重要な蛍光色素は、現代の真菌細胞生物学における生細胞イメージング解析に不可欠なツールです。本論文では、糸状菌における血漿膜動態、エンド/エキソサイトーシスおよび細胞壁形態形成を追跡するための確立された、あまり知られていない蛍光色素の適用について詳しく述べる。
真菌細胞におけるオルガネラダイナミクスの生細胞イメージング解析のための膜および細胞壁選択的蛍光色素の応用は20年前に始まり、それ以来、糸状真菌の理解に大きく貢献し続けているライフ スタイル。本論文では、2つの膜染料FM 1-43およびFM 4-64と4つの細胞壁染色カルコフルオールホワイトM2R、ソロフェニルフラビン7GFE 500、ポンタミンファストスカーレット48およびコンゴレッドの利用のための実用的なガイドを提供する。焦点は、アーティファクトのない染色、その共イメージング特性、および定量的評価を確認するための低用量アプリケーションです。提示された方法は、記載された方法で調製することができるすべての糸状真菌試料に適用可能である。基本的な染色アプローチは、異なる栽培条件を必要とする種への適応の出発点として役立ちます。まず、これらの染料を真に重要な蛍光染色剤として使用するためには、その理解が不可欠であるため、生物物理学的および生化学的特性が見直されます。第二に、蛍光生細胞イメージングのための様々な真菌サンプルタイプの調製を詳細に示すステップバイステッププロトコルが提示される。最後に、実験例は、(1)遺伝的変異体におけるエンドサイトーシスの時空間組織の欠陥を同定し、(2)GFP標識標的タンパク質の共有および明確な共局在を比較的特徴付ける:異なるアプローチを示す。内視鏡経路において、(3)遺伝的変異体における形態形成細胞壁欠損を同定し、(4)細胞壁生体形成をリアルタイムで監視する。
20年前、ヒファル形態形成および基礎となる分子細胞生物学を糸状菌で可視化する方法は、膜選択的蛍光フェイマオ色素FM 4-641の応用によって革命を起こした。その後、真菌細胞壁ダイナミクスの重要な蛍光マーカーとしてキチン結合色素カルコフルオホワイトホワイトの利点が実現された2.それ以来、染料とその変種の両方が、真菌中のオルガネラダイナミクスの生細胞イメージング解析に固有の部分となっており、糸状の真菌の生活様式に対する前例のない洞察を提供し続けています。本論文では、糸状菌における血漿膜動態、内皮症およびエキソサイトーシスおよび細胞壁形態形成を追跡するための確立され、あまり知られていない蛍光色素の適用を詳述する。エンドサイトーシス追跡アッセイは、エンドサイトーシスの一般的な研究に関連する様々な細胞生物学的質問に対処することを可能にする3.このために、FM色素添加時の染色されたコンパートメントの局在化、速度および連続は、時間経過顕微鏡法によって記録され、試験された真菌株4との間で定量的に比較される。細胞壁染料は、細胞の外側境界を線引し、偏光ヒファル先端増殖2、ヒファル分岐5、ヒファル融合6、7および中隔形成8を含む形態形成事象の追跡を可能にする。さらに、それらは、細胞壁の生体形成9の間に局所的な細胞壁堆積および欠陥の同定の定量を促進する。蛍光マーカーの生化学的および生物物理的特性に関する詳細な知識は、生体内アプリケーションを成功させるための基本的な前提条件であるため、これらの特性は、この記事で取り上げた6つの染料について最初に要約されています。
膜選択染料
FM(フェイマオ)スチリル染料は、生物学的膜10の脂質二重層の外側リーフレットと可逆的に関連する通過できない小さな両親媒性分子である。それらは水溶液中では実質的に非蛍光であるが、プラズマ膜統合時に強く蛍光となり、優れた信号対雑音(S/N)比を生成する11。これらの特性は、内因性および外皮症12の追跡を含む形質膜および細胞内小器官動を可視化するのに理想的に適している。緑色蛍光FM 1-43および赤色蛍光FM 4-64は、これらの目的のために最も広く使用されている2つの蛍光膜マーカーである。シナプトグリーンC4とシナプトレッドC2は、それぞれFM 1-43とFM 4-64の代わりに交換可能に使用することができる代替サプライヤーからの一般的な分子です。
スチリル染料は、(1)脂質二重層への色素の挿入を容易にする親油性尾部、(2)色素のスペクトル特性を決定する蛍光コア、1~3個の二重結合で連結された2つの芳香族環で構成される、(3)膜を通る色素の完全な挿入および透過を防止する正に帯電した親水性ヘッドの3つの主要な構造領域を含む。
親油性の尾が長いほど、色素の疎水性が高く、膜に結合親和性が高くなりますが、低い方がその水溶性と膜脱染色速度です。その結果、異なるFM染料変異体は、異なる染色ダイナミクスとパターンを生成します。C4尾FM1-43の疎水性が高いほど、血漿膜や内オルガネラの蛍光シグナルは、短いC2尾FM4-64よりも速く、等モル濃度で適用される場合より速い(図2)。
重要なことに、個々の色素分子13あたり1〜6秒の平均保持時間を有する両方のFM色素11の一定および高い関連/解離率は、例えば膜流動性の改変または膜タンパク質の強制的な永久相互作用を通じて、膜機能の局所的な破壊の可能性を減少させる。これはおそらく、これらの分子が重要な染料として使用することができる主な理由です。それにもかかわらず、50μMを超えるFM色素濃度は、真菌および植物細胞2、14に有毒であり、BY-2タバコプロトプラストからの証拠は、20μM FM色素が血漿膜飽和14につながることを示す。したがって、特に優れたイメージングがわずか2〜5μM15、16で達成されたという事実を考えると、この限界を超えないことをお勧めします。
特に、FM色素のスペクトル特性は、特定の膜微小環境によって大きく異なる(レビュー済み14)。一般に、純粋な溶媒溶液中のFM色素の励起および発光スペクトル(通常は製品情報で提供される)は、細胞環境のそれとは大きく異なり、ほとんどの場合、生細胞イメージング設定を選択するために直接相談することはできません。例えば、FM 1-43およびFM 4-64の励起/発光最大値は、メタノール中の溶液と比較して真菌膜に結合すると、それぞれ37/46nmおよび43/64nmによって青色シフトになる(表1)。
血漿膜、エンド/エキソサイトーシスおよびミトコンドリアを含むオルガネラダイナミクスを追跡するためのFM 4-64およびFM 1-43の使用のための画期的な基礎は、以前にフィラメント真菌種の広い範囲のために既に包括的に文書化されています2,4,17,18,19.様々な糸状真菌種で働く両方のFM染料に対する推奨イメージング設定を図1Bに示す。しかし、培養培地、pH、温度など、利用可能な機器または特定の細胞および実験条件の技術的な制限は、いくつかの適応を必要とする場合があります。幸いなことに、FM染料は広いスペクトル範囲にわたって動作し、非常に良好なイメージング結果は、488 nmの514 nmまたはFM 4-64でエキサイティングなFM 1-43によって達成されます。したがって、最適なイメージング設定は、サンプルの種類および目的のアプリケーションごとに個別に決定する必要があります。
FM 4-64の135 nm以上のかなりのストークのシフトは、緑色の光を放出する蛍光色素との優れた同時イメージングを可能にします。これは、血漿膜およびエンドサイト経路9、20に対する緑色蛍光タンパク質(GFP)標識融合タンパク質の細胞内局在ダイナミクスを評価するために頻繁に利用される。
細胞壁選択色素
カルコフルオアホワイトM2R(CFW)は、蛍光ブライトナー28としても販売され、おそらく細菌、真菌、藻類、高等植物および昆虫の細胞壁を染色するために使用される最もよく知られている蛍光色素である。当初、論文、繊維および洗剤業界で光学美白剤として使用され、真菌感染症の臨床診断のためのその利点は、21、22の早い段階で実現された。CFWは、生臭キチン鎖に不可逆的にインターカレートするので、細胞壁の生体形成中に正常なキチンマイクロフィブリルアセンブリを妨害し、それによって細胞壁応力23を生成する。これは、順番にグルカンおよびチチン合成酵素活性化24、25の結果として局所的に高められた細胞壁堆積につながる細胞壁損傷修復機構をトリガする。この現象は、細胞壁ポリマーに安定に結合することによって作動する任意の色素で起こり得る、濃度に依存し、菌糸体の最も多産成長し、したがって最も敏感な部分を表す子宮内先端で最も顕著である(図3)。細胞壁損傷に反応する分子機械の包括的な要約が最近提供された26.
光毒性と組み合わせた過剰摂取染料は、子宮内区画の急速な細胞リシスにつながる可能性があります(ムービー1)。それにもかかわらず、野生型において「重要」である色素濃度に対する感受性の増加は、遺伝子喪失機能変異体9の細胞壁生合成の欠陥を同定するために利用され得る。CFWおよびコンゴレッド(CR)の場合、ダイレクトレッド28としても知られており、真菌および昆虫27、28のためのα-およびβキチン特異的細胞壁染色として採用された別の織物着色剤は、キチンシンターゼを強く誘導する閾値濃度を> 60μM CFWおよび> 70μM CRは、それぞれ、いずれの色素の濃度<15μMも真菌増殖を変化または阻害しなかったのに対し、29、30、31であった。Hickey et al. は、CFW に対してこの閾値濃度を 25 μM2に置いた。したがって、色素濃度 ≤ 5 μMを使用してストレス関連のアーティファクトを除外し、これらの分子を真に「重要な蛍光色素」2、32として使用することを保証することをお勧めします。これは、ソロフェニルフラビン7GFE 500(SPF)およびポンタミン高速スカーレット4B(PFS)にそれぞれ同義語、ダイレクトイエロー86およびダイレクトレッド23の代名詞であり、真菌の適用が10年以上前に初めて報告されている他の2つの有用な細胞壁染料に同様に適用される。しかし、彼らの顕著なスペクトル特性34、35にもかかわらず、両方の染料の使用はそれ以来非常に限られた36、37である。1.5 μM CFW2で前述したように、2 μM SPF は、非常に高い時間分解能を持つネイティブ条件下でセル壁のダイナミクスを解決するのに十分です (Movie 2)。同じ結果は2 μM CRまたはPFSで得ることができる。
これら4つの染料を合わせると、CFW、SPF、PFSおよびCRは、現代の蛍光顕微鏡で利用されるほぼ完全な可視発光スペクトル(400〜700nm)をカバーする細胞壁選択的蛍光マーカーのセットを含む(図4)。細胞壁ポリマーに結合する際の蛍光強度の有意な増加は、4つすべてに固有であり、優れたS/N比を生成します。これにより、染料濃度及び励起光強度を非常に低く保つことができ、細胞壁染色を「低用量」ライブセルイメージング技術2として行うことができる。これらの細胞壁染料は形質膜不透過性であるため、同時に生きている/死んだ汚れとして機能します。特に、その非常に広い発光光スペクトルのために、他の蛍光色素とCFWおよびSPFの共イメージング特性に関するいくつかの制限を慎重に考慮する必要があります。
本稿では、2000年代初頭の糸状菌の重要なオルガネラマーカーとして様々な蛍光色素を確立した画期的な作業を続け、FM染料と選択した細胞壁染料の光物理学的・細胞生物学的性質について、これまでよりも詳細に論じようと試みる。特に、膜飽和や細胞壁損傷などの望ましくない細胞の影響に関しては、特定の色素濃度を超えて発生します。以前に細胞レベルで非毒性と考えられていたものは、現在、分子レベルで毒性とみなされている。これらの効果は非常に微妙であり、オルガネラや細胞の挙動の明らかな変化によって直接明らかではないかもしれませんが、可視化以外の色素アプリケーションの干渉は、ネイティブ分子機能の調査のために最小限に抑える必要があります。幸いなことに、シリコンアバランチフォトダイオード検出器(Si-APD)44またはエアイスキャン領域検出器45などの現代検出器の感度および量子効率の向上は、以前よりもさらに低い色素量の使用を容易にする。この記事のもう一つの重要な目的は、これらの色素の共イメージング特性を他の蛍光色素と例示することであり、最も重要なことは、生物学において最も頻繁に使用される蛍光タンパク質としてGFPのものである。これは、蛍光融合タンパク質の細胞内局在ダイナミクスを真菌細胞壁、形質膜、または内膜およびエキソサイトシス経路などと相関させることを目的としたイメージング実験の設計に役立つはずです。
自然でストレスのない条件下でのイメージングは、信頼性の高いデータを取得するための鍵となります。培養培地およびサンプル調製に関するいくつかの実用的な考慮事項は、任意のサンプルに対して可能な限り高いS/N比を有する健康でストレスのない細胞のアーティファクトフリーで長時間観察を可能にする最適な条件を見つけるための出発点を提供することを目的としています。信頼性が高く、有意義なイメージング結果を得る普遍的な方法はありません。サンプルの生物学的変動、マイクロスコピストの主観性および期待、ならびに画像後処理がそれぞれデータ取得および解釈に大きな影響を与えるアプローチに固有のものです。したがって、顕微鏡の実用的な経験、調査中の真菌の細胞生物学に関する彼女/彼の親密な知識、ならびにラボの設定で可能な限り「自然」と妨げられない状態を作り出すための巧みなサンプル調製は、研究された細胞現象を真実に反映した画像データを取得し、評価するための最も重要です。経験則として、蛍光色素の望ましくない副作用の発生は、血漿膜または細胞壁の微妙かつ明らかに目に見える活性化から、細胞自己解析の簡単な細胞傷害誘導に対するストレス応答経路を再モデル化することから、低色素濃度≤2μMを適用することによってのみ安全に防止することができる。
蛍光色素の塗布は簡単ですが、その特異性は十分に特徴付けが不十分です。蛍光色素を使用する主な強度は、実験プロトコルの調製の簡潔さです。真菌の培養およびサンプリング、色素の添加、および顕微鏡段階への取り付けは(練習と)簡単です。励起および発光波長、露光時間、経時変化の設定など、基本的なイメージング設定の調整は、顕微鏡の単純な生物物理学的ルールと細胞内の使用される蛍光色素の生物学的ルールに従います。表1は、実験に最も適した色素または染料の組み合わせの同定を支持する意図がある。さらに、蛍光色素は手頃な価格で、信頼性の高い高品質で容易に入手でき、非常に再現性の高いアプリケーションを保証します。
膜または細胞壁の選択的蛍光色素を使用する2つの主要な制限は、その正確な染色特性の(多くの場合)限られた知識であり、ほとんどの場合、オルガネラおよび分子レベルに非特異的であり、その濃度依存的な望ましくない副作用である。FM色素は、エンドおよびエキソサイトーシスに関与する脂質二重層に特異的である。しかし、どの細胞下小器官が試験条件下で連続的に標識されるのかは、すぐには明らかではなく、異なるFM色素変異体の比較、および追加のオルガネラ特異的マーカーとの共標識が必要である。ミトコンドリア膜に対するFM1-43の好みは、FM4-64と比較して、一例である。細胞壁選択染料は、真菌細胞壁の3つの主要ポリマーに対して様々な特異性を示す。CFWはβグルカンやキチンに対して非特異的な染色と考え、SPFはβ-1,4-グルカンに対して最も選択的であると考え、CRはα-およびβキチンに対して非常に選択的であると考えられている。真菌細胞壁多糖類に対するPFSの結合特異性に関する情報は、現在利用できない。調査中の真菌種の所定の色素濃度で最も効果的に標識されている真菌細胞壁ポリマーの比率に対しては、容易には答えが得られ、他の生物または他の真菌種におけるインビトロまたはインビボで得られた詳細な測定の適用は非常に慎重に考慮されなければならない。残念ながら、この情報はまばらで、文献35、42、46に非常に散在している。真菌中に特に特徴付された染料の精密な染色特性に関する新しい洞察を提供するために、以前の研究33に続くより最近の記録は、現在利用できない。
撮像制御は、染色パターンおよび細胞応答を正確に評価するために不可欠である。しかし、おそらく最も困難な部分は、真菌の細胞生物学をよく知っているので、膜および細胞壁の選択的蛍光色素の細胞内局在の変化を、細胞構造または催眠成長パターンの変化は、実験的治療の意図した効果に排他的かつ自信を持って関連させることができる。このためには、新しい生細胞イメージング実験と一緒に良好なコントロールを持つことは重要です。これらには、取得した画像からバックグラウンドの自己蛍光および検出器ノイズを除外し、変異体を操作する際に形態学的比較を有する陰性画像制御として未処理の野生型が含まれる。さらに、陽性イメージング制御は、例えば細胞質または他のよく知られた蛍光マーカータンパク質においてGFPまたはRFPを発現する株であり、励起光強度を必要最小限に設定し、細胞活力制御を有することが不可欠である。これらのコントロールが設定されると、蛍光色素の使用は可視化タスクのみに限定されませんが、濃度依存の染色ダイナミクス、ならびに濃度依存的な副作用は分析的に利用され得る。例えば、細胞壁生合成をリアルタイムで定量的にモニタリングするために、または感受性アッセイにおける変異特異的表現型の同定のために47。
改善された将来の適用は染料染色特性の詳細な機能分析に依存する。主な課題は、糸状菌中の膜および細胞壁選択的蛍光色素の細胞内ダイナミクスの機能的評価を進めるために、定量画像解析をさらに改善・自動化することです。このためには、特定の輸送経路に欠損する変異株と組み合わせた既知のオルガネラおよび細胞壁ポリマーマーカーを用いたこれらの色素の広範な定量的共局在化研究が最初に必要とされる。FM色素との比較分析のためのいくつかのエンドサイトーシスマーカーは、48、49、および真菌中の細胞壁色素の依然として十分に特徴付けが悪い結合特異性に関して、蛍光標識グルカン特異的抗体50の適用は、この問題に対処する1つの可能性を提供し得る。
The authors have nothing to disclose.
おかげで、チロル科学基金(TWF)は、ALに助成金を提供し、ウィーン科学技術基金(WWTF)に対し、SZに#LS13-086の助成金を提供し、オープンアクセス出版を支援するためのインスブルック大学の出版基金に#256524を提供したおかげです。著者らはまた、ライカTCS SP5 II共焦点レーザー走査顕微鏡を提供したインスブルック大学動物学科に感謝する。
BRAND cell counting chamber | Merck | BR718005 | Thoma format |
Calcofluor White M2R | Merck/Sigma-Aldrich | F3543 | cell wall dye |
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI | Nikon | MRD07602 | water immersion objective |
CFI Plan Apo VC 60x/1.2 NA XC WI | Nikon | MRD07602 | water immersion objective |
Congo Red | Merck/Sigma-Aldrich | C6277 | cell wall dye |
Dimethyl sulfoxide | VWR | 8,36,73,230 | organic solvent |
Eclipse TE2000-E with C1 scanning unit | Nikon | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 2 and 4 |
Eclipse TE2000-U with Bio-Rad Radiance 2100 scannig unit | Nikon | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 5 |
FM 1-43 | Merck/Sigma-Aldrich | S6814 | membrane dye |
FM 4-64 | Merck/Sigma-Aldrich | S6689 | membrane dye |
Glass beads | Rettberg | 1340691030 | 3 mm glass beads |
Glass cover slips | Thermo Fisher Scientific | BB02400600A113MNT0 | 24 x 60 # 1 glass cover slips |
HCX PL APO 63x/1.3 NA Glyc | Leica | 15506353 | glycerol immersion objective |
LSM 510 Meta | Zeiss | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 3 |
M9 Minimal Medium | Merck/Sigma-Aldrich | M6030 | generic fungal growth medium |
Micro-slide 8-well | ibidi | 80826 | ibiTreat #1.5 polymer coverslip |
Miracloth | Merck/Millipore | 475855-1R | polyester filtration material |
Petri dish | Sarstedt | 8,21,472 | 92 x 16 mm culture dish w/o cams |
Phytagel | Merck/Sigma-Aldrich | P8169 | transparent gelling agent |
Plan Apochromat 63x/1.4 NA Oil DIC | Zeiss | 440762-9904-000 | oil immersion objective |
Pontamine Fast Scarlet 4B | Merck/Sigma-Aldrich | 212490 | cell wall dye |
Potato Dextrose Agar (PDA) | BD Difco | 213400 | fungal growth medium for T. atroviride |
Potato Dextrose Broth (PDB) | BD Difco | 254920 | fungal growth medium for T. atroviride |
Reaction tube | Sarstedt | 72,706 | 1.5 mL SafeSeal tube |
Scalpel | B.Braun | 5518016 | Cutfix sterile scalpel #23 |
Screw cap tube | Sarstedt | 6,25,54,502 | 15 mL polypropylene tube |
Solophenyl Flavine 7GFE 500 | CIBA | 1485385V6 | cell wall dye |
SynaptoGreen C4 | Biotum | 70020 | membrane dye |
SynaptoRed C2 | Biotum | 70021 | membrane dye |
Syringe membrane filter | Thermo Fisher Scientific | 723-9945 | 0.45 µm SFCA syringe filter |
TCS SP5 II | Leica | custom configuration | inverted laser scanning confocal microscope used to acquire example data 1 |
Vogel's Minimal Medium (VMM) | FGSC | Fungal Genetics Stock Centre | fungal growth medium for N. crassa |