중요한 형광 염료는 현대 곰팡이 세포 생물학에 있는 살아있는 세포 화상 진찰 분석을 위한 필수적인 공구입니다. 이 논문은 필라멘트 균류에서 플라즈마 막 역학, 내분비 / 외신 세포증 및 세포 벽 형태 형성을 추적하기위한 확립되고 덜 알려진 형광 염료의 응용 프로그램에 대해 자세히 설명합니다.
곰팡이 세포에 있는 세포기관 역학의 살아있는 세포 화상 진찰 분석을 위한 막 과 세포벽 선택적인 형광 염료의 응용은 2십년 전에 시작되고 그 때부터 필라멘트 곰팡이의 우리의 이해에 크게 기여하기 위하여 계속합니다 라이프 스타일. 본 논문은 두 개의 멤브레인 염료 FM 1-43 및 FM 4-64 및 4개의 세포벽 얼룩 칼코플루어 화이트 M2R, 솔로페닐 플라빈 7GFE 500, 폰타민 패스트 스칼렛 48 및 콩고 레드의 활용에 대한 실용적인 가이드를 제공한다. 초점은 유물없는 염색, 그들의 공동 이미징 특성 및 정량적 평가를 확인하기 위해 저용량 응용 프로그램에 있습니다. 제시된 방법은 기재된 방법으로 제조될 수 있는 모든 필라멘트 곰팡이 샘플에 적용 가능하다. 근본적인 염색 접근법은 다른 재배 조건을 필요로 할 수 있는 종에 적응을 위한 출발점으로 작용할 수 있습니다. 첫째, 생물물리학및 생화학적 성질은 이러한 염료를 진정으로 중요한 형광 얼룩으로 사용하기 위해서는 그들의 이해가 필수적이기 때문에 검토됩니다. 둘째, 단계별 프로토콜은 형광 라이브 세포 이미징을 위한 다양한 곰팡이 샘플 유형의 제조를 상세히 제시한다. 마지막으로, 예제 실험은 다른 접근법을 보여줍니다: (1) 유전 돌연변이체내시경의 spatio-temporal 조직에서 결함을 식별하고, (2) GFP 표지된 표적 단백질의 공유및 뚜렷한 공동 국소화를 비교적 특성화 내분비 경로에서, (3) 유전 돌연변이체에서 형태유전학적 세포벽 결함을 식별하고, (4) 세포벽 생물발생을 실시간으로 모니터링한다.
20년 전, 히프 형태 형성과 근본적인 분자 세포 생물학이 필라멘트 균류에서 가시화될 수 있는 방법은 막 선택적 형광 페이 마오 염색 FM 4-641의적용에 의해 혁명을 일으켰습니다. 나중에, 곰팡이 세포벽 역학의 중요한 형광 마커로서 치틴 결합 염료 칼코플루어 화이트의 이점이 실현되었다2. 그 이후로 염료와 변이체 는 곰팡이에서 세포 역학의 살아있는 세포 이미징 분석의 고유 한 부분이되었으며 필라멘트 곰팡이 라이프 스타일에 전례없는 통찰력을 계속 제공합니다. 이 논문은 필라멘트 균류에서 플라즈마 막 역학, 내분비 및 외세포증 및 세포벽 형태 형성을 추적하기 위한 확립되고 덜 알려진 형광 염료의 적용을 자세히 설명합니다. 내분비증 추적 세포 는 내분비증의 일반적인 연구와 관련된 다양한 세포 생물학적 질문을 해결 할 수 있습니다3. 이를 위해, FM 염료 첨가 시 염색구의 국소화, 속도 및 승계는 시험된 곰팡이 균주4간에 시간 경과 현미경 및 정량적으로 비교하여 기록된다. 세포벽 염료는 세포의 외경계를 묘사하고 편광된 하이프 팁 성장2,하이프 분기5,하이프 융합6,7 및 중격 형성8을포함하는 형태유전학적 사건의 추적을 허용한다. 더욱이, 이들은 국지화된 세포벽 증착의 정량화 및 세포벽 생물발생 동안의 결함의 식별을 용이하게한다 9. 어떤 형광 마커의 생화학적 및 생화학적 특성에 대한 상세한 지식이 생체 내 응용 프로그램의 성공적인 전제 조건이기 때문에, 이러한 특성은 이 문서에 등장하는 6개의 염료에 대해 먼저 요약된다.
멤브레인 선택적 염료
FM(Fei Mao) 스타일염료는 생물학적막(10)의지질 이중층의 외부 리플렛과 가역적으로 연관될 수 없는 작은 양과성 분자이다. 이들은 사실상 수성 용액에서 비형광이지만 플라즈마 멤브레인 통합 시 강렬하게 형광이 되어 우수한 신호 대 잡음(S/N)-비11을생성합니다. 이러한 특성은 내도 및 외세포증12의추적을 포함하여 혈장 막 및 세포내 세포 기관 역학을 시각화하는 데 이상적입니다. 녹색 형광 FM 1-43 및 적색 형광 FM 4-64는 이러한 목적을 위해 가장 널리 사용되는 두 가지 형광 막 마커이다. SynaptoGreen C4와 SynaptoRed C2는 각각 FM 1-43 및 FM 4-64 대신 에 상호 교환적으로 사용할 수 있는 대체 공급 업체의 일반 분자입니다.
Styryl 염료는 세 가지 주요 구조 영역을 포함: (1) 지질 이중층으로 염료의 삽입을 용이하게 하는 친유성 꼬리, (2) 염료의 스펙트럼 특성을 결정하고 1~3개의 이중 결합으로 연결된 2개의 방향족 고리에 의해 구성되는 형광코어, (3) 멤브레인을 통한 염료의 완전한 삽입 및 투과를 방지하는 양전하 친수성헤드(도 1A).
친유성 꼬리가 길수록 염료의 소수성및 따라서 멤브레인에 결합친화성이 높지만, 낮은 것은 수용성과 멤브레인 염색률이 낮습니다. 따라서, 다른 FM 염료 변종은 다른 염색 역학및 패턴을 생성합니다. C4 꼬리 FM 1-43의 높은 소수성은 혈장 막 및 내부 소기관에서 더 짧은 C2 꼬리 FM 4-64보다 더 강력하고 안정적인 형광 신호를 제공하며, 등구 농도에서 적용될 때(그림 2).
중요한 것은, 개별 염료 분자 당 1-6 s의 평균 체류 시간을 가진 두 FM 염료 (11)의 일정하고 높은 협회 /해리 비율은 막 유동성의 수정 또는 막 단백질의 강제 영구 상호 작용을 통해, 예를 들어, 막 기능의 국부적 인 중단에 대한 기회를 감소시킵니다. 이것은 아마 이 분자가 중요한 염료로 이용될 수 있는 중요한 이유입니다. 그럼에도 불구하고, 50 μM 이상의 FM 염료 농도는 곰팡이 및 식물 세포2,14에독성이 있으며, BY-2 담배 프로토플라스트로부터의 증거는 20 μM FM 염료 가 혈장 포화로 이어진다는 것을 나타낸다14. 따라서, 특히 우수한 이미징이 2-5 μM15,16만큼적게 달성되었다는 사실을 감안할 때이 한계를 초과하지 않는 것이 바람직하다.
특히, FM 염료의 스펙트럼 특성은 특정 멤브레인 미세환경에 따라 크게 달라집니다(검토된 14). 일반적으로 순수 용매 용액에서 FM 염료의 여기 및 방출 스펙트럼은 (일반적으로 제품 정보에 제공된 대로) 셀룰러 환경에서와 크게 다르며 대부분의 경우 라이브 셀 이미징 설정을 선택하기 위해 직접 상담할 수 없습니다. 예를 들어, FM 1-43 및 FM 4-64의 여기/방출 최대값은 각각 37/46 nm 및 43/64 nm로 청색 이동이 되며, 메탄올 내의 용액과 비교하여 곰팡이 막에 결합될때(표 1).
혈장 막, 내분비증 및 세포역학을 추적하기 위한 FM 4-64 및 FM 1-43의 사용에 대한 획기적인기초는 이미 이전에2,4,17,18,19의 광범위한 필라멘트 곰팡이 종에 대해 포괄적으로 문서화되어 있습니다. 다양한 필라멘트 곰팡이 종에서 작동하는 두 FM 염료에 대한 권장 이미징 설정은 그림 1B에도시되어 있습니다. 그러나 사용 가능한 장비 또는 배양 배지, pH 또는 온도와 같은 특정 셀룰러 및 실험 조건의 기술적 한계는 일부 적응이 필요할 수 있습니다. 다행히도, FM 염료는 넓은 스펙트럼 범위에서 작동하고, 매우 좋은 이미징 결과는 514 nm 또는 FM 4-64와 흥미 진진한 FM 1-43에 의해 달성된다 488 nm. 따라서 최적의 이미징 설정은 각 샘플 유형 및 의도된 적용에 대해 개별적으로 결정해야 합니다.
FM 4-64의 135 nm 이상의 상당한 스토크의 변화는 녹색 빛을 방출 하는 형광단과 우수한 동시 공동 이미징을 허용; 이는 혈장막 및 내분비 경로에비해 녹색 형광 단백질(GFP)표지된 융합 단백질의 세포내 국소화 역학을 평가하기 위해 빈번하게 이용된다9,20.
세포벽 선택적 염료
칼코플루어 화이트 M2R(CFW)은 형광 브라이트너 28로 도래하며, 박테리아, 곰팡이, 조류, 높은 식물 및 곤충의 세포벽을 염색하는 데 사용되는 가장 잘 알려진 형광 염료일 것입니다. 처음에 종이, 섬유 및 세제 산업에서 광학 미백제로 사용되었지만 곰팡이 감염의 임상 진단에 대한 이점은21,22일 일찍 실현되었습니다. CFW는 초기 키틴 사슬내로 비가역적으로 인터케이팅되기 때문에 세포벽 생물발생 시 정상적인 키틴 마이크로피브릴 어셈블리를 방해하여 세포벽응력(23)을발생시게 된다. 이는 글루칸 및 키틴 신타제활성화(24,25)의결과로 국소적으로 고조된 세포벽 침착으로 이어지는 세포벽 손상 수리 메커니즘을 차례로 트리거한다. 이러한 현상은 세포벽 중합체에 안정적으로 결합하여 작동하는 임의의 염료와 함께 발생할 수 있으며, 농도의존적이며, 균사체의 가장 다산적 성장 및 따라서 가장 민감한 부분을 나타내는 하이프 팁에서 가장 두드러집니다(그림3). 세포벽 손상에 대응하는 분자기계에 대한 종합적인 요약이 최근26개제공되고 있다.
광독성과 함께 과다 복용 된 염료는 하이프 구획의 빠른 세포 포염으로 이어질 수 있습니다(영화 1). 그럼에도 불구하고, 야생형에서 “필수적”인 염료 농도에 대한 민감도 증가는 유전자 기능 상실 돌연변이체의 세포벽 생합성의 결함을 규명하는데 이용될 수있다 9. CFW 및 콩고 레드(CR)의 경우, 다이렉트 레드 28로도 알려져 있으며, 곰팡이 및 곤충을 위한 α-및 β-키틴 특이적 세포벽 얼룩으로 사용되는 또 다른 섬유착색제(27,28, 28,키틴 신타제를 강하게 유도하는 임계 농도 >gt;; 60 μM CFW 및 > 70 μM CR은 각각, 반면 염료의 농도 <15 μM은 곰팡이 성장을 변경하거나 억제하지 않았다29,30,31. Hickey 외. 25 μM 2에서 CFW에 대한 이 임계 값농도를배치했습니다. 따라서 염료 농도 ≤ 5 μM을 사용하여 응력 관련 유물을 배제하고 이러한 분자를 진정으로 “중요한 형광염료”2,32로사용하는 것이 좋습니다. 이는 솔로페닐 플라빈 7GFE 500(SPF) 및 폰타민 패스트 스칼렛 4B(PFS)에 동일하게 적용되며, 각각 다이렉트 옐로우 86 및 다이렉트 레드 23의 대명사이며, 곰팡이에 대한 적용이 10년 전33년이전에 처음으로 보고된 두 개의 유용한 세포벽 염료이다. 그러나 그들의 놀라운 스펙트럼 특성에도 불구하고34,35,두 염료의 사용은 그 이후로 매우 제한되었습니다36,37. 앞서 도시된 바와 같이 1.5 μM CFW2,2 μM SPF는 매우 높은 시간분해능(Movie2)으로원어민 조건하에서 세포벽 역학을 해결하기에 충분하다. 동일한 결과를 2 μM CR 또는 PFS로 얻을 수 있다.
함께, 이들 4개의 염료, CFW, SPF, PFS 및 CR은, 현대 형광 현미경에 이용되는 거의 완전한 가시 방출 광 스펙트럼(400-700 nm)을 커버하는 세포벽 선택적 형광 마커 세트를포함한다(그림 4). 세포벽 폴리머에 결합시 형광 강도의 현저한 증가는 네 가지 모두에 내재되어 우수한 S/N 비율을 생성합니다. 이것은 차례차례로 염료 사격량 및 흥분 광 강렬을 아주 낮게 유지하는 것을 허용하고 “저용량” 살아있는 세포 화상 진찰 기술2로세포벽 염색을 능력을 발휘할 수 있습니다. 이 세포벽 염료는 플라즈마 막 불투과성이기 때문에, 그들은 살아있는/죽은 얼룩으로 동시에 작동합니다. 특히, 매우 넓은 방출 광 스펙트럼으로 인해 다른 형광체와 함께 CFW 및 SPF의 공동 이미징 특성에 대한 몇 가지 제한 사항을 신중하게 고려해야 합니다.
본 기사는 2000년대 초반2,4,43, 2,4,43,및 FM 염료 및 선택된 세포벽 염료의 광물리및 세포 생물학적 특성에 대해 이전보다 더 자세하게 논의하려고 시도하는 필라멘트 균류에 대한 중요한 소기관 마커로서 다양한 형광 염료의 사용을 확립한 획기적인 작업을 계속한다. 특히 특정 염료 농도 이상으로 발생하는 막 포화 또는 세포벽 손상과 같은 원치 않는 세포 효과에 대하여. 이전에 세포 수준에서 비 독성으로 간주 되 고 무엇 지금 분자 수준에 독성으로 간주 됩니다. 이러한 효과는 매우 미묘하고 세포 기관 또는 세포 행동의 명백한 변화에 의해 직접 적으로 분명하지 않을 수 있지만, 시각화 이외의 염료 응용 프로그램의 가능한 간섭은 네이티브 분자 기능의 조사를 위해 최소화되어야한다. 다행히실리콘 눈사태 광다이오드 검출기(Si-APDs)44 또는 Airyscan 영역검출기(45)와같은 현대 검출기의 감도 및 양자 효율이 개선되어 이전보다 훨씬 낮은 염료 양을 쉽게 사용할 수 있습니다. 이 기사의 또 다른 주요 목적은 생물학에서 가장 자주 사용되는 형광 단백질로서 GFP의 다른 형광단과 이러한 염료의 공동 이미징 특성을 예시하는 것입니다. 이것은 형광 융합 단백질의 세포내구화 역학을 곰팡이 세포벽, 혈장 막 또는 endo- 및 외신세포증 통로 등과 상관시키는 것을 목표로 하는 화상 진찰 실험의 디자인을 원조할 것입니다.
자연적이고 스트레스없는 조건에서 이미징은 신뢰할 수있는 데이터를 수집하기위한 열쇠입니다. 배양 배지 및 시료 준비에 관한 몇 가지 실질적인 고려 사항은 주어진 시료에 대해 가능한 가장 높은 S/N 비율을 가진 건강하고 스트레스없는 세포를 장시간 관찰할 수 있는 최적의 조건을 찾는 출발점을 제공하는 것을 목표로 합니다. 신뢰할 수 있고 의미 있는 이미징 결과를 얻을 수 있는 보편적인 방법은 없습니다. 샘플의 생물학적 변이, 주관성 및 현미경의 기대치뿐만 아니라 이미지 후처리가 각각 데이터 수집 및 해석에 상당한 영향을 미친다는 접근법에 내재되어 있습니다. 따라서, 마이크로 스코피스트의 실제 경험, 조사 중인 곰팡이의 세포 생물학에 대한 그녀의 / 그의 친밀한 지식뿐만 아니라 실험실 환경에서 가능한 한 ‘자연’과 방해받지 않는 조건을 만드는 숙련 된 샘플 준비는 연구 된 세포 현상을 진실하게 반영하는 이미징 데이터를 획득하고 평가하는 데 가장 중요합니다. 엄지 손가락의 규칙으로, 형광 염료의 원치 않는 부작용의 발생, 미묘하 고 따라서 플라즈마 막 또는 세포 벽 재 모델링 스트레스 응답 경로의 명백 하 게 눈에 띄는 활성화에서 세포 자동 용해의 간단한 세포 독성 유도, 단지 안전 하 게 낮은 염료 농도 적용 하 여 방지할 수 있다 ≤2 μM.
형광 염료의 적용은 간단하지만 특이성은 제대로 특성화되지 않습니다. 형광 염료를 사용하는 주요 강점은 실험 프로토콜의 예비 단순성입니다. 곰팡이의 재배 및 샘플링, 염료의 첨가 및 현미경 단계에 장착하는 것은 간단합니다. 여기 및 방출 파장, 노출 시간, 시간 과정 설정 등을 포함하여 기본적인 화상 진찰 조정은, 세포 안쪽에 사용된 형광 염료의 현미경 및 생물학 규칙의 간단한 생물물리학 규칙을 따릅니다. 표 1은 실험을 위한 가장 적합한 염료 또는 염료 조합의 식별을 지원하기 위한 것입니다. 또한 형광 염료는 합리적인 가격으로 신뢰할 수있는 고품질로 쉽게 사용할 수 있으므로 높은 재현성 적용을 보장합니다.
막 또는 세포벽 선택적 형광 염료를 사용하는 두 가지 주요 제한사항은 (종종) 그들의 정확한 염색 특성에 대한 제한된 지식이며, 대부분의 경우 소기관 및 분자 수준에 비특이적이며, 그들의 농도 의존적 원치 않는 부작용이다. FM 염료는 내분비 및 외세포증에 참여하는 지질 이중층에게 특이적이다. 그러나, 시험된 조건의 밑에 연속적으로 표지되는 정확하게 세포소기관이 즉시 명백하지 않으며, 다른 FM 염료 변이체의 비교를 요구하고, 추가 소기관 특정 마커와 공동 표지를 요구합니다. FM 4-64에 비해 미토콘드리아 멤브레인에 대한 FM 1-43의 선호도가 한 예입니다. 세포벽 선택적 염료는 곰팡이 세포벽의 3대 중합체에 대해 다양한 특이성을 표시한다. CFW는 β-글루칸 및 키틴에 대한 비특이적 얼룩으로 생각되며, SPF는 β-1,4-글루칸에 대해 가장 선택적인 것으로 생각되며, CR은 α-및 β-키틴에 대해 매우 선택적인 것으로 생각된다. 곰팡이 세포벽 다당류에 대한 PFS의 결합 특이성에 대한 정보는 현재 사용할 수 없습니다. 조사 중인 곰팡이 종에서 주어진 염료 농도에서 가장 효과적으로 표지되는 곰팡이 세포벽 중합체의 비율은 쉽게 응답되지 않으며, 다른 유기체 또는 다른 곰팡이 종에서 시험관 내 또는 생체 내에서 획득 된 상세한 측정의 적용은 매우 신중하게 고려되어야합니다. 불행하게도, 이 정보는 희소하고 문헌35,42,46에매우 흩어져 있다. 특히 곰팡이에 있는 추천된 염료의 정확한 염색 특성에 대한 새로운 통찰력을 제공하기 위해 이전 연구33에 따를 최신 기록은 현재 사용할 수 없습니다.
화상 진찰 통제는 염색 패턴 및 세포 반응을 정확하게 평가하기 위하여 필수적입니다. 아마 가장 어려운 부분은, 그러나, 너무 잘 곰팡이의 세포 생물학을 아는 것입니다 막과 세포벽 선택적 형광 염료의 세포 국소화에 기록 된 변화, 세포 구조 또는 hyphal 성장 패턴의 변화는 독점적으로 자신있게 실험 치료의 의도 된 효과와 관련될 수 있습니다. 이를 위해, 어떤 새로운 살아있는 세포 화상 진찰 실험든지 와 더불어 좋은 통제가 있는 것이 중요합니다. 이들은 취득한 심상에서 배경 자동 형광 및 검출기 노이즈를 제외하고, 돌연변이로 작업할 때 형태학적 비교기를 갖기 위하여 음성 화상 진찰 통제로 처리되지 않은 야생 모형을 포함합니다. 더욱이, 양성 이미징 대조군, 예를 들어 세포질 또는 다른 잘 알려진 형광 마커 단백질에서 GFP 또는 RFP를 발현하는 균주, 여기 광 강도를 최소한으로 설정하고 세포 활력 조절을 하는 데 필수적이다. 이러한 컨트롤이 설정되면 형광 염료의 사용은 시각화 작업에만 국한되지 않지만 집중력에 의존하는 염색 역학뿐만 아니라 집중력에 의존하는 부작용이 분석적으로 악용 될 수 있습니다. 예를 들어, 세포벽 생합성을 실시간으로 정량적으로 모니터링하거나 감수성 분석에서 돌연변이 특이적 표현형의 식별을 위해47.
개선된 향후 응용 분야는 염료 염색 특성의 상세한 기능 분석에 의존합니다. 주요 지속적인 과제는 필라멘트 균류에서 막과 세포벽 선택적 형광 염료의 세포내 역학적 평가를 진행하기 위해 정량적 이미지 분석을 더욱 개선하고 자동화하는 것입니다. 이를 위해, 특정 수송 경로에 결핍된 돌연변이 균주와 조합하여 공지된 소기관 및 세포벽 중합체 마커를 사용하거나 특정 구조 성분이 결여된 이들 염료의 광범위한 정량적 공동 국소화 연구가 먼저 요구된다. FM 염료를 가진 비교 분석을 위한 몇몇 내분비증 마커는 유효합니다48,49,및 곰팡이에 있는 세포벽 염료의 아직도 잘못 특성이 없는 결합 특이성에 대하여, 형광 표지된 글루칸 특이적항체(50)의 적용은 이 문제를 해결하기 위하여 1개의 가능성을 제공할 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
덕분에 티롤리안 과학 기금 (TWF) AL에 교부금 #256524 제공하기위한, 비엔나 과학 기술 기금에 (WWTF) SZ에 교부금 #LS13-086을 제공하기위한, 오픈 액세스 출판을 지원하기위한 인스 브루크 대학의 출판 기금에. 저자는 또한 라이카 TCS SP5 II 공초점 레이저 스캐닝 현미경을 제공하기위한 인스 브루크 대학의 동물학과에 감사드립니다.
BRAND cell counting chamber | Merck | BR718005 | Thoma format |
Calcofluor White M2R | Merck/Sigma-Aldrich | F3543 | cell wall dye |
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI | Nikon | MRD07602 | water immersion objective |
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI | Nikon | MRD07602 | water immersion objective |
Congo Red | Merck/Sigma-Aldrich | C6277 | cell wall dye |
Dimethyl sulfoxide | VWR | 8,36,73,230 | organic solvent |
Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit | Nikon | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4 |
Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit | Nikon | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5 |
FM 1-43 | Merck/Sigma-Aldrich | S6814 | membrane dye |
FM 4-64 | Merck/Sigma-Aldrich | S6689 | membrane dye |
Glass beads | Rettberg | 1340691030 | 3 mm glass beads |
Glass cover slips | Thermo Fisher Scientific | BB02400600A113MNT0 | 24 x 60 # 1 glass cover slips |
HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc | Leica | 15506353 | glycerol immersion objective |
LSM 510 Meta | Zeiss | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3 |
M9 Minimal Medium | Merck/Sigma-Aldrich | M6030 | generic fungal growth medium |
Micro-slide 8-well | ibidi | 80826 | ibiTreat #1.5 polymer coverslip |
Miracloth | Merck/Millipore | 475855-1R | polyester filtration material |
Petri dish | Sarstedt | 8,21,472 | 92 x 16 mm culture dish w/o cams |
Phytagel | Merck/Sigma-Aldrich | P8169 | transparent gelling agent |
Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC | Zeiss | 440762-9904-000 | oil immersion objective |
Pontamine Fast Scarlet 4B | Merck/Sigma-Aldrich | 212490 | cell wall dye |
Potato Dextrose Agar (PDA) | BD Difco | 213400 | fungal growth medium for T. atroviride |
Potato Dextrose Broth (PDB) | BD Difco | 254920 | fungal growth medium for T. atroviride |
Reaction tube | Sarstedt | 72,706 | 1.5 mL SafeSeal tube |
Scalpel | B.Braun | 5518016 | Cutfix sterile scalpel #23 |
Screw cap tube | Sarstedt | 6,25,54,502 | 15 mL polypropylene tube |
Solophenyl Flavine 7GFE 500 | CIBA | 1485385V6 | cell wall dye |
SynaptoGreen C4 | Biotum | 70020 | membrane dye |
SynaptoRed C2 | Biotum | 70021 | membrane dye |
Syringe membrane filter | Thermo Fisher Scientific | 723-9945 | 0.45 µm SFCA syringe filter |
TCS SP5 II | Leica | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1 |
Vogel's Minimal Medium (VMM) | FGSC | Fungal Genetics Stock Centre | fungal growth medium for N. crassa |