Hayati floresan boyalar modern mantar hücre biyolojisinde canlı hücre görüntüleme analizleri için gerekli araçlardır. Bu yazıda, filamentöz mantarlarda plazma membran dinamiği, endo-/eksositoz ve hücre duvarı morfogenezinin izlenmesi için kurulmuş ve daha az bilinen floresan boyaların uygulanması ayrıntılı olarak anlatılır.
Mantar hücrelerinde organel dinamiğinin canlı hücre görüntüleme analizleri için membran ve hücre duvarı seçici floresan boyaların uygulanması 20 yıl önce başlamış ve o zamandan beri ipliksi mantar anlayışımıza büyük katkıda bulunmaya devam etmektedir. Yaşam tarzı. Bu kağıt iki membran boyalar FM 1-43 ve FM 4-64 ve dört hücreli duvar lekeleri Calcofluor Beyaz M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 ve Kongo Kırmızı kullanımı için pratik bir kılavuz sağlar. Odak noktası, eser içermeyen boyama, ortak görüntüleme özellikleri ve kantitatif değerlendirmeyi tespit etmek için düşük doz uygulamasıdır. Sunulan yöntemler, açıklanan şekillerde hazırlanabilen tüm ipliksi mantar örnekleri için geçerlidir. Temel boyama yaklaşımları, farklı yetiştirme koşulları gerektirebilecek türlere adaptasyonlar için başlangıç noktası olarak hizmet verebilir. İlk olarak, biyofiziksel ve biyokimyasal özellikleri anlayış gerçekten hayati floresan lekeler olarak bu boyalar kullanmak için gerekli olduğu gibi gözden geçirilir. İkinci olarak, floresan canlı hücre görüntüleme için çeşitli mantar örnek türlerinin hazırlanması ayrıntılı adım adım protokolleri sunulmaktadır. Son olarak, örnek deneyler farklı yaklaşımları göstermektedir: (1) genetik mutantlarda endositozun spatio-temporal organizasyonundaki kusurları belirlemek, (2) GFP etiketli hedef proteinlerin ortak ve farklı eş lokalizasyonunu karşılaştırmalı olarak karakterize etmek endositik yol, (3) genetik mutant morfogenetik hücre duvarı defektleri tanımlamak ve (4) gerçek zamanlı olarak hücre duvarı biyogenezi izlemek.
Yirmi yıl önce, hangi hyphal morfogenez ve altta yatan moleküler hücre biyolojisi filamentöz mantarlar görselleştirilmiş olabilir şekilde membran seçici floresan Fei Mao boya FM 4-641uygulanması ile devrim oldu . Daha sonra, mantar hücre duvar dinamiklerinin hayati floresan belirteci olarak kitin bağlayıcı boya Calcofluor Beyaz yararıgerçekleştirildi 2. O zamandan beri, hem boyalar hem de bunların varyantları mantarlarda organel dinamiklerinin canlı hücre görüntüleme analizlerinin doğal bir parçası haline gelmiştir ve ipliksi mantar yaşam tarzına benzeri görülmemiş içgörüler sağlamaya devam etmektedir. Bu yazıda, filamentöz mantarlarda plazma membran dinamiği, endo- ve eksositoz ve hücre duvarı morfogenezi nin izlenmesi için kurulmuş ve daha az bilinen floresan boyaların uygulanması ayrıntılı olarak anlatılır. Endositon izleme tahlilleri, endositon genel çalışması ile ilgili çeşitli hücre biyolojik soruların ele alınmasını sağlar3. Bunun için FM boya ilavesi üzerine lekeli bölmelerin lokalizasyonu, hızı ve devamı zaman atlamalı mikroskopi ile kaydedilir ve test edilen mantar suşları arasında nicel olarak karşılaştırılır4. Hücre duvar boyaları hücrenin dış sınırını çizgive polarize hiphal uç büyüme 2 dahil olmak üzere morfogenetik olayların izlenmesine izin,hiphal dallanma5, hyphal füzyon6,7 ve septum oluşumu8. Ayrıca lokalize hücre duvarı birikiminin sayısallaştırılmasını ve hücre duvarı biyogenezi sırasında kusurların belirlenmesini kolaylaştırın9. Herhangi bir floresan belirteç biyokimyasal ve biyofiziksel özellikleri ayrıntılı bilgi onun başarılı in vivo uygulaması için temel bir ön koşul olduğundan, bu özellikleri ilk bu makalede özellikli altı boyalar için özetlenmiştir.
Membran selektif boyalar
FM (Fei Mao) styryl boyalar geçemeyen ama biyolojik membranların lipid çift katmanlı dış broşür ile geri dönülmez küçük amfilikmoleküller10. Onlar sulu çözeltide hemen hemen floresan olmayan, ancak plazma membran entegrasyonu üzerine yoğun floresan hale, mükemmel sinyal-to-gürültü üreten (S / N)-oranları11. Bu özellikler onları ideal plazma membran ve hücre içi organel dinamikleri görselleştirmek için uygun hale, endo izleme de dahil olmak üzere- ve eksoz12. Yeşil floresan FM 1-43 ve kırmızı floresan FM 4-64 bu amaçlar için en yaygın olarak kullanılan iki floresan membran belirteçleridir. SynaptoGreen C4 ve SynaptoRed C2, sırasıyla FM 1-43 ve FM 4-64 yerine birbirinin yerine kullanılabilen alternatif tedarikçilerden gelen jenerik moleküllerdir.
Styryl boyalar üç önemli yapısal bölgeden oluşur: (1) boyanın lipid çift katmanlı içine yerleştirilmesini kolaylaştıran lipophilic kuyruk, (2) boyanın spektral özelliklerini belirleyen ve bir ila üç çift bağ ile birbirine bağlanmış iki aromatik halkadan oluşan florofor çekirdeği ve (3) boyanın membrandan tam olarak takılmasını ve permeasyonunu engelleyen pozitif yüklü hidrofilik kafadan oluşur (Şekil 1A).
Uzun lipophilic kuyruk, yüksek boya hidrofobiklik ve böylece membrana yakınlık bağlayıcı, ama alt su çözünürlüğü ve membran de-boyama oranı. Sonuç olarak, farklı FM boya çeşitleri farklı boyama dinamiği ve desenleri üretir. C4 kuyruklu FM 1-43’ün yüksek hidrofobikliği, equimolar konsantrasyonlarda uygulandığında plazma zarlarında ve iç organellerde daha hızlı bir şekilde daha güçlü ve daha kararlı floresan sinyali sağlar 4-64 kısa C2 kuyruklu FM 4-64’ten daha hızlıdır (Şekil 2).
Daha da önemlisi, her iki FM boyasının11’in insaedilen sabit ve yüksek ilişkilendirme/ayrışma oranları, her bir boya molekülü 13’ün ortalama tutma süreleri13’ün membran işlevinin lokalize bozulması olasılığını azaltır, örneğin membran akışkanlığının modifikasyonu veya membran proteinlerinin zorunlu kalıcı etkileşimi yoluyla. Bu moleküllerin hayati boyalar olarak kullanılabilmesinin en önemli nedeni muhtemelen budur. Bununla birlikte, 50 μM üzerindeki FM boya konsantrasyonları mantar ve bitkihücreleri2,14için toksiktir ve BY-2 tütün protoplastlarından elde edilen kanıtlar 20’den fazla mM FM boyanın plazma membran doygunluğu14’e yol gösterdiğini göstermektedir. Bu nedenle, özellikle mükemmel görüntüleme gibi az 2-5 μM15,16ile elde edilmiş olduğu göz önüne alındığında, bu sınırı aşmamak tavsiye edilir.
Özellikle, FM boyalarının spektral özellikleri belirli membran mikroortamına bağlı olarak büyük ölçüde değişir (gözden14). Genel olarak, saf çözücü çözeltilerde FM boyalarının uyarma ve emisyon spektrumları (genellikle ürün bilgilerinde belirtildiği gibi) hücresel ortamlardan önemli ölçüde farklıdır ve çoğu durumda canlı hücre görüntüleme ayarlarını seçmek için doğrudan danışılamaz. Örneğin FM 1-43 ve FM 4-64’ün uyarma/emisyon maksimması, metanoldeki çözümlerine göre mantar membranlarına bağlandığında sırasıyla 37/46 nm ve 43/64 nm ile mavi ye kaydırılır hale gelir (Tablo 1).
FM 4-64 ve FM 1-43’ün plazma zarını, endo-/exositozisin ve spitzenkörper ve mitokondri dahil organel dinamiklerinin izlenmesi için temel leri, daha önce2,4,17,18,19filamentöz mantar türlerinin geniş bir yelpazesi için kapsamlı bir şekilde belgelenmiştir. Çeşitli ipliksi mantar türlerinde çalışan her iki FM boyası için önerilen görüntüleme ayarları Şekil 1B’degösterilmiştir. Ancak, mevcut ekipmanın veya kültür ortamı, pH veya sıcaklık gibi belirli hücresel ve deneysel koşulların teknik sınırlamaları bazı adaptasyonlar gerektirebilir. Neyse ki, FM boyalar geniş bir spektral aralıkta çalışır ve çok iyi görüntüleme sonuçları heyecan verici FM 1-43 ile elde edilir 514 nm veya FM 4-64 ile 488 nm. Sonuç olarak, her örnek türü ve amaçlanan uygulama için en uygun görüntüleme ayarları ayrı ayrı belirlenmelidir.
Stoke’un 135 nm’den fazla FM 4-64’ün yer değiştirmesi, yeşil ışık yayan floroforlarla mükemmel, eşzamanlı ortak görüntüleme sağlar; bu sık sık plazma membran ve endositik yol9,20göre yeşil floresan protein (GFP) etiketli füzyon proteinlerin hücre içi lokalizasyon dinamikleri değerlendirmek için yararlanılır.
Hücre duvarı seçici boyalar
Calcofluor White M2R (CFW), ayrıca Floresan Parlatıcı 28 olarak pazarlanan, muhtemelen bakterilerin hücre duvarları leke için kullanılan en iyi bilinen floresan boya, mantar, yosun, yüksek bitki ve böcekler. Başlangıçta kağıt, tekstil ve deterjan sektöründe optik beyazlatma ajan olarak kullanılan, mantar enfeksiyonlarıklinik tanı için faydaları erken gerçekleştirildi21,22. CFW geri dönüşümsüz olarak yeni doğan kitin zincirine müdahale ettiği için hücre duvarı biyogenezi sırasında normal kitin mikrofibril montajını bozar ve hücre duvarı stresi oluşturur23. Bu sırayla glukan ve chitin synthase aktivasyonu 24 ,25sonucu olarak yerelolarak yükseltilmiş hücre duvarı birikimine yol açan bir hücre duvarı hasar onarım mekanizması tetikler . Bu fenomen hücre duvar polimerlerine uygun şekilde bağlanarak çalışan herhangi bir boya ile oluşabilir, konsantrasyona bağlıdır ve en çok misel in en verimli büyümesini ve dolayısıyla en hassas kısımlarını temsil eden hyphal uçlarında fark edilir (Şekil 3). Hücre duvarı hasarına yanıt veren moleküler makinenin kapsamlı bir özeti son zamanlarda26sağlanmıştır.
Fototoksisite ile birlikte aşırı boya hyphal kompartmanlarının hızlı hücre lizisine yol açabilir(Film 1). Bununla birlikte, yabani tip “hayati” olan boya konsantrasyonlarına karşı artan duyarlılık, işlevsiz mutantların hücre duvarı biyosentezindeki kusurları belirlemek için kullanılabilir9. CFW ve Kongo Kırmızısı (CR) için, Direct Red 28 olarak da bilinen ve mantar ve böcekler için α ve β-kitin spesifik hücre duvarı lekesi olarak kullanılan başka bir tekstil renklendiricisi27,28, chitin sintazları kuvvetle indükleyen eşik konsantrasyonları > 60 μM CFW ve > 70 μM CR, sırasıyla, konsantrasyonları <15 μM ya boya değiştirmek veya mantar büyümesini inhibe etmedi29,30,31. Hickey ve ark. CFW için bu eşik konsantrasyonu 25 μM2yerleştirilir. Bu nedenle, boya konsantrasyonları ≤ 5 μM strese bağlı eserler dışlamak ve gerçekten “hayati floresan boyalar”2,32olarak bu moleküllerin kullanılmasını sağlamak için kullanılması tavsiye edilir. Bu eşit Solophenyl Flavine 7GFE 500 (SPF) ve Pontamine Fast Scarlet 4B (PFS), Direct Yellow 86 ve Direct Red 23, sırasıyla, mantar için uygulama daha on yıl önce 33 önce ilk kez bildirilmiştir diğer iki yararlı hücreli duvar boyaları eşanlamlı için geçerlidir33. Ama onların olağanüstü spektral özellikleri rağmen34,35, her iki boya kullanımı o zamandan beri çok sınırlı olmuştur36,37. Daha önce 1,5 μM CFW2için gösterildiği gibi, 2 μM SPF çok yüksek zamansal çözünürlük(Film 2)ile yerel koşullar altında hücre duvarı dinamikleri çözmek için yeterlidir. Aynı sonuçlar 2 μM CR veya PFS ile elde edilebilir.
Bu dört boya, CFW, SPF, PFS ve CR birlikte, modern floresan mikroskoplarda kullanılan neredeyse tam görünür emisyon ışık spektrumu (400-700 nm) kapsayan bir dizi hücre duvarı seçici floresan belirteçleri içerir (Şekil 4). Hücre duvarı polimerlerine bağlanma üzerine floresan yoğunluğundaki önemli artış dört polimerin de doğasında vardır ve mükemmel S/N oranları oluşturur. Bu sırayla boya konsantrasyonları ve uyarma ışık yoğunluğu çok düşük tutmak için izin verir ve “düşük doz” canlı hücre görüntüleme tekniği2olarak hücre duvarı boyama gerçekleştirmek için izin verir. Bu hücre duvar boyaları plazma zarı geçirimsiz olduğundan, aynı anda canlı/ölü lekeleri olarak işlev görürler. Özellikle, onların son derece geniş emisyon ışık spektrumları nedeniyle, diğer floroforlar ile CFW ve SPF co-görüntüleme özellikleri ile ilgili bazı sınırlamalar dikkatle dikkate alınması gerekir.
Bu makale, 2000’li yılların başında filamentöz mantarlar için hayati organel belirteçleri olarak çeşitli floresan boyaların kullanımını kuran çığır açan çalışmalar devam ediyor2,4,43, ve FM boyaları ve seçilen hücre duvar boyaları fotofizik ve hücre biyolojik özelliklerini daha önce daha ayrıntılı olarak tartışmak için çalışır. Özellikle zar doygunluğu veya hücre duvarı hasarı gibi istenmeyen hücresel etkiler açısından, belirli boya konsantrasyonlarının üzerinde meydana gelir. Daha önce hücresel düzeyde toksik olmayan olarak kabul edilen şey artık moleküler düzeyde toksik olarak kabul edilir. Bu etkiler çok ince ve organel veya hücre davranışı bariz değişiklikler ile doğrudan belirgin olmasa da, görselleştirme dışında boya uygulaması herhangi bir olası girişim yerli moleküler fonksiyonun araştırılması için en aza indirilmelidir. Neyse ki, silikon çığ fotodiyot dedektörleri (Si-APDs)44 veya Airyscan alan dedektörü45gibi modern dedektörlerin geliştirilmiş hassasiyet ve kuantum verimliliği, eskisinden daha düşük boya miktarları kullanımını kolaylaştırmak. Makalenin bir diğer önemli amacı diğer floroforlar ile bu boyaların ortak görüntüleme özellikleri örneklemekiçin, en önemlisi, biyolojide en sık kullanılan floresan protein olarak GFP olanlar. Bu, floresan füzyon proteinlerinin hücre altı lokalizasyon dinamiklerini mantar hücre duvarı, plazma zarı veya endo ve eksositoz yolu vb. ile ilişkilendirmeyi amaçlayan görüntüleme deneylerinin tasarımına yardımcı olmalıdır.
Doğal ve stressen koşullar altında görüntüleme, güvenilir verilerin elde edilmesi nde anahtar dır. Kültür ortamı ve numune hazırlama ile ilgili bazı pratik hususlar, herhangi bir örnek için mümkün olan en yüksek S/N oranına sahip sağlıklı, stressiz hücrelerin esersiz, uzun süreli gözlemine olanak tanıyan en uygun koşulları bulmak için bir başlangıç noktası sağlamayı amaçlamaktadır. Güvenilir ve anlamlı görüntüleme sonuçlarına ulaşmanın evrensel bir yolu yoktur. Numunenin biyolojik varyasyonunun, mikroskobikin öznelliğinin ve beklentilerinin yanı sıra görüntü sonrası işlemenin sırasıyla veri toplama ve yorumlama üzerinde önemli bir etkisi olduğu yaklaşımına doğaldır. Bu nedenle, mikroskobik canlının pratik deneyimi, araştırılan mantarın hücre biyolojisi hakkındaki samimi bilgisi ve laboratuvar ortamında mümkün olduğunca ‘doğal’ ve mümkün olduğunca rahatsız edilmeyen koşullar yaratmak için usta örnek hazırlanması, incelenen hücresel fenomenleri doğru bir şekilde yansıtan görüntüleme verilerinin elde edilmesi ve değerlendirilmesi için çok önemlidir. Başparmak bir kural olarak, floresan boyalar istenmeyen yan etkilerin oluşumu, ince ve böylece plazma membran veya hücre duvarı yeniden modelleme stres yanıt yollarının görünür olmayan aktivasyon hücre otoliz basit sitotoksik indüksiyon arasında değişen, sadece güvenli düşük boya konsantrasyonları uygulanarak önlenebilir ≤2 μM.
Floresan boyaların uygulanması basittir, ancak özellikleri kötü karakterizedir. Floresan boyalar kullanmanın önemli bir gücü deneysel protokollerin preparatif basitliğidir. Mantarın yetiştirilmesi ve örneklemesi, boyanın eklenmesi ve mikroskop aşamasına monte edilebistir (pratik olarak) basittir. Uyarma ve emisyon dalga boyları, maruz kalma süreleri, zaman kursu ayarları vb. gibi temel görüntüleme ayarlarının ayarlanması, mikroskobun basit biyofiziksel kurallarına ve kullanılan floresan boyaların hücrelerin içindeki biyolojik kurallarına uyar. Tablo 1, deney için en uygun boya veya boya kombinasyonunun tanımlanmasını desteklemeyi amaçlamaktadır. Ayrıca, floresan boyalar makul fiyatlı, güvenilir yüksek kalite ile hazır ve böylece son derece tekrarlanabilir uygulama sağlamak.
Membran veya hücre duvarı seçici floresan boyalar kullanarak iki önemli kısıtlamalar (genellikle) onların hassas boyama özellikleri sınırlı bilgi, çoğu durumda organel ve moleküler düzeyde non-spesifik olan, ve konsantrasyona bağlı istenmeyen yan etkileri. FM boyalar endo- ve eksozis katılan lipid bilayers için spesifiktir. Ancak, tam olarak hangi hücre altı organelleri test edilen koşullar altında art arda etiketlenir hale hemen belirgin değildir ve farklı FM boya türevlerinin karşılaştırılması nı gerektirir, ve ek organel özgü belirteçleri ile co-etiketleme. FM 1-43’ün mitokondriyal membranlar için tercihi, FM 4-64’e göre bir örnektir. Hücre duvarı seçici boyalar mantar hücre duvarının üç ana polimerler için değişen özgüllük görüntüler. CFW’nin β-glukanlar ve kitinler için spesifik olmayan bir leke olduğu düşünülmektedir, SPF β-1,4-glukanlar için en seçici olduğu düşünülmektedir ve CR’nin α- ve β-kitinler için son derece seçici olduğu düşünülmektedir. PfS’nin mantar hücre duvarı polisakkaritlerine bağlanma özgüllüğü hakkında bilgi şu anda mevcut değildir. Araştırılan mantar türlerinde belirli bir boya konsantrasyonunda hangi mantar hücreli duvar polimerinin en etkili şekilde etiketlendiği oranı kolayca cevaplanmaz ve diğer organizmalarda veya diğer mantar türlerinde in vitro veya in vivo elde edilen detaylı ölçümlerin uygulanması çok dikkatli bir şekilde düşünülmelidir. Ne yazık ki, bu bilgiler seyrek ve son derece literatürde dağınık35,42,46. Özellikle mantarlarda öne çıkan boyaların kesin boyama özelliklerine dair yeni bilgiler sağlamak için önceki çalışmalarda 33’ü takip edecek daha yeni kayıtlar şu anda mevcut değildir.
Görüntüleme kontrolleri boyama desenleri ve hücresel yanıtları doğru değerlendirmek için gereklidir. Muhtemelen en zor kısmı, ancak, o kadar iyi membran ve hücre duvarı seçici floresan boyalar, hücresel mimari veya hiphal büyüme deseni değişiklikler in subsellüler lokalizasyonu nda kaydedilen değişiklikler sadece ve güvenle deneysel tedavinin amaçlanan etkileri ile ilgili olabilir mantar hücre biyolojisi bilmektir. Bunun için, herhangi bir yeni canlı hücre görüntüleme deneyyanında iyi kontroller olması çok önemlidir. Bunlar, arka plan otofloresanve dedektör gürültüsünü elde edilen görüntüden dışlamak ve mutantlarla çalışırken morfolojik bir karşılaştırıcıya sahip olmak için negatif görüntüleme kontrolü olarak tedavi edilmemiş yabani türü içerir. Ayrıca, pozitif görüntüleme kontrolü, örneğin sitoplazmada GFP veya RFP’yi ifade eden bir suş veya başka bir iyi bilinen floresan belirteç proteini, uyarma ışık yoğunluğunu gerekli minimuma ayarlamak ve hücre canlılığı kontrolüne sahip olmak için gereklidir. Bu kontroller ayarlandıktan sonra, floresan boyaların kullanımı sadece görselleştirme görevleri ile sınırlı değildir, ancak konsantrasyona bağlı boyama dinamikleri ve konsantrasyona bağlı yan etkiler analitik olarak kullanılabilir; örneğin, hücre duvarı biyosentezinin gerçek zamanlı olarak kantitatif olarak izlenmesi veya mutanta özgü fenotiplerin duyarlılık tasimi47olarak tanımlanması için.
Gelecekteki gelişmiş uygulamalar boya boyama özelliklerinin ayrıntılı fonksiyonel analizlerine bağlıdır. Devam eden önemli bir sorun, filamentöz mantarlarda membran ve hücre duvarı seçici floresan boyaların hücre altı dinamiklerinin fonksiyonel değerlendirmesini ilerletmek için nicel görüntü analizlerini daha da geliştirmek ve otomatikleştirmektir. Bunun için, bilinen organel ve hücre duvarı polimer belirteçleri ile bilinen organel ve hücre duvarı polimer belirteçleri ile bu boyaların kapsamlı, nicel ko-lokalizasyon çalışmaları belirli taşıma yolları eksik mutant suşları ile birlikte ya da belirli yapısal bileşenleri eksikliği ilk gereklidir. FM boyaları ile karşılaştırmalı analizler için çeşitli endositoz belirteçleri mevcuttur48,49, ve mantarhücre duvar boyaları hala kötü karakterize bağlayıcı özellikleri ile ilgili olarak, floresan etiketli glukan özgü antikorların uygulanması50 bu sorunu çözmek için bir olasılık sağlayabilir.
The authors have nothing to disclose.
Teşekkür Tirol Bilim Fonu (TWF) AL hibe #256524 sağlamak için, Viyana Bilim ve Teknoloji Fonu (WWTF) SZ hibe #LS13-086 sağlamak için ve Açık erişim yayın desteklemek için Innsbruck Üniversitesi Yayın Fonu nedeniyle vardır. Yazarlar ayrıca Leica TCS SP5 II konfokal lazer tarama mikroskobu sağlamak için Innsbruck Üniversitesi Zooloji Bölümü teşekkür ederiz.
BRAND cell counting chamber | Merck | BR718005 | Thoma format |
Calcofluor White M2R | Merck/Sigma-Aldrich | F3543 | cell wall dye |
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI | Nikon | MRD07602 | water immersion objective |
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI | Nikon | MRD07602 | water immersion objective |
Congo Red | Merck/Sigma-Aldrich | C6277 | cell wall dye |
Dimethyl sulfoxide | VWR | 8,36,73,230 | organic solvent |
Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit | Nikon | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4 |
Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit | Nikon | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5 |
FM 1-43 | Merck/Sigma-Aldrich | S6814 | membrane dye |
FM 4-64 | Merck/Sigma-Aldrich | S6689 | membrane dye |
Glass beads | Rettberg | 1340691030 | 3 mm glass beads |
Glass cover slips | Thermo Fisher Scientific | BB02400600A113MNT0 | 24 x 60 # 1 glass cover slips |
HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc | Leica | 15506353 | glycerol immersion objective |
LSM 510 Meta | Zeiss | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3 |
M9 Minimal Medium | Merck/Sigma-Aldrich | M6030 | generic fungal growth medium |
Micro-slide 8-well | ibidi | 80826 | ibiTreat #1.5 polymer coverslip |
Miracloth | Merck/Millipore | 475855-1R | polyester filtration material |
Petri dish | Sarstedt | 8,21,472 | 92 x 16 mm culture dish w/o cams |
Phytagel | Merck/Sigma-Aldrich | P8169 | transparent gelling agent |
Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC | Zeiss | 440762-9904-000 | oil immersion objective |
Pontamine Fast Scarlet 4B | Merck/Sigma-Aldrich | 212490 | cell wall dye |
Potato Dextrose Agar (PDA) | BD Difco | 213400 | fungal growth medium for T. atroviride |
Potato Dextrose Broth (PDB) | BD Difco | 254920 | fungal growth medium for T. atroviride |
Reaction tube | Sarstedt | 72,706 | 1.5 mL SafeSeal tube |
Scalpel | B.Braun | 5518016 | Cutfix sterile scalpel #23 |
Screw cap tube | Sarstedt | 6,25,54,502 | 15 mL polypropylene tube |
Solophenyl Flavine 7GFE 500 | CIBA | 1485385V6 | cell wall dye |
SynaptoGreen C4 | Biotum | 70020 | membrane dye |
SynaptoRed C2 | Biotum | 70021 | membrane dye |
Syringe membrane filter | Thermo Fisher Scientific | 723-9945 | 0.45 µm SFCA syringe filter |
TCS SP5 II | Leica | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1 |
Vogel's Minimal Medium (VMM) | FGSC | Fungal Genetics Stock Centre | fungal growth medium for N. crassa |