الاصباغ الفلورية الحيوية هي أدوات أساسيه لتحليلات التصوير بالخلايا الحية في بيولوجيا الخلايا الفطرية الحديثة. هذه الورقة تفاصيل تطبيق الاصباغ الفلورية الثابتة والمعروفة لتتبع ديناميات غشاء البلازما ، اندو-/الندرات والخلايا الجدارية تخلق في الفطريات الخيطية.
تطبيق الغشاء وجدار الخلية الاصباغ الفلورية الانتقائية لتحليلات التصوير الخلية الحية من ديناميات عضيه في الخلايا الفطرية بدات قبل عقدين من الزمن ، ومنذ ذلك الحين لا تزال تسهم إلى حد كبير في فهمنا للفطريات الفطرية نمط الحياه. تقدم هذه الورقة دليلا عمليا لاستخدام اثنين من الاصباغ الغشاء FM 1-43 fm 4-64 والبقع جدار الخلية الاربعه Calcofluor الأبيض M2R ، سولوفينيل فلافون 7GFE 500 ، Pontamine سريع القرمزي 48 والكونغو الأحمر. وينصب التركيز علي تطبيق الجرعات المنخفضة الخاصة بهم للتاكد من التلطيخ الخالي من الحرفية ، وخصائص التصوير المشترك ، وتقييمهم الكمي. الطرق المعروضة قابله للتطبيق علي جميع العينات الفطرية الخيطية التي يمكن اعدادها بالطرق الموصوفة. ويمكن ان تكون نهوج التلطيخ الاساسيه بمثابه نقاط انطلاق للتكيف مع الأنواع التي قد تتطلب ظروفا مختلفه للزراعة. أولا ، يتم استعراض الخصائص البيوفيزيائية والبيوكيميائية لان فهمها ضروري لاستخدام هذه الاصباغ كبقع فلورية حيوية حقا. ثانيا ، يتم عرض البروتوكولات خطوه بخطوه التي بالتفصيل اعداد مختلف أنواع العينات الفطرية للتصوير بالخلايا الحية الفلورسنت. وأخيرا ، توضح التجارب التي أجريت علي سبيل المثال النهج المختلفة لما يلي: (1) تحديد العيوب في التنظيم المكاني-الزماني لندره المحببات في المسوخ الجينية ، (2) تميز نسبيا المشتركة والمتميزة لتوطين البروتينات المستهدفة المسمية GFP في مسار الخلايا العصبية ، (3) تحديد العيوب جدار الخلية الخلقية في متحولة وراثيه ، و (4) رصد التكوين الحيوي جدار الخلية في الوقت الحقيقي.
قبل عشرين عاما ، كانت الطريقة التي خوطي فيها الفطريات الجزيئية الكامنة والبيولوجيا الاساسيه الخلية التي يمكن تصورها في الفطريات الخيطية ثوره من تطبيق الغشاء الفلوري الانتقائي فاي ماو صبغ FM 4-641. فيما بعد, الفائدة من ال [كيتين-كدينغ] صبغ [كلكوفلور] ابيض كعلامة حيوية فلورية من فطريه خليه جدار ديناميات كان حققت2. ومنذ ذلك الحين ، أصبحت كل من الاصباغ والمتغيرات منها جزءا لا يتجزا من التحليلات التصويرية للخلايا الحية في الفطريات ، والاستمرار في تقديم رؤى غير مسبوقة في نمط الحياة الفطرية الخيطية. هذه الورقة تفاصيل تطبيق الاصباغ الفلورية الثابتة والمعروفة لتتبع ديناميات غشاء البلازما ، اندو-وكثرة والخلايا الجدارية في الفطريات الخيطية. اختبارات تتبع الكثرة تسمح بتناول العديد من الاسئله البيولوجية المتعلقة بالدراسة العامة لندره الخلايا التي يجب معالجتها3. لهذا ، يتم تسجيل التعريب والسرعة والخلافة من المقصورات الملونة علي أضافه صبغه FM بواسطة المجهر الزمني الفاصل والكمية مقارنه بين سلالات الفطرية اختبار4. يرسم جدار الخلية الاصباغ الحدود الخارجية للخلية والسماح بتتبع الاحداث الموفوجينيه ، بما في ذلك الاستقطاب خوطي tip النمو2، خوطي المتفرعة5، خوطي فيوجن6،7 وتشكيل الحاجز8. وعلاوة علي ذلك ، فانها تسهل القياس الكمي لترسب الجدار الخلوي الموضعي وتحديد العيوب اثناء التكوين الحيوي لجدار الخلية9. لان المعرفة التفصيلية للخصائص البيوكيميائية والفيزيائية الحيوية لأي علامة الفلورسنت هو شرط أساسي لنجاحها في تطبيق المجرية ، وتلخص هذه الخصائص لأول مره لصبغات سته وارده في هذه المقالة.
غشاء الاصباغ الانتقائية
FM (فاي ماو) الاصباغ styryl هي جزيئات البرمائيات الصغيرة التي لا يمكن ان تمر من خلال المنتسبين ولكن بعكس النشرة الخارجية من الدهن الاغشيه البيولوجية10. فهي تقريبا غير فلورية في محلول مائي ، ولكن تصبح الفلورسنت بشكل مكثف علي التكامل غشاء البلازما ، وتوليد ممتازة اشاره إلى الضوضاء (S/N)-النسب11. هذه الخصائص تجعلها مناسبه بشكل مثالي لتصور غشاء البلازما وديناميكيات عضيه داخل الخلايا ، بما في ذلك تتبع اندو-وكثرة المحببات12. الأخضر-الفلورسنت FM 1-43 والأحمر-الفلورسنت FM 4-64 هي الأكثر استخداما علي نطاق واسع علامات غشاء الفلورسنت لهذه الأغراض. المشبكان C4 و سينابتوريد C2 هما جزيئات عامه من الموردين البديلة التي يمكن استخدامها بالتبادل بدلا من FM 1-43 و FM 4-64 ، علي التوالي.
الاصباغ styryl تتالف من ثلاثه المناطق الهيكلية الرئيسية: (1) الذيل محبه للدهون الذي يسهل إدخال الصبغة في الطبقة الدهنية ، (2) الاساسيه فلوكوفيري التي تحدد الخصائص الطيفية للصبغة وتتكون من حلقتين العطرية متصلة من قبل واحد إلى ثلاثه سندات مزدوجة ، و (3) رئيس هيدروفيلييك مشحونة إيجابيا يمنع الادراج الكامل وتخلل الصبغة من خلال الغشاء (الشكل 1a).
ويعد الذيل محبه للدهون ، واعلي هو هيدروفوبيسيتي صبغ التالي تقارب ملزمه لغشاء ، ولكن الأقل هو الذوبان في الماء والغشاء معدل دي تلطيخ. التالي ، مختلف المتغيرات FM صبغ تنتج ديناميات تلطيخ مختلفه وأنماط. هيدروفوبيسيتي اعلي من 1-43 FM الذيل C4 يوفر اشاره فلوري اقوي وأكثر استقرارا في اغشيه البلازما والعضوية الداخلية أسرع من أقصر C2-الذيل FM 4-64, عند تطبيقها في تركيزات متساوي (الشكل 2).
والاهم من ذلك ، فان معدلات الاقتران/التفكك الثابتة والعالية لكل من صبغات FM11 مع متوسط أوقات الاستبقاء من 1 إلى 6 ثانيه لكل جزيء صبغ فردي13 تقلل من فرص التعطيل الموضعي لوظيفة الغشاء ، علي سبيل المثال ، من خلال تعديل سيوله الغشاء أو التفاعل الدائم القسري للبروتينات. هذا هو علي الأرجح السبب الرئيسي لماذا يمكن استخدام هذه الجزيئات والاصباغ الحيوية. ومع ذلك, تركيزات صبغ fm أعلاه 50 μM هي سامه للفطريات والخلايا النباتية2,14, والادله من قبل-2 التبغ بروتوبليازيات يشير إلى ان أكثر من 20 ميكرومتر fm صبغ يؤدي إلى تشبع غشاء البلازما14. التالي ، فانه من المستحسن عدم تجاوز هذا الحد ، وخاصه نظرا لحقيقة ان التصوير الممتاز قد تحقق مع اقل من 2-5 μM15،16.
ومن الجدير بالاهتمام ان الخواص الطيفية لاصباغ FM تختلف اختلافا كبيرا تبعا للبيئة المجهرية الغشائية الخاصة (التي تم استعراضها14). عموما ، تختلف أطياف الاثاره والانبعاثات من الاصباغ FM في حلول المذيبات النقية (كما هو منصوص عليه عاده في معلومات المنتج) بشكل كبير من ذلك في البيئات الخلوية ويمكن ، في معظم الحالات ، لا يمكن استشارتها مباشره لاختيار إعدادات التصوير الخلية الحية. الاثاره/الانبعاثات ماكسيما من FM 1-43 و FM 4-64 ، علي سبيل المثال ، تصبح الأزرق-تحولت من قبل 37/46 nm و 43/64 nm ، علي التوالي ، عندما ملزمه إلى الاغشيه الفطرية بالمقارنة مع حلولها في الميثانول (الجدول 1).
أساسيات كسر الأرض لاستخدام fm 4-64 و fm 1-43 لتتبع غشاء البلازما, اندو-/الندرات وديناميكيات عضيه, بما في ذلك سبيزنكربر والميتوكوندريا, وقد تم بالفعل موثقه بشكل شامل لمجموعه واسعه من الأنواع الفطرية الخيطية سابقا2,4,17,18,19. ويصور إعدادات التصوير الموصي بها لكل من الاصباغ FM التي تعمل في مختلف الأنواع الفطرية الخيطية في الشكل 1B. غير ان القيود التقنية المفروضة علي المعدات المتاحة أو الظروف الخلوية والتجريبية الخاصة ، مثل متوسط الثقافة أو درجه الحموضة أو درجات الحرارة ، قد تتطلب بعض التعديلات. لحسن الحظ ، الاصباغ FM تعمل علي نطاق واسع الطيفية ، ويتم تحقيق نتائج جيده جدا التصوير عن طريق مثيره FM 1-43 مع 514 nm أو FM 4-64 مع 488 nm. التالي ، يجب تحديد إعدادات التصوير الأمثل بشكل فردي لكل نوع نموذج والتطبيق المقصود.
التحول الكبير في ستوك من أكثر من 135 nm من FM 4-64 يسمح ممتازة ، والتصوير المشترك في وقت واحد مع الفلوروبيورس ينبعث منها الضوء الأخضر. وكثيرا ما يتم استغلال هذا لتقييم ديناميات التعريب داخل الخلايا من البروتين الفلوري الأخضر (gfp)-المسمي البروتينات الانصهار بالنسبة لغشاء البلازما والمسار اندوسيتيك9,20.
خليه الاصباغ الانتقائي الجدار
Calcofluor الأبيض M2R (CFW) ، وتسويقها أيضا باسم منير الفلورسنت 28 ، هو علي الأرجح الصبغة الفلورية الأكثر شهره المستخدمة لوصمه عار جدران الخلايا من البكتيريا والفطريات والطحالب والنباتات العالية والحشرات. تستخدم في البداية كعامل تبييض الضوئية في صناعه الورق والنسيج والمنظفات ، وقد تحققت فوائدها للتشخيص السريري للعدوى الفطرية في وقت مبكر في21،22. لان [كفو] [اينتركليتس] بشكل لا رجعه في ال [شتين] [تشتين] سلسله يزعج هو طبيعيه [تشتين] [ميكروفيريل] تجميع اثناء خليه جدار [بيوجينيسيس] بذلك يلد خليه جدار إجهاد23. هذا بدوره بتشغيل اليه إصلاح تلف جدار الخلية مما يؤدي إلى ارتفاع محليا ترسب جدار الخلية نتيجة غلوكان والتين synthase تفعيل24,25. هذه الظاهرة يمكن ان تحدث مع اي صبغه تعمل بواسطة ملزمه بشكل ثابت إلى البوليمرات جدار الخلية ، هو تركيز الاعتماد وهو الأكثر وضوحا في خوطي نصائح التي تمثل الأكثر غزارة في النمو التالي الأجزاء الأكثر حساسية من ميسليوم (الشكل 3). وقد تم مؤخرا تقديم ملخص شامل للآلات الجزيئية التي تستجيب للاضرار بجدار الخلية26.
يمكن ان يؤدي الصبغة الزائدة في تركيبه مع السمية الضوئية إلى تحلل الخلايا السريعة من مقصورات خوطي (فيلم 1). ومع ذلك, زيادة الحساسية لتركيزات صبغ التي هي “حيوية” في نوع البرية يمكن استغلالها لتحديد العيوب في التركيب الحيوي جدار الخلية من الجينات فقدان الوظيفة المسوخ9. ل cfw والكونغو الأحمر (CR) ، واخر تلوين المنسوجات المعروف أيضا باسم الأحمر المباشر 28 والعاملين بوصفها α-وبتا-كيتين-محدده جدار الخلية وصمه عار للفطريات والحشرات27،28، وقد تم تحديد تركيزات عتبه التي تحفز بقوة synthases مع > 60 μm cfw و > 70 μm CR ، علي التوالي ، في حين ان تركيزات <15 μM من صبغ اما لا يغير أو يمنع نمو الفطرية29،30،31. وضع هيكي وآخرون هذا التركيز عتبه CFW في 25 μM2. ولذلك ، فانه من المستحسن استخدام تركيزات صبغ ≤ 5 μM لاستبعاد الآثار المرتبطة بالإجهاد وضمان استخدام هذه الجزيئات كما حقا “الاصباغ الفلورية الحيوية”2،32. ينطبق هذا أيضا علي سولوفينيل فلافون 7GFE 500 (SPF) و Pontamine Fast القرمزي 4B (PFS) ، مرادفا ل86 الأصفر المباشر والأحمر المباشر 23 ، علي التوالي ، واثنين من الاصباغ الأخرى الخلية المفيدة الجدار الذي تم الإبلاغ عن تطبيق للفطريات للمرة الاولي أكثر من عقد من الزمان33. ولكن علي الرغم من خصائصها الطيفية ملحوظ34،35، واستخدام كل من الاصباغ منذ ذلك الحين كان محدودا جدا36،37. كما هو مبين سابقا ل 1.5 μM CFW2, 2 μm SPF كافيه لحل ديناميات جدار الخلية في ظل الظروف الاصليه مع دقه عاليه جدا الزمنيه (فيلم 2). يمكن الحصول علي نفس النتائج مع 2 μM CR أو PFS.
معا ، تتكون هذه الاصباغ الاربعه ، CFW ، SPF ، PFS و CR ، من مجموعه من علامات الفلورسنت المحددة بجدار الخلية والتي تغطي تقريبا الطيف الضوئي الكامل للانبعاثات المرئية (400 – 700 نانومتر) المستخدم في المجاهر الفلورية الحديثة (الشكل 4). الزيادة الكبيرة في كثافة مضان علي الربط إلى البوليمرات جدار الخلية المتاصله في كل أربعه ويولد ممتازة S/N-النسب. هذا بدوره يسمح للحفاظ علي تركيزات صبغ والاثاره كثافة الضوء منخفضه جدا ويسمح لأداء الخلية تلطيخ الجدار كما “جرعه منخفضه” الحية الخلية تقنيه التصوير2. لان هذه الاصباغ جدار الخلية هي غشاء البلازما غير منفذه ، فانها تعمل في وقت واحد كما البقع الحية/الميتة. وتجدر الاشاره إلى انه نظرا لأطيافها الضوئية الواسعة للغاية ، فان بعض القيود المتعلقة بخصائص التصوير المشترك لمركب CFW وعامل الوقاية من الشمس مع الفلوروبيورس الأخرى تحتاج إلى النظر فيها بعناية.
تواصل هذه المقالة العمل كسر الأرض التي إنشات استخدام الاصباغ الفلورية المختلفة كعلامات عضيه الحيوية للفطريات الفطرية في وقت مبكر 2000s2,4,43, ويحاول مناقشه الخصائص البيولوجية فوتوفيسيكال والخلية من الاصباغ FM والاصباغ خليه الجدار المختارة بمزيد من التفصيل من قبل. خاصه فيما يتعلق بالآثار الخلوية غير المرغوب فيها ، مثل التشبع غشاء أو تلف جدار الخلية ، التي تحدث فوق تركيزات صبغه معينه. ما كان يعتبر سابقا غير سامه علي المستوي الخلوي يعتبر الآن سامه علي المستوي الجزيئي. علي الرغم من ان هذه الآثار قد تكون خفيه جدا وغير واضحة مباشره من التغييرات الواضحة في السلوك العضوي أو الخلية, اي تدخل ممكن من تطبيق صبغ غير التصور يجب ان يكون الحد الأدنى للتحقيق في الوظيفة الجزيئية الاصليه. لحسن الحظ ، وتحسين الحساسية والكفاءة الكم من أجهزه الكشف الحديثة ، مثل كاشفات السليكون الانهيار الضوئي (Si-APDs)44 أو المنطقة Airyscan كاشف45، وتسهيل استخدام كميات اقل حتى من الصبغة من قبل. ومن الأهداف الرئيسية الأخرى لهذه المادة تجسيد خصائص التصوير المشترك لهذه الاصباغ مع الفلوروبيورس الأخرى ، والاهم من ذلك ، تلك التي من GFP باعتبارها البروتين الفلوري الأكثر استخداما في علم الاحياء. هذا ينبغي ان تساعد في تصميم التجارب التصويرية التي تهدف إلى ربط ديناميات التعريب تحت الخلوية من البروتينات الانصهار الفلورسنت إلى تلك التي من جدار الخلية الفطرية ، غشاء البلازما أو المسار اندو-والاكندره الخ.
التصوير تحت ظروف طبيعيه وخاليه من الإجهاد هو المفتاح للحصول علي بيانات موثوق بها. وتهدف بعض الاعتبارات العملية المتعلقة بالثقافة المتوسطة واعداد العينات إلى توفير نقطه انطلاق لإيجاد الظروف المثلي التي تسمح بالمراقبة الدقيقة للخلايا الصحية وغير المجهدة باعلي نسبه S/N الممكنة لأي عينه معينه. ولا توجد طريقه عالميه لتحقيق نتائج تصويريه موثوقه وذات مغزى. ومن المتاصل في النهج ان التنوع البيولوجي للعينه ، والذاتية وتوقعات الميكروسكوبيست ، فضلا عن تجهيز الصورة بعد التصوير ، لهما تاثير كبير علي اكتساب البيانات وتفسيرها ، علي التوالي. التالي ، فان الخبرة العملية لميكروسكوبيست ، لها/له المعرفة الحميمة حول بيولوجيا الخلية من الفطريات تحت التحقيق ، فضلا عن اعداد عينه ماهرا لخلق ظروف “طبيعيه” ودون عائق ممكن في اعداد المختبر ، هي الأهم للحصول علي وتقييم البيانات التصويرية التي تعكس بصدق الظواهر الخلوية درس.
تطبيق الاصباغ الفلورية بسيط ، ولكن خصائصها تتسم بالضعف. القوه الرئيسية لاستخدام الاصباغ الفلورية هي البساطة الاعداديه للبروتوكولات التجريبية. زراعه وأخذ العينات من الفطريات ، أضافه صبغه (ق) ، والمتصاعدة علي مرحله المجهر هي (مع الممارسة) واضحة. تعديل إعدادات التصوير الاساسيه ، بما في ذلك الاثاره والانبعاثات الموجية ، وأوقات التعرض ، وإعدادات الدورة الزمنيه وما إلى ذلك ، اتبع القواعد البيوفيزيائية البسيطة من المجهر والقواعد البيولوجية لاصباغ الفلورسنت المستخدمة داخل الخلايا. ويهدف الجدول 1 إلى دعم تحديد انسب تركيبه صبغيه أو صبغيه لأغراض التجريب. وعلاوة علي ذلك ، يتم تسعير الاصباغ الفلورية بشكل معقول ، وتتوفر بسهوله مع جوده عاليه يمكن الاعتماد عليها ، التالي ضمان تطبيق استنساخه للغاية.
اثنين من القيود الرئيسية لاستخدام الغشاء أو جدار الخلية الاصباغ الفلورية الانتقائية هي (في كثير من الأحيان) معرفه محدوده من خصائصها تلطيخ دقيقه ، والتي في معظم الحالات غير محدده علي المستوي العضوي والجزيئي ، والآثار الجانبية غير المرغوب فيها تعتمد علي التركيز. الاصباغ FM هي محدده لبليرس الدهون المشاركة في اندو-وكثرة. ومع ذلك ، علي وجه التحديد التي العضوية سوبسيلولاره تصبح علي التوالي المسمية تحت ظروف اختبار ليست واضحة علي الفور ويتطلب المقارنة بين مختلف المتغيرات FM صبغ ، والمشاركة في وضع العلامات مع علامات العضيات اضافيه محدده. تفضيل FM 1-43 لاغشيه الميتوكوندريا ، بالمقارنة مع FM 4-64 ، هو مثال واحد. الاصباغ الانتقائية جدار الخلية عرض خصوصية مختلفه لثلاثه البوليمرات الرئيسية للجدار الخلية الفطرية. ويعتقد CFW ان تكون وصمه عار غير محدده ل β-جلوكان والتين ، ويعتقد SPF ان يكون الأكثر انتقائية ل β-1 ، 4-جلوكان ، ويعتقد CR ان تكون انتقائية للغاية ل α-و β-chitins. المعلومات المتعلقة بخصوصية الربط من PFS إلى السكريات الفطرية جدار الخلية غير متوفرة حاليا. إلى اي نسبه الفطرية جدار الخلية البوليمر هو الأكثر فعاليه المسمي في تركيز صبغه معينه في الأنواع الفطرية تحت التحقيق ليست بسهوله الاجابه ، وتطبيق القياسات المفصلة المكتسبة في المختبر أو في الجسم الحي في الكائنات الأخرى أو الأنواع الفطرية الأخرى يجب ان ينظر بعناية فائقه. للأسف ، هذه المعلومات متناثرة ومبعثرة للغاية في الأدب35،42،46. المزيد من السجلات الاخيره التي من شانها ان تتبع الدراسات السابقة33 لتوفير رؤى جديده في خصائص تلطيخ دقيقه من الاصباغ مميزه علي وجه التحديد في الفطريات غير متوفرة حاليا.
ضوابط التصوير ضرورية لتقييم أنماط تلطيخ والاستجابات الخلوية بدقه. لهذا ، من المهم ان يكون هناك ضوابط جيده إلى جانب اي تجربه جديده للتصوير بالخلايا الحية. وتشمل هذه الأنواع البرية غير المعالجة كعنصر تحكم التصوير السلبية لاستبعاد الفلورية الخلفية والضوضاء كاشف من الصورة المكتسبة ، ويكون للمقارنة المورفولوجية عند العمل مع المسوخ. وعلاوة علي ذلك ، ومراقبه التصوير ايجابيه ، علي سبيل المثال سلاله التي تعبر عن GFP أو طلب العروض في سيتوتوبلاسما أو غيرها من البروتين علامة الفلورسنت المعروفة ، أمر ضروري لضبط شده الضوء الاثاره إلى الحد الأدنى المطلوب ولها عنصر تحكم حيوية الخلية. وبمجرد تعيين عناصر التحكم هذه ، لا يقتصر استخدام الاصباغ الفلورية علي مهام التصور فقط ، ولكن ديناميات التلطيخ التي تعتمد علي التركيز ، فضلا عن الآثار الجانبية التي تعتمد علي التركيز يمكن استغلالها بشكل تحليلي ؛ علي سبيل المثال ، للرصد الكمي الحيوي جدار الخلية في الوقت الحقيقي أو لتحديد الظواهر الظاهرية المحددة في اختبارات الحساسية47.
تعتمد التطبيقات المستقبلية المحسنة علي تحليلات وظيفية مفصله لخصائص صبغ الصبغة. ويتمثل أحد التحديات الرئيسية المستمرة في زيادة تحسين وأتمته تحليلات الصور الكمية من أجل النهوض بالتقييم الوظيفي لديناميات الخلايا شبه الخلوية من الاغشيه والاصباغ الفلورية الانتقائية لجدار الخلية في الفطريات الخيطية. لهذا, واسعه, الكمية المشتركة التوطين الدراسات من هذه الاصباغ مع المعروفة عضيه والخلية الجدار علامات البوليمر في تركيبه مع سلالات متحولة ناقصه في مسارات النقل معينه أو التي تفتقر إلى مكونات هيكليه محدده مطلوبه أولا. العديد من علامات الكثرة للتحليلات المقارنة مع الاصباغ FM متاحه48،49، وفيما يتعلق بخصائص ملزمه لا تزال سيئه تتميز الاصباغ جدار الخلية في الفطريات ، وتطبيق الأجسام المضادة جلوكان المسمية فلوريسسينتلي50 يمكن ان توفر امكانيه واحده لمعالجه هذه المسالة.
The authors have nothing to disclose.
ويرجع الفضل في ذلك إلى صندوق العلوم التيروليه (TWF) لتقديم المنح #256524 إلى صندوق فيينا للعلوم والتكنولوجيا (WWTF) لتقديم منحه #LS13-086 إلى SZ ، والي صندوق المطبوعات التابع لجامعه انسبروك لدعم نشر النفاذ المفتوح. ويشكر المؤلفون أيضا قسم علم العلم من جامعه انسبروك لتوفير المجهر لأيكا الخدمة SP5 الثانية لفحص الليزر كونبؤري.
BRAND cell counting chamber | Merck | BR718005 | Thoma format |
Calcofluor White M2R | Merck/Sigma-Aldrich | F3543 | cell wall dye |
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI | Nikon | MRD07602 | water immersion objective |
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI | Nikon | MRD07602 | water immersion objective |
Congo Red | Merck/Sigma-Aldrich | C6277 | cell wall dye |
Dimethyl sulfoxide | VWR | 8,36,73,230 | organic solvent |
Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit | Nikon | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4 |
Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit | Nikon | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5 |
FM 1-43 | Merck/Sigma-Aldrich | S6814 | membrane dye |
FM 4-64 | Merck/Sigma-Aldrich | S6689 | membrane dye |
Glass beads | Rettberg | 1340691030 | 3 mm glass beads |
Glass cover slips | Thermo Fisher Scientific | BB02400600A113MNT0 | 24 x 60 # 1 glass cover slips |
HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc | Leica | 15506353 | glycerol immersion objective |
LSM 510 Meta | Zeiss | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3 |
M9 Minimal Medium | Merck/Sigma-Aldrich | M6030 | generic fungal growth medium |
Micro-slide 8-well | ibidi | 80826 | ibiTreat #1.5 polymer coverslip |
Miracloth | Merck/Millipore | 475855-1R | polyester filtration material |
Petri dish | Sarstedt | 8,21,472 | 92 x 16 mm culture dish w/o cams |
Phytagel | Merck/Sigma-Aldrich | P8169 | transparent gelling agent |
Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC | Zeiss | 440762-9904-000 | oil immersion objective |
Pontamine Fast Scarlet 4B | Merck/Sigma-Aldrich | 212490 | cell wall dye |
Potato Dextrose Agar (PDA) | BD Difco | 213400 | fungal growth medium for T. atroviride |
Potato Dextrose Broth (PDB) | BD Difco | 254920 | fungal growth medium for T. atroviride |
Reaction tube | Sarstedt | 72,706 | 1.5 mL SafeSeal tube |
Scalpel | B.Braun | 5518016 | Cutfix sterile scalpel #23 |
Screw cap tube | Sarstedt | 6,25,54,502 | 15 mL polypropylene tube |
Solophenyl Flavine 7GFE 500 | CIBA | 1485385V6 | cell wall dye |
SynaptoGreen C4 | Biotum | 70020 | membrane dye |
SynaptoRed C2 | Biotum | 70021 | membrane dye |
Syringe membrane filter | Thermo Fisher Scientific | 723-9945 | 0.45 µm SFCA syringe filter |
TCS SP5 II | Leica | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1 |
Vogel's Minimal Medium (VMM) | FGSC | Fungal Genetics Stock Centre | fungal growth medium for N. crassa |