Vitale fluorescerende kleurstoffen zijn essentiële hulpmiddelen voor Live-celbeeldvormings analyses in moderne schimmel celbiologie. Dit papier Details de toepassing van gevestigde en minder bekende fluorescerende kleurstoffen voor het volgen van plasma membraan dynamiek, Endo-/exocytose en celwand morfogenese in filamenteuze schimmels.
De toepassing van selectieve fluorescerende kleurstoffen voor membraan-en celwand voor Live-celbeeldanalysen van organel dynamiek in schimmelcellen begon twee decennia geleden en blijft sindsdien sterk bijdragen aan ons begrip van de filamenteuze schimmel Levensstijl. Dit papier biedt een praktische gids voor het gebruik van de twee membraan kleurstoffen FM 1-43 en FM 4-64 en de vier celwand vlekken Calcofluor wit M2R-, Solophenyl flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 en Congo rood. De focus ligt op hun lage-dosis toepassing om artefact vrije kleuring, hun co-beeldvormings eigenschappen en hun kwantitatieve evaluatie vast te stellen. De gepresenteerde methoden zijn van toepassing op alle filamenteuze schimmel monsters die op de beschreven manieren kunnen worden bereid. De fundamentele kleurings benaderingen kunnen dienen als uitgangspunt voor aanpassingen aan soorten die mogelijk verschillende teeltomstandigheden vereisen. Ten eerste worden biofysische en biochemische eigenschappen beoordeeld omdat hun begrip essentieel is voor het gebruik van deze kleurstoffen als echt vitale fluorescerende vlekken. Ten tweede worden stapsgewijze protocollen gepresenteerd die de voorbereiding van verschillende soorten schimmel monsters voor fluorescerende Live-celbeeldvorming gedetailleerd weergeven. Ten slotte illustreren voorbeeld experimenten verschillende benaderingen voor: (1) identificeren van gebreken in de spatio-temporele organisatie van endocytose in genetische mutanten, (2) relatief karakteriseren gedeelde en duidelijke co-lokalisatie van GFP-gelabelde doel eiwitten in het endocytische traject (3) identificeren morfogenetische celwand defecten in een genetische Mutant, en (4) monitor Cell Wall biogenese in real time.
Twintig jaar geleden werd de manier waarop hyphal morfogenese en de onderliggende moleculaire celbiologie konden worden gevisualiseerd in filamenteeuze schimmels geregiseerd door de toepassing van het membraan selectieve fluorescerende Fei Mao Dye FM 4-641. Later, het voordeel van de chitin-bindende kleurstof Calcofluor wit als vitale fluorescerende marker van schimmel celwand dynamiek werd gerealiseerd2. Sindsdien zijn zowel kleurstoffen als varianten daarvan een inherent onderdeel geworden van Live-celbeeldvormings analyses van organel dynamiek in schimmels en blijven ze ongekende inzichten bieden in de filamenteuze schimmel levensstijl. Dit papier Details de toepassing van gevestigde en minder bekende fluorescerende kleurstoffen voor het volgen van plasma membraan dynamiek, Endo-en exocytose en celwand morfogenese in filamenteuze schimmels. Endocytose tracking assays kunnen verschillende cel biologische vragen met betrekking tot de algemene studie van endocytose worden aangepakt3. Hiervoor wordt de lokalisatie, snelheid en opeenvolging van bevlekte compartimenten bij toevoeging van FM-kleurstof opgenomen door tijdsverloop microscopie en kwantitatief vergeleken tussen de geteste schimmel stammen4. Celwand kleurstoffen afbakenen de buitenste grens van de cel en laten het volgen van morfogenetische gebeurtenissen toe, waaronder gepolariseerde hyphal Tip groei2, hyphal vertakkingen5, hyphal Fusion6,7 en septum formatie8. Bovendien vergemakkelijken ze de kwantificering van gelokaliseerde celwand depositie en de identificatie van defecten tijdens celwand biogenese9. Omdat gedetailleerde kennis van de biochemische en biofysische eigenschappen van een fluorescerende marker een fundamentele voorwaarde is voor de succesvolle in vivo toepassing, worden deze kenmerken voor het eerst samengevat voor de zes kleurstoffen die in dit artikel worden vermeld.
Membraan selectieve kleurstoffen
FM (Fei Mao) styryl kleurstoffen zijn kleine amfifiele moleculen die niet kunnen passeren maar omkeerbaar associëren met de buitenste bijsluiter van de lipide dubbellaagse van biologische membranen10. Ze zijn vrijwel niet-tl-licht in waterige oplossing, maar worden intens fluorescerend bij de integratie van plasma membraan, waardoor uitstekende signaal-ruis (S/N)-verhoudingen11worden gegenereerd. Deze eigenschappen maken ze bij uitstek geschikt voor het visualiseren van plasma membraan en intracellulaire organel dynamiek, inclusief het volgen van Endo-en exocytose12. De groen-fluorescerende FM 1-43 en de rood-fluorescerende FM 4-64 zijn voor deze doeleinden de twee meest gebruikte fluorescerende membraan markers. SynaptoGreen C4 en SynaptoRed C2 zijn generieke moleculen van alternatieve leveranciers die onderling verwisselbaar kunnen worden gebruikt in plaats van FM 1-43 en FM 4-64, respectievelijk.
Styryl kleurstoffen bestaan uit drie belangrijke structurele gebieden: (1) de lipofiele staart die het inbrengen van de kleurstof in de lipide dubbellaag vergemakkelijkt, (2) de de-kern die de spectrale eigenschappen van de kleurstof bepaalt en wordt gevormd door twee aromatische ringen die met één tot drie dubbele bindingen zijn verbonden, en (3) de positief geladen hydrofiele kop die volledige inbrenging en permeatie van de kleurstof door het membraan voorkomt (Figuur 1a).
Hoe langer de lipofiele staart, hoe hoger de hydrofobiciteit van de kleurstof en dus een bindende affiniteit met het membraan, maar hoe lager de oplosbaarheid in water en de membraan ontkleurings graad. Daardoor produceren verschillende FM-kleurstof varianten verschillende kleurings dynamiek en-patronen. De hogere hydrofobiciteit van de C4-tailed FM 1-43 zorgt voor een sterker en stabieler fluorescentie signaal bij plasma membranen en inwendige organellen sneller dan de kortere C2-tailed FM 4-64, wanneer toegepast bij equimolaire concentraties (Figuur 2).
Belangrijk is dat de constante en hoge associatie/dissociatie percentages van beide FM-kleurstoffen11 met gemiddelde retentietijden van 1 – 6 s per individuele kleurstof molecuul13 de kans op gelokaliseerde verstoring van de membraan functie verminderen, bijvoorbeeld door de modificatie van membraan vloeibaarheid of geforceerde permanente interactie van membraan eiwitten. Dit is waarschijnlijk de belangrijkste reden waarom deze moleculen kunnen worden gebruikt als vitale kleurstoffen. Niettemin, FM-kleurstof concentraties boven 50 μM zijn giftig voor de schimmel-en plantencellen2,14, en bewijs van de door-2 tabak protoplasten geeft aan dat meer dan 20 μM FM-kleurstof leidt tot verzadiging van het plasma membraan14. Daarom is het raadzaam om deze limiet niet te overschrijden, vooral gezien het feit dat uitstekende beeldvorming is bereikt met slechts 2 – 5 μM15,16.
Met name de spectrale eigenschappen van FM-kleurstoffen variëren sterk afhankelijk van de specifieke membraan-micro omgeving (beoordeeld14). Over het algemeen verschillen excitatie-en emissiespectra van FM-kleurstoffen in oplossingen van zuiver oplosmiddel (zoals gewoonlijk vermeld in de productinformatie) significant van die in cellulaire omgevingen en kunnen ze in de meeste gevallen niet direct worden geraadpleegd voor het selecteren van instellingen voor Live-celbeeldvorming. De excitatie/emissiemaxima van FM 1-43 en FM 4-64 worden bijvoorbeeld blauw-verschoven met respectievelijk 37/46 nm en 43/64 nm, wanneer gebonden aan schimmel membranen in vergelijking met hun oplossingen in methanol (tabel 1).
De baanbrekende Fundamentals voor het gebruik van FM 4-64 en FM 1-43 voor het volgen van plasma membraan, Endo-/exocytose en organel dynamiek, waaronder de spitzenkörper en mitochondriën, zijn al uitvoerig gedocumenteerd voor een breed scala aan filamenteuze schimmelsoorten eerder2,4,17,18,19. Aanbevolen beeldvormings instellingen voor beide FM-kleurstoffen die in verschillende filamenteuze schimmelsoorten werken, worden afgebeeld in Figuur 1b. Technische beperkingen van de beschikbare apparatuur of specifieke cellulaire en experimentele omstandigheden, zoals kweekmedium, pH of temperatuur, kunnen echter enkele aanpassingen vergen. Gelukkig werken FM-kleurstoffen over een breed spectrum bereik, en zeer goede beeldvormende resultaten worden bereikt door spannende FM 1-43 met 514 nm of FM 4-64 met 488 nm. Bijgevolg moeten de optimale beeldvormings instellingen voor elk type monster en de beoogde toepassing afzonderlijk worden bepaald.
De aanzienlijke verschuiving van het Stoke-over van meer dan 135 nm van FM 4-64 zorgt voor uitstekende gelijktijdige co-Imaging met fluoroforen die groen licht uitstralen; Dit wordt vaak benut om de intracellulaire lokalisatie dynamiek van groene fluorescerende eiwitten (GFP)-gelabelde fusie-eiwitten ten opzichte van het plasma membraan en de endocytische pathway9,20te evalueren.
Celwand-selectieve kleurstoffen
Calcofluor White M2R-(CFW), ook op de markt gebracht als fluorescerende Brightener 28, is waarschijnlijk de bekendste fluorescerende kleurstof die wordt gebruikt om de celwanden van bacteriën, schimmels, algen, hogere planten en insecten te vlekken. Aanvankelijk gebruikt als optische bleken agent in de papier-, textiel-en detergentenindustrie, de voordelen voor de klinische diagnose van schimmelinfecties werd vroeg gerealiseerd op21,22. Omdat CFW onherroepelijk in de ontluikende chitine-keten intercalates, verstoort het normale chitine microfibril assemblage tijdens celwand biogenese waardoor celwand stress23wordt gegenereerd. Dit activeert op zijn beurt een celwand schade herstelmechanisme dat leidt tot lokaal verhoogde celwand depositie als het resultaat van glucan en chitine synthase activatie24,25. Dit fenomeen kan voorkomen bij elke kleurstof die werkt door stabiel te binden aan celwand polymeren, is concentratie-afhankelijk en is het meest merkbaar bij hyphal-tips die de meest productieve groei en dus de meest gevoelige delen van het mycelium vertegenwoordigen (Figuur 3). Een uitgebreide samenvatting van de moleculaire machine die reageert op celwand schade is onlangs verstrekt26.
Overdosed Dye in combinatie met fototoxiciteit kan leiden tot snelle cellyse van hyphal compartimenten (film 1). Niettemin, verhoogde gevoeligheid voor kleurstof concentraties die “vitale” in het wild type zijn kunnen worden benut om gebreken in celwand biosynthese van gen verlies-van-functie mutanten9identificeren. Voor CFW en Congo rood (CR), een andere textiel kleurstof ook bekend als direct Red 28 en gebruikt als α-en β-chitine-specifieke celwand vlek voor schimmels eninsecten 27,28, drempelconcentraties die sterk induceren chitine synthases zijn vastgesteld met > 60 μm CFW en > 70 μM CR, terwijl concentraties <15 μm van beide kleurstof niet veranderen of schimmelgroei remmen29,30,31. Hickey et al. plaatste deze drempel concentratie voor CFW bij 25 μM2. Daarom is het raadzaam om kleurstof concentraties ≤ 5 μM te gebruiken om stressgerelateerde artefacten uit te sluiten en ervoor te zorgen dat deze moleculen als echt “vitale fluorescerende kleurstoffen”2,32worden gebruikt. Dit geldt evenzeer voor Solophenyl flavine 7GFE 500 (SPF) en Pontamine Fast Scarlet 4B (PFS), synoniem aan directe gele 86 en direct Red 23, respectievelijk twee andere nuttige celwand kleurstoffen waarvan de toepassing voor schimmels is gemeld voor de eerste keer meer dan een decennium geleden33. Maar ondanks hun opmerkelijke spectrale eigenschappen34,35, is het gebruik van beide kleurstoffen sindsdien zeer beperkt36,37. Zoals eerder getoond voor 1,5 μM CFW2, 2 μm SPF volstaan om de celwand dynamiek onder inheemse omstandigheden op te lossen met een zeer hoge temporele resolutie (film 2). Dezelfde resultaten kunnen worden verkregen met 2 μM CR of PFS.
Samen vormen deze vier kleurstoffen, CFW, SPF, PFS en CR, een set celwand-selectieve fluorescentie markers die bijna het volledige zichtbare emissie Lichtspectrum (400 – 700 nm) beslaan dat wordt gebruikt op moderne fluorescerende microscopen (Figuur 4). De significante toename van de intensiteit van de fluorescentie bij binding aan celwand polymeren is inherent aan alle vier en genereert uitstekende S/N-verhoudingen. Dit op zijn beurt toelaat om kleurstof concentraties en excitatie lichtintensiteit zeer laag te houden en maakt het mogelijk om celwand kleuring als “lage dosis” Live-Cell Imaging techniek2uit te voeren. Omdat deze celwand kleurstoffen plasma membraan ondoorbaar zijn, functioneren ze tegelijkertijd als levende/dode vlekken. Met name vanwege hun extreem brede emissie lichtspectra, moeten sommige beperkingen met betrekking tot de co-Imaging eigenschappen van CFW en SPF met andere fluor Foren zorgvuldig worden overwogen.
Dit artikel gaat verder met het baanbrekende werk dat het gebruik van verschillende fluorescerende kleurstoffen als vitale organel markers voor filamenteuze schimmels in de vroege jaren 20002,4,43, en pogingen om de photophysical en cel biologische eigenschappen van FM-kleurstoffen en geselecteerde celwand kleurstoffen in meer detail dan voorheen te bespreken. Vooral met betrekking tot ongewenste cellulaire effecten, zoals membraan verzadiging of celwand schade, die boven bepaalde kleurstof concentraties optreden. Wat eerder is beschouwd als niet-toxisch op cellulair niveau wordt nu beschouwd als giftig op moleculair niveau. Hoewel deze effecten zeer subtiel kunnen zijn en niet direct zichtbaar zijn door duidelijke veranderingen in organel-of Celgedrag, moet elke mogelijke interferentie van de kleurstof toepassing dan visualisatie worden geminimaliseerd voor het onderzoek naar de inheemse moleculaire functie. Gelukkig vergemakkelijkt een verbeterde gevoeligheid en kwantum efficiëntie van moderne detectoren, zoals silicium lawine fotodiode detectoren (si-Apd’s)44 of de Airyscan area detector45, het gebruik van nog lagere kleurstof bedragen dan voorheen. Een ander belangrijk doel van het artikel is het illustreren van de co-Imaging eigenschappen van deze kleurstoffen met andere fluor Foren, vooral, die van GFP als de meest gebruikte fluorescerende eiwitten in de biologie. Dit moet helpen bij het ontwerp van Imaging experimenten die gericht zijn op het correleren van de subcellulaire lokalisatie dynamiek van fluorescerende fusie eiwitten aan die van de schimmel celwand, het plasma membraan of de Endo-en exocytose pathway enz.
Beeldvorming onder natuurlijke en stressvrije omstandigheden is essentieel voor het verwerven van betrouwbare gegevens. Enkele praktische overwegingen met betrekking tot kweekmedium en monstervoorbereiding zijn gericht op het bieden van een uitgangspunt voor het vinden van de optimale omstandigheden die een artefact vrije, lange tijd observatie van gezonde, onbeklemtoonde cellen mogelijk maken met de hoogst mogelijke S/N-ratio voor elk gegeven monster. Er is geen universele manier om betrouwbare en zinvolle beeldvormende resultaten te behalen. Het is inherent aan de benadering dat biologische variatie van het monster, subjectiviteit en verwachtingen van de microscopist, evenals beeld nabewerking een aanzienlijke invloed hebben op de gegevensverwerving en-interpretatie, respectievelijk. Vandaar, de praktische ervaring van de microscopist, haar/zijn intieme kennis over de celbiologie van de schimmel onderzochte, evenals bekwame monstervoorbereiding om condities te creëren als ‘ natuurlijke ‘ en ongestoord mogelijk in een Lab setting, zijn van essentieel belang voor het verwerven en evalueren van Imaging data die waarheidsgetrouw weerspiegelt de bestudeerde cellulaire verschijnselen. Als vuistregel geldt dat het optreden van ongewenste neveneffecten van fluorescerende kleurstoffen, variërend van de subtiele en dus niet duidelijk zichtbare activering van een plasma membraan of celwand, het opnieuw modelleren van stressrespons trajecten op de rechtlijnige cytotoxische inductie van celautolyse, alleen veilig kan worden voorkomen door lage kleurstof concentraties ≤ 2 μM toe te passen.
De toepassing van fluorescerende kleurstoffen is eenvoudig, maar hun specifieke kenmerken zijn slecht gekarakteriseerd. Een belangrijke sterkte van het gebruik van fluorescerende kleurstoffen is de preparatieve eenvoud van de experimentele protocollen. Teelt en bemonstering van de schimmel, toevoeging van de kleurstof (fen), en montage op de Microscoop fase zijn (met de praktijk) ongecompliceerd. Aanpassing van de basis beeldvormings instellingen, inclusief excitatie en emissie golflengten, belichtingstijden, tijdsverloop instellingen enz., volgen eenvoudige biofysische regels van de Microscoop en biologische regels van de gebruikte fluorescerende kleurstoffen in de cellen. Tabel 1 beoogt de identificatie van de meest geschikte combinatie van kleurstof of kleurstof voor experimenten te ondersteunen. Bovendien zijn fluorescerende kleurstoffen redelijk geprijsd, gemakkelijk beschikbaar met betrouwbare hoge kwaliteit en dus zorgen voor een zeer reproduceerbare toepassing.
Twee belangrijke beperkingen van het gebruik van selectieve fluorescerende kleurstoffen van membraan of celwand zijn de (vaak) beperkte kennis van hun precieze kleurings eigenschappen, die in de meeste gevallen niet-specifiek zijn op het organel-en moleculair niveau, en hun concentratieafhankelijke ongewenste neveneffecten. FM-kleurstoffen zijn specifiek voor lipide-bilayers die deelnemen aan Endo-en exocytose. Echter, precies welke subcellulaire organellen worden achtereenvolgens gelabeld onder de geteste omstandigheden is niet onmiddellijk duidelijk en vereist vergelijking van verschillende FM kleurstof varianten, en co-labeling met aanvullende organelle-specifieke markers. De voorkeur van FM 1-43 voor mitochondriale membranen, in vergelijking met FM 4-64, is een voorbeeld. Cell Wall selectieve kleurstoffen vertonen een variërende specificiteit voor de drie belangrijkste polymeren van de schimmel celwand. CFW wordt beschouwd als een niet-specifieke vlek voor β-glucanen en chitine, SPF wordt verondersteld het meest selectief te zijn voor β-1, 4-glucanen, en CR wordt verondersteld zeer selectief te zijn voor α-en β-chitinen. Informatie over de bindende specificiteit van PFS aan schimmel celwand polysacchariden is momenteel niet beschikbaar. Welke verhouding welke schimmel celwand polymeer het meest effectief wordt geëtiketteerd bij een bepaalde kleurstof concentratie bij de onderzochte schimmelsoorten is niet gemakkelijk te beantwoorden, en de toepassing van gedetailleerde metingen die in vitro of in vivo in andere organismen of andere schimmelsoorten zijn verworven, moeten zeer zorgvuldig worden overwogen. Helaas, deze informatie is schaars en sterk verspreid in de literatuur35,42,46. Meer recente records die zouden volgen op eerdere studies33 om nieuwe inzichten te bieden in de precieze kleurings eigenschappen van de aanbevolen kleurstoffen specifiek in schimmels zijn momenteel niet beschikbaar.
Imaging-besturingselementen zijn essentieel om kleurings patronen en mobiele reacties nauwkeurig te evalueren. Waarschijnlijk de meest uitdagende deel, echter, is om te weten de celbiologie van de schimmel zo goed dat de opgenomen veranderingen in de subcellulaire lokalisatie van membraan en celwand selectieve fluorescerende kleurstoffen, veranderingen in cellulaire architectuur of hyphal groeipatroon kan uitsluitend en vol vertrouwen worden gerelateerd aan de beoogde effecten van de experimentele behandeling. Hiervoor is het cruciaal om goede controles te hebben naast een nieuw Live-celbeeldvormings experiment. Deze omvatten het onbehandelde wild type als negatieve beeldvormings regeling om achtergrond autofluorescentie en detector ruis uit het verworven beeld uit te sluiten, en om een morfologische comparator te hebben bij het werken met mutanten. Bovendien is een positieve beeldvormings controle, bijvoorbeeld een stam die GFP of RFP in het cytoplasma of een ander bekend fluorescerende marker eiwit uitdrukt, essentieel om de excitatie lichtintensiteit in te stellen op het vereiste minimum en een Cell Vitality Control te hebben. Zodra deze controles zijn ingesteld, is het gebruik van fluorescerende kleurstoffen niet beperkt tot visualisatie taken alleen, maar hun concentratie-afhankelijke kleuring dynamiek, evenals concentratie-afhankelijke bijwerkingen kunnen analytisch worden uitgebuit; bijvoorbeeld, voor het kwantitatief controleren van de celwand biosynthese in real time of voor de identificatie van mutant-specifieke fenotypes in gevoeligheidstesten47.
Verbeterde toekomstige toepassingen zijn afhankelijk van een gedetailleerde functionele analyse van kleurstof kleurings eigenschappen. Een belangrijke voortdurende uitdaging is het verder verbeteren en automatiseren van kwantitatieve beeld analyses om de functionele evaluatie van de subcellulaire dynamiek van selectieve fluorescerende kleurstoffen van membraan-en celwand in filamenteuze schimmels te voorkomen. Hiervoor zijn uitgebreide, kwantitatieve co-lokalisatie studies van deze kleurstoffen met bekende organel-en celwand polymeer markers in combinatie met Mutante stammen met een tekort aan specifieke transporttrajecten of die geen specifieke structurele componenten hebben, eerst vereist. Verschillende endocytose markers voor vergelijkende analyses met FM kleurstoffen zijn beschikbaar48,49, en met betrekking tot de nog slecht gekenmerkte bindende specificiteiten van celwand kleurstoffen in schimmels, kan de toepassing van fluorescently-gelabelde glucan-specifieke antilichamen50 een mogelijkheid bieden om dit probleem aan te pakken.
The authors have nothing to disclose.
Dank gaat uit naar het Tiroler wetenschaps Fonds (TWF) voor het verstrekken van subsidie #256524 aan AL, aan het Vienna Science and Technology Fund (WWTF) voor het verstrekken van subsidie #LS13-086 aan SZ, en aan het publicatie Fonds van de Universiteit van Innsbruck voor de ondersteuning van publicatie van Open Access. De auteurs bedanken ook de faculteit zoölogie van de Universiteit van Innsbruck voor het leveren van de Leica TCS SP5 II confocale laser scanning microscoop.
BRAND cell counting chamber | Merck | BR718005 | Thoma format |
Calcofluor White M2R | Merck/Sigma-Aldrich | F3543 | cell wall dye |
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI | Nikon | MRD07602 | water immersion objective |
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI | Nikon | MRD07602 | water immersion objective |
Congo Red | Merck/Sigma-Aldrich | C6277 | cell wall dye |
Dimethyl sulfoxide | VWR | 8,36,73,230 | organic solvent |
Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit | Nikon | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4 |
Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit | Nikon | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5 |
FM 1-43 | Merck/Sigma-Aldrich | S6814 | membrane dye |
FM 4-64 | Merck/Sigma-Aldrich | S6689 | membrane dye |
Glass beads | Rettberg | 1340691030 | 3 mm glass beads |
Glass cover slips | Thermo Fisher Scientific | BB02400600A113MNT0 | 24 x 60 # 1 glass cover slips |
HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc | Leica | 15506353 | glycerol immersion objective |
LSM 510 Meta | Zeiss | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3 |
M9 Minimal Medium | Merck/Sigma-Aldrich | M6030 | generic fungal growth medium |
Micro-slide 8-well | ibidi | 80826 | ibiTreat #1.5 polymer coverslip |
Miracloth | Merck/Millipore | 475855-1R | polyester filtration material |
Petri dish | Sarstedt | 8,21,472 | 92 x 16 mm culture dish w/o cams |
Phytagel | Merck/Sigma-Aldrich | P8169 | transparent gelling agent |
Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC | Zeiss | 440762-9904-000 | oil immersion objective |
Pontamine Fast Scarlet 4B | Merck/Sigma-Aldrich | 212490 | cell wall dye |
Potato Dextrose Agar (PDA) | BD Difco | 213400 | fungal growth medium for T. atroviride |
Potato Dextrose Broth (PDB) | BD Difco | 254920 | fungal growth medium for T. atroviride |
Reaction tube | Sarstedt | 72,706 | 1.5 mL SafeSeal tube |
Scalpel | B.Braun | 5518016 | Cutfix sterile scalpel #23 |
Screw cap tube | Sarstedt | 6,25,54,502 | 15 mL polypropylene tube |
Solophenyl Flavine 7GFE 500 | CIBA | 1485385V6 | cell wall dye |
SynaptoGreen C4 | Biotum | 70020 | membrane dye |
SynaptoRed C2 | Biotum | 70021 | membrane dye |
Syringe membrane filter | Thermo Fisher Scientific | 723-9945 | 0.45 µm SFCA syringe filter |
TCS SP5 II | Leica | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1 |
Vogel's Minimal Medium (VMM) | FGSC | Fungal Genetics Stock Centre | fungal growth medium for N. crassa |