Vitala fluorescerande färgämnen är viktiga verktyg för levande-cell Imaging analyser i modern svamp cellbiologi. Detta papper Detaljer tillämpningen av etablerade och mindre kända fluorescerande färgämnen för att spåra plasmamembran dynamik, endo-/exocytos och cellvägg morfogenes i trådformiga svampar.
Tillämpningen av membran och cellvägg selektiva fluorescerande färgämnen för levande cell Imaging analyser av organell dynamik i svampceller startade för två decennier sedan och sedan dess fortsätter att bidra kraftigt till vår förståelse av trådformiga svamp Livsstil. Detta papper ger en praktisk vägledning för utnyttjande av de två membran färgämnen FM 1-43 och FM 4-64 och de fyra cellväggen fläckar Calcofluor vit M2R, Solofenyl Flavine 7GFE 500, Pontamin snabb Scarlet 48 och kongorött. Fokus ligger på deras lågdos applikation för att fastställa artefakter-fri färgning, deras co-Imaging egenskaper, och deras kvantitativa utvärdering. De presenterade metoderna är tillämpliga på alla filamentösa svamp prov som kan förberedas på de beskrivna sätten. De grundläggande infärgnings metoderna kan tjäna som utgångspunkt för anpassningar till arter som kan kräva olika odlingsförhållanden. Första, biofysiska och biokemiska egenskaper granskas eftersom deras förståelse är avgörande för att använda dessa färgämnen som verkligt viktiga fluorescerande fläckar. För det andra, steg-för-steg-protokoll presenteras som detalj utarbetandet av olika svamp provtyper för fluorescerande levande cell avbildning. Slutligen illustrerar exempel experiment olika metoder för att: (1) identifiera defekter i den spatiala-temporal organisationen av endocytos i genetiska mutanter, (2) jämförelsevis karakterisera delad och distinkt samlokalisering av GFP-märkta målproteiner i den endocytiska vägen, (3) identifiera morfogenetiska cellvägg defekter i en genetisk Mutant, och (4) Monitor cell Wall biogenes i realtid.
För tjugo år sedan, det sätt på vilket hyphal morfogenes och den underliggande molekylära cellbiologi kunde visualiseras i trådformiga svampar revolutionerades av tillämpningen av membranet selektiv fluorescerande FEI Mao Dye FM 4-641. Senare, fördelen med Chitin-bindande färgämne Calcofluor vit som vitala fluorescerande markör för svamp cell väggdynamik realiserades2. Sedan dess har både färgämnen och varianter därav blivit en naturlig del av levande cell avbildning analyser av organell dynamik i svampar, och fortsätter att ge oöverträffad insikt i den trådformiga svamp livsstil. Detta papper Detaljer tillämpningen av etablerade och mindre kända fluorescerande färgämnen för att spåra plasmamembran dynamik, endo-och exocytos och cellvägg morfogenes i trådformiga svampar. Endocytos tracking analyser möjliggör olika cellbiologiska frågor relaterade till den allmänna studien av endocytos som skall behandlas3. För detta, lokalisering, snabbhet och följd av färgade fack på FM Dye tillägg registreras av tidsfördröjning mikroskopi och kvantitativt jämfört mellan de testade svampstammar4. Cellväggen färgämnen avgränsa den yttre gränsen av cellen och tillåta spårning av morfogenetiska händelser, inklusive polariserad hyphal spets tillväxt2, hyphal förgrening5, hyphal fusion6,7 och septum formation8. Dessutom underlättar de kvantifieringen av lokaliserad cell vägg deposition och identifiering av defekter under cell Wall biogenes9. Eftersom detaljerad kunskap om de biokemiska och biofysiska egenskaperna hos någon fluorescerande markör är en grundläggande förutsättning för dess framgångsrika in vivo-applikation, sammanfattas dessa egenskaper först för de sex färgerna som visas i denna artikel.
Membran selektiva färgämnen
FM (FEI Mao) styryl färgämnen är små amfifila molekyler som inte kan passera men reversibelt associera med den yttre broschyren av lipidbilayer av biologiska membran10. De är praktiskt taget icke-fluorescerande i vattenlösning, men blir intensivt fluorescerande på plasmamembran integration, genererar utmärkt signal-till-brus (S/N)-nyckeltal11. Dessa egenskaper gör dem idealiska för att visualisera plasmamembran och intracellulär organell dynamik, inklusive spårning av endo-och exocytos12. Den grön-fluorescerande FM 1-43 och den röd-fluorescerande FM 4-64 är de två mest använda fluorescerande membran markörer för dessa ändamål. SynaptoGreen C4 och Synapserade C2 är generiska molekyler från alternativa leverantörer som kan användas omväxlande i stället för FM 1-43 och FM 4-64, respektive.
Styryl färgämnen består av tre viktiga strukturella regioner: (1) den lipofila svansen som underlättar införandet av färgämnet i lipidbilayer, (2) den fluorophore kärna som bestämmer de spektrala egenskaperna hos färgämnet och utgörs av två aromatiska ringar sammankopplade med en till tre dubbelbindningar, och (3) positivt laddade hydrofila huvudet som förhindrar fullständig insättning och genomträngning av färg genom membranet (figur 1a).
Ju längre lipofila svans, den högre är Dye vattenavvisande egenskaper och därmed bindning samhörighet med membranet, men den lägre är dess vattenlöslighet och membran de-färgning hastighet. Följaktligen, olika FM-färgvarianter producera olika färgning dynamik och mönster. Den högre hydrofobicitet av den C4-tailed FM 1-43 ger en starkare och stabilare fluorescenssignal vid plasmamembran och inre organeller snabbare än den kortare C2-tailed FM 4-64, när den appliceras på ekvimolära koncentrationer (figur 2).
Viktigt, den konstanta och hög Association/dissociation priser av både FM färgämnen11 med genomsnittliga retentionstider på 1 – 6 s per individuell färg molekyl13 minska chanserna för lokaliserade störningar av membran funktion, till exempel genom modifiering av membran smidighet eller påtvingad permanent interaktion av membranproteiner. Detta är förmodligen den viktigaste anledningen till att dessa molekyler kan användas som vitala färgämnen. Icke desto mindre, fm Dye koncentrationer över 50 μm är giftiga för svamp-och växtceller2,14, och bevis från by-2 tobak protoplasts indikerar att mer än 20 μm FM färgämne leda till plasmamembran mättnad14. Det är därför tillrådligt att inte överskrida denna gräns, särskilt med tanke på att utmärkt avbildning har uppnåtts med så lite som 2 – 5 μm15,16.
Särskilt, de spektrala egenskaperna hos FM färgämnen varierar kraftigt beroende på den särskilda membran mikromiljö (omdömet14). Generellt, excitation och emission spektra av FM-färgämnen i ren lösningsmedels lösningar (som vanligtvis anges i produktinformationen) skiljer sig avsevärt från det i cellulära miljöer och kan i de flesta fall inte direkt konsulteras för att välja Live-cell Imaging inställningar. Excitation/emission Maxima av FM 1-43 och FM 4-64, till exempel, blir blåskiftade med 37/46 nm och 43/64 nm, respektive, när de är bundna till svamp membran i jämförelse med deras lösningar i metanol (tabell 1).
De banbrytande grunderna för användning av FM 4-64 och FM 1-43 för att spåra plasmamembran, endo-/exocytosis och organelledynamik, inklusive spitzenkörper och mitokonbenerna, har redan utförligt dokumenterats för ett brett spektrum av filamentösa svamparter tidigare2,4,17,18,19. Rekommenderade bildinställningar för både FM-färgämnen som fungerar i olika filamentösa svamparter avbildas i figur 1b. Tekniska begränsningar av tillgänglig utrustning eller särskilda cellulära och experimentella förhållanden, såsom odlingsmedium, pH eller temperatur, kan dock kräva vissa anpassningar. Lyckligtvis, FM färgämnen fungerar över ett brett spektralområde, och mycket bra bildresultat uppnås genom spännande FM 1-43 med 514 nm eller FM 4-64 med 488 nm. Därför måste de optimala bildinställningarna bestämmas individuellt för varje prov typ och avsedd tillämpning.
Den avsevärda Stoke förskjutning av mer än 135 Nm i FM 4-64 tillåter utmärkt, samtidig Co-avbildning med fluoroforer avger grönt ljus; detta utnyttjas ofta för att utvärdera den intracellulära lokalisering dynamik av grönt fluorescerande protein (GFP)-märkta fusions proteiner i förhållande till plasmamembranet och den rutt vägen9,20.
Cell Wall-selektiva färgämnen
Calcofluor White M2R (CFW), även marknadsförs som fluorescerande Brightener 28, är förmodligen den mest kända fluorescerande färgämne som används för att färga cellväggarna av bakterier, svampar, alger, högre växter och insekter. Inledningsvis används som optisk Whitening agent i papper, textil-och tvättmedel industrin, dess fördelar för den kliniska diagnosen av svampinfektioner realiserades tidigt21,22. Eftersom CFW intercalates oåterkalleligt i begynnande Chitinen kedjan det stör normal Chitinen microfibril församling under cellväggen biogenes därigenom generera cell Wall stress23. Detta i sin tur utlöser en cell vägg skador reparationsmekanism som leder till lokalt förhöjd cellvägg deposition som ett resultat av glukan och Chitinen syntas aktiveringen24,25. Detta fenomen kan inträffa med någon färg som fungerar genom stabilt bindande för cellväggen polymerer, är koncentrationsberoende och är mest märkbar vid hyphal tips som representerar de mest produktiva växande och därmed känsligaste delarna av mycel (figur 3). En omfattande sammanfattning av den molekylära maskiner som reagerar på skador cellväggen har nyligen lämnats26.
Överdoserat färgämne i kombination med fototoxicitet kan leda till snabb cell Lys av hyphal fack (film 1). Icke desto mindre, ökad känslighet för färgämnes koncentrationer som är “vitala” i den vilda typen kan utnyttjas för att identifiera defekter i cellväggen biosyntes av gen förlust av funktion mutanter9. För CFW och Kongo-Brazzaville (CR), en annan textilfärg ämne även känd som Direct Red 28 och anställd som α-och β-Chitinen-specifik cell vägg fläcken för svampar och insekter27,28, tröskelkoncentrationer som starkt inducerar chitinsynthaser har fastställts med > 60 μm CFW och > 70 μm CR, medan koncentrationer <15 μm av antingen färg inte förändrar eller hämmar svamp tillväxt29,30,31. Hickey et al. placerade denna tröskelkoncentration för CFW vid 25 μM2. Därför är det tillrådligt att använda färgkoncentrationer ≤ 5 μm för att utesluta stressrelaterade artefakter och se till att använda dessa molekyler som verkligt “vitala fluorescerande färgämnen”2,32. Detta gäller lika för Solophenyl Flavine 7GFE 500 (SPF) och Pontamine fast Scarlet 4B (PFS), synonymt med direkt gul 86 och direkt röd 23, respektive, två andra användbara cellväggen färgämnen vars ansökan om svampar har rapporterats för första gången mer än ett decennium sedan33. Men trots deras anmärkningsvärda spektralegenskaper34,35, har användningen av båda färgerna sedan dess varit mycket begränsad36,37. Som tidigare visats för 1,5 μM CFW2, 2 μm SPF är tillräckliga för att lösa cellväggen dynamik under inhemska förhållanden med mycket hög temporala upplösning (film 2). Samma resultat kan erhållas med 2 μM CR eller PFS.
Tillsammans består dessa fyra färgämnen, CFW, SPF, PFS och CR, av en uppsättning cell Väggs selektiva fluorescerande markörer som täcker nästan hela synligt ljusspektrum (400 – 700 nm) som används på moderna fluorescerande Mikroskop (figur 4). Den signifikanta ökningen av fluorescensintensiteten vid bindning till cell Väggs polymerer är inneboende i alla fyra och genererar utmärkta S/N-nyckeltal. Detta i sin tur tillstånd att hålla färgämnes koncentrationer och excitation ljusintensitet mycket låg och gör det möjligt att utföra cellväggen färgning som “låg dos” Live-cell Imaging Technique2. Eftersom dessa cellväggen färgämnen är plasmamembran impermeable, de fungerar samtidigt som levande/döda fläckar. På grund av deras extremt breda utsläpps ljusspektrum måste vissa begränsningar i fråga om Co-Imaging-egenskaperna hos CFW och SPF med andra fluoroforer noga övervägas.
Denna artikel fortsätter den banbrytande arbete som etablerat användningen av olika fluorescerande färgämnen som vitala organell markörer för trådformiga svampar i början av 2000-talet2,4,43, och försök att diskutera foto fysikaliska och cellbiologiska egenskaper av FM-färgämnen och valda cellväggen färgämnen i större detalj än tidigare. Särskilt när det gäller oönskade cellulära effekter, såsom membranmättnad eller skador cellväggen, som förekommer över vissa färgämnes koncentrationer. Det som tidigare ansetts vara giftfritt på cellnivå betraktas nu som giftigt på molekylär nivå. Även om dessa effekter kan vara mycket subtila och inte direkt framgår av uppenbara förändringar i organell eller cell beteende, alla möjliga störningar av färgämne ansökan än visualisering måste minimeras för utredning av infödda molekylära funktion. Lyckligtvis, förbättrad känslighet och Quantum effektivitet moderna detektorer, såsom Silicon Avalanche fotodiod detektorer (SI-APDS)44 eller airyscan område detektor45, underlätta användningen av ännu lägre färgämne belopp än tidigare. En annan viktig målsättning med artikeln är att exemplifiera Co-Imaging egenskaper hos dessa färgämnen med andra fluoroforer, viktigast av allt, de av GFP som den mest använda fluorescerande protein i biologi. Detta bör hjälpa utformningen av bild experiment som syftar till att korrelera den subcellulära lokalisering dynamiken i fluorescerande fusions proteiner till de av svamp cellväggen, plasmamembranet eller endo-och exocytos vägen etc.
Avbildning under naturliga och stressfria förhållanden är avgörande för förvärvet av tillförlitliga data. Några praktiska överväganden när det gäller odlingssubstrat och provberedning syftar till att ge en utgångspunkt för att hitta de optimala förhållanden som medger en artefakt-fri, lång tid observation av friska, ostressade celler med det högsta S/N-förhållandet möjligt för ett givet prov. Det finns inget universellt sätt att uppnå pålitliga och meningsfulla bildresultat. Det är inneboende i det tillvägagångssätt som biologisk variation av provet, subjektivitet och förväntningar microscopist, liksom bild efter bearbetning har betydande inflytande på datainsamling och tolkning, respektive. Därför, den praktiska erfarenheten av microscopist, hennes/hans intima kunskaper om cellbiologi av svampen under utredning, samt skicklig provberedning för att skapa förutsättningar som “naturliga” och ostörd som möjligt i en laboratoriemiljö, är av största vikt för att förvärva och utvärdera Imaging data som sanningsenligt återspeglar de studerade cellulära fenomen. Som en tumregel, förekomsten av oönskade biverkningar av fluorescerande färgämnen, allt från den subtila och därmed inte uppenbarligen synlig aktivering av plasmamembran eller cell Wall re-modellering stress reaktionsvägar till den enkla cytotoxiska induktion av cell autolysis, kan endast förhindras säkert genom att tillämpa låga färgkoncentrationer ≤ 2 μM.
Tillämpningen av fluorescerande färgämnen är enkel, men deras särdrag är dåligt kännetecknas. En viktig styrka med att använda fluorescerande färgämnen är den förberedande enkelheten i experimentella protokoll. Odling och provtagning av svampen, tillsats av färgämne (s), och montering på mikroskopet skede är (med praktiken) okomplicerad. Justering av grundläggande bildinställningar, inklusive excitation och emission våglängder, exponeringstider, inställningar tid kurs etc., följ enkla biofysiska regler för mikroskopet och biologiska regler för de använda fluorescerande färgämnen inuti cellerna. Tabell 1 avser att stödja identifieringen av den lämpligaste färg-eller färg kombinationen för experimenterande. Dessutom, fluorescerande färgämnen är rimligt prissatta, lätt tillgängliga med tillförlitlig hög kvalitet och därmed säkerställa mycket reproducerbara ansökan.
Två stora restriktioner för att använda membran eller cellväggen selektiva fluorescerande färgämnen är (ofta) begränsad kunskap om deras exakta färgning egenskaper, som i de flesta fall är icke-specifika på organell och molekylär nivå, och deras koncentrationsberoende oönskade biverkningar. FM-färgämnen är specifika för lipidbilayers som deltar i endo-och exocytos. Men exakt vilka subcellulära organeller blir successivt märkt under de testade förhållandena är inte omedelbart uppenbar och kräver jämförelse av olika FM-färgvarianter, och co-märkning med ytterligare organell-specifika markörer. Preferensen av FM 1-43 för mitokondriella membran, i jämförelse med FM 4-64, är ett exempel. Cellväggen selektiva färgämnen uppvisar varierande specificitet för de tre stora polymerer av svamp cellväggen. CFW tros vara en icke-specifik fläck för β-glukaner och Chitin, SPF tros vara mest selektiv för β-1, 4-glukaner, och CR tros vara mycket selektiv för α-och β-chitins. Information om den bindande specificiteten för PFS till svamp cells vägg polysackarider är inte tillgänglig för närvarande. Till vilket förhållande som svamp cellväggen polymer är mest effektivt märkt vid en viss färg koncentration i svamparter under utredning är inte lätt att besvara, och tillämpningen av detaljerade mätningar som förvärvats in vitro eller in vivo i andra organismer eller andra svamparter måste beaktas mycket noggrant. Tyvärr är denna information glesa och mycket utspridda i litteraturen35,42,46. Nyare poster som skulle följa på tidigare studier33 för att ge nya insikter i exakt färgning egenskaper av de utvalda färgämnen specifikt i svampar är inte tillgängliga för närvarande.
Imaging-kontroller är nödvändiga för att utvärdera infärgnings mönster och cellulära svar korrekt. Förmodligen den mest utmanande delen, dock, är att känna till cellbiologi av svampen så väl att de inspelade förändringarna i den subcellulära lokalisering av membran och cellväggen selektiv fluorescerande färgämnen, förändringar i cellulära arkitektur eller hyphal tillväxtmönster kan uteslutande och tryggt vara relaterade till de avsedda effekterna av experimentell behandling. För detta är det viktigt att ha bra kontroller tillsammans med alla nya Live-cell Imaging experiment. Dessa inkluderar obehandlad vildtyp som negativ avbildning kontroll för att utesluta bakgrund autofluorescence och detektor brus från den förvärvade bilden, och att ha en morfologisk komparator när man arbetar med mutanter. Dessutom är en positiv avbildning kontroll, till exempel en stam som uttrycker GFP eller RFP i cytoplasman eller annan välkänd fluorescerande markör protein, viktigt att ställa excitation ljusintensitet till det minimum som krävs och har en cell vitalitet kontroll. När dessa kontroller är inställda, är användningen av fluorescerande färgämnen inte begränsad till visualisering uppgifter endast, men deras koncentrationsberoende färgning dynamik, liksom koncentrationsberoende biverkningar kan analytiskt utnyttjas; till exempel, för att kvantitativt övervaka cell Väggs biosyntes i realtid eller för identifiering av mutantspecifika fenotyper i känslighetsanalyser47.
Förbättrade framtida tillämpningar beror på en detaljerad funktionell analys av färg färgning egenskaper. En stor pågående utmaning är att ytterligare förbättra och automatisera kvantitativa bildanalyser för att främja funktionell utvärdering av den subcellulära dynamiken i membran och cell Väggs selektiva fluorescerande färgämnen i trådformiga svampar. För denna, omfattande, kvantitativa Co-lokalisering studier av dessa färgämnen med kända organell och cellvägg polymer markörer i kombination med muterade stammar bristfällig i synnerhet transportvägar eller som saknar specifika strukturella komponenter krävs först. Flera endocytos markörer för jämförande analyser med FM-färgämnen finns tillgängliga48,49, och med avseende på de fortfarande dåligt karaktäriserade bindande särdragen hos cell Väggs färgämnen i svampar, kan tillämpningen av fluorescerande-märkta GLUCAN-specifika antikroppar50 ge en möjlighet att ta itu med denna fråga.
The authors have nothing to disclose.
Tack vare den tyrolska vetenskaps fonden (TWF) för att ge bidrag #256524 till AL, till Wien Science and Technology Fund (WWTF) för att ge bidrag #LS13-086 till SZ, och till Publikationsfond vid universitetet i Innsbruck för att stödja Open Access publikation. Författarna tackar också Institutionen för zoologi vid universitetet i Innsbruck för att tillhandahålla Leica TCS SP5 II konfokala laser scanning Mikroskop.
BRAND cell counting chamber | Merck | BR718005 | Thoma format |
Calcofluor White M2R | Merck/Sigma-Aldrich | F3543 | cell wall dye |
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI | Nikon | MRD07602 | water immersion objective |
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI | Nikon | MRD07602 | water immersion objective |
Congo Red | Merck/Sigma-Aldrich | C6277 | cell wall dye |
Dimethyl sulfoxide | VWR | 8,36,73,230 | organic solvent |
Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit | Nikon | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4 |
Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit | Nikon | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5 |
FM 1-43 | Merck/Sigma-Aldrich | S6814 | membrane dye |
FM 4-64 | Merck/Sigma-Aldrich | S6689 | membrane dye |
Glass beads | Rettberg | 1340691030 | 3 mm glass beads |
Glass cover slips | Thermo Fisher Scientific | BB02400600A113MNT0 | 24 x 60 # 1 glass cover slips |
HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc | Leica | 15506353 | glycerol immersion objective |
LSM 510 Meta | Zeiss | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3 |
M9 Minimal Medium | Merck/Sigma-Aldrich | M6030 | generic fungal growth medium |
Micro-slide 8-well | ibidi | 80826 | ibiTreat #1.5 polymer coverslip |
Miracloth | Merck/Millipore | 475855-1R | polyester filtration material |
Petri dish | Sarstedt | 8,21,472 | 92 x 16 mm culture dish w/o cams |
Phytagel | Merck/Sigma-Aldrich | P8169 | transparent gelling agent |
Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC | Zeiss | 440762-9904-000 | oil immersion objective |
Pontamine Fast Scarlet 4B | Merck/Sigma-Aldrich | 212490 | cell wall dye |
Potato Dextrose Agar (PDA) | BD Difco | 213400 | fungal growth medium for T. atroviride |
Potato Dextrose Broth (PDB) | BD Difco | 254920 | fungal growth medium for T. atroviride |
Reaction tube | Sarstedt | 72,706 | 1.5 mL SafeSeal tube |
Scalpel | B.Braun | 5518016 | Cutfix sterile scalpel #23 |
Screw cap tube | Sarstedt | 6,25,54,502 | 15 mL polypropylene tube |
Solophenyl Flavine 7GFE 500 | CIBA | 1485385V6 | cell wall dye |
SynaptoGreen C4 | Biotum | 70020 | membrane dye |
SynaptoRed C2 | Biotum | 70021 | membrane dye |
Syringe membrane filter | Thermo Fisher Scientific | 723-9945 | 0.45 µm SFCA syringe filter |
TCS SP5 II | Leica | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1 |
Vogel's Minimal Medium (VMM) | FGSC | Fungal Genetics Stock Centre | fungal growth medium for N. crassa |