of Zoology of The University of Innsbruck for at levere Leica TCS SP5 II confokal laser scannings mikroskop.
BRAND cell counting chamber | Merck | BR718005 | Thoma format |
Calcofluor White M2R | Merck/Sigma-Aldrich | F3543 | cell wall dye |
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI | Nikon | MRD07602 | water immersion objective |
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI | Nikon | MRD07602 | water immersion objective |
Congo Red | Merck/Sigma-Aldrich | C6277 | cell wall dye |
Dimethyl sulfoxide | VWR | 8,36,73,230 | organic solvent |
Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit | Nikon | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4 |
Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit | Nikon | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5 |
FM 1-43 | Merck/Sigma-Aldrich | S6814 | membrane dye |
FM 4-64 | Merck/Sigma-Aldrich | S6689 | membrane dye |
Glass beads | Rettberg | 1340691030 | 3 mm glass beads |
Glass cover slips | Thermo Fisher Scientific | BB02400600A113MNT0 | 24 x 60 # 1 glass cover slips |
HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc | Leica | 15506353 | glycerol immersion objective |
LSM 510 Meta | Zeiss | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3 |
M9 Minimal Medium | Merck/Sigma-Aldrich | M6030 | generic fungal growth medium |
Micro-slide 8-well | ibidi | 80826 | ibiTreat #1.5 polymer coverslip |
Miracloth | Merck/Millipore | 475855-1R | polyester filtration material |
Petri dish | Sarstedt | 8,21,472 | 92 x 16 mm culture dish w/o cams |
Phytagel | Merck/Sigma-Aldrich | P8169 | transparent gelling agent |
Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC | Zeiss | 440762-9904-000 | oil immersion objective |
Pontamine Fast Scarlet 4B | Merck/Sigma-Aldrich | 212490 | cell wall dye |
Potato Dextrose Agar (PDA) | BD Difco | 213400 | fungal growth medium for T. atroviride |
Potato Dextrose Broth (PDB) | BD Difco | 254920 | fungal growth medium for T. atroviride |
Reaction tube | Sarstedt | 72,706 | 1.5 mL SafeSeal tube |
Scalpel | B.Braun | 5518016 | Cutfix sterile scalpel #23 |
Screw cap tube | Sarstedt | 6,25,54,502 | 15 mL polypropylene tube |
Solophenyl Flavine 7GFE 500 | CIBA | 1485385V6 | cell wall dye |
SynaptoGreen C4 | Biotum | 70020 | membrane dye |
SynaptoRed C2 | Biotum | 70021 | membrane dye |
Syringe membrane filter | Thermo Fisher Scientific | 723-9945 | 0.45 µm SFCA syringe filter |
TCS SP5 II | Leica | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1 |
Vogel's Minimal Medium (VMM) | FGSC | Fungal Genetics Stock Centre | fungal growth medium for N. crassa |