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Immunology and Infection

मानव बहुरूपपरमाणु ल्यूकोसाइट्स के खिलाफ स्टेफिलोकस ऑरियस की साइटोटॉक्सिकिटी का आकलन

Published: January 3, 2020 doi: 10.3791/60681

ERRATUM NOTICE

Summary

यह प्रोटोकॉल पूरे मानव रक्त और दो अलग-अलग परखों से पॉलीमोर्फोन्यूक्लियर ल्यूकोसाइट्स की शुद्धि के लिए एक विधि का वर्णन करता है जो इन महत्वपूर्ण जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के खिलाफ स्टेफिलोकोकस ऑरियस की साइटोटॉक्सिकिटी की मात्रा निर्धारित करता है।

Abstract

स्टेफिलोकोकस ऑरियस ल्यूकोसिडिन की एक विस्तृत श्रृंखला को स्राव करने में सक्षम है जो बहुरूपपरमाणु ल्यूकोसाइट्स (पीएमएनएस या न्यूट्रोफिल) की झिल्ली अखंडता को लक्षित और बाधित करता है। यह प्रोटोकॉल मानव पीएमएनएस की शुद्धि और तीन विभिन्न वर्गों में पीएमएनएस के खिलाफ एस ऑरियस साइटोटॉक्सिकिटी की मात्रा दोनों का वर्णन करता है। धारा 1 घनत्व केंद्रीकरण का उपयोग करमानव रक्त से पीएमएनएस और सीरम के अलगाव का विवरण देती है। धारा 2 इन शुद्ध मानव पीएमएनएस के खिलाफ एस ऑरियस द्वारा उत्पादित बाह्य प्रोटीन की साइटोटॉक्सिकिसिटी का परीक्षण करती है। धारा 3 लाइव एस ऑरियसके फागोसाइटोसिस के बाद मानव पीएमएनएस के खिलाफ साइटोटॉक्सिकिटी को मापता है । ये प्रक्रियाएं प्रोपिडियम आयोडाइड, डीएनए बाध्यकारी फ्लोरोफोर के साथ इलाज किए गए पीएमएनएस के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण का उपयोग करके पीएमएन प्लाज्मा झिल्ली अखंडता के व्यवधान को मापती हैं जो कोशिका झिल्ली अभेद्य है। सामूहिक रूप से, इन तरीकों को प्राथमिक मानव पीएमएनएस के खिलाफ एस ऑरियस साइटोटॉक्सिकिटी का तेजी से परीक्षण करने का लाभ होता है और मेजबान-रोगजनक बातचीत के अन्य पहलुओं का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलित किया जा सकता है।

Introduction

स्टेफिलोकोकस ऑरियस एक ग्राम-पॉजिटिव जीवाणु है जो मनुष्यों में बीमारियों का एक विस्तृत स्पेक्ट्रम पैदा करता है। यह प्रमुख रोगजनक कई उग्रता कारक पैदा करता है जो संक्रमण के विभिन्न पहलुओं में योगदान देते हैं। इनमें सतह के अणु शामिल हैं जो एस ऑरियस को विभिन्न प्रकार के मेजबान ऊतक1,बाह्य प्रोटीन का पालन करने की अनुमति देते हैं जो मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया2में हस्तक्षेप करते हैं, और विभिन्न प्रकार की मेजबान कोशिकाओं को लक्षित करने वाले स्रावित विषाक्त पदार्थों की एक सरणी3। इस रिपोर्ट में, हम एक ऐसी विधि का वर्णन करते हैं जो मानव बहुरूपपरमाणु ल्यूकोसाइट्स (पीएमएनएस या न्यूट्रोफिल), मेजबान जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की प्राथमिक प्रभावक कोशिकाओं के खिलाफ एस ऑरियस द्वारा उत्पादित बाह्य प्रोटीन की साइटोटॉक्सिकिसिटी की मात्रा निर्धारित करती है।

पीएमएन स्तनधारियों में सबसे प्रचुर मात्रा में ल्यूकोसाइट्स हैं। इन परिसंचारी प्रतिरक्षा कोशिकाओं को तेजी से निवासी कोशिकाओं द्वारा उत्पादित खतरे के संकेतों के जवाब में मेजबान ऊतक अपमान की साइट पर भर्ती कर रहे है या रोगाणुओं पर हमला करने के लिए अद्वितीय यौगिकों द्वारा । इन अणुओं से और एक्सट्रावेशन के दौरान सक्रिय निवासी मेजबान कोशिकाओं के साथ सीधे संपर्क से 4,5को भड़काने वाली प्रक्रिया में पीएमएन की सक्रियता की स्थिति में वृद्धि होती है । प्रिमेड पीएमएनएस जो व्यथित ऊतक तक पहुंच गए हैं, तब संक्रमण की स्थापना को रोकने के लिए डिज़ाइन की गई महत्वपूर्ण जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं को निष्पादित करते हैं। इनमें सूक्ष्मजीवों पर हमला करने वाले बाध्यकारी और आंतरिककरण या फागोसाइटोसिस शामिल हैं, जो शक्तिशाली रोगाणुरोधी यौगिकों5की बैटरी द्वारा सूक्ष्मजीव विनाश में संचयी अंतरकोशिकीय घटनाओं के झरने को ट्रिगर करते हैं।

पीएमएनएस मनुष्यों को रोगजनकों पर हमला करने से बचाने के लिए एक आवश्यक भूमिका निभाते हैं और एस ऑरियस संक्रमण को रोकने के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं हालांकि, यह जीवाणु उग्रता जीन की एक विस्तृत श्रृंखला पैदा करता है जो विभिन्न पीएमएन कार्यों में बाधा उत्पन्न करता है। इनमें एक्सट्रासेलुलर प्रोटीन शामिल हैं जो संकेत अणुओं की पहचान को अवरुद्ध करते हैं, ऊतक ों की मेजबानी करने के लिए आसंजन को रोकते हैं, रोगाणुरोधी यौगिकों के उत्पादन को रोकते हैं, और प्लाज्मा झिल्ली अखंडता से समझौता करते हैं4। एस ऑरियस कई दो घटक संवेदी प्रणालियों से सामूहिक इनपुट के माध्यम से इन उग्रता जीन की लौकिक अभिव्यक्ति आर्केस्ट्रा है कि विशिष्ट पर्यावरण संकेतों को पहचानते हैं । SaeR/S दो घटक प्रणाली संक्रमण6,7,8,9,10, 11के दौरान एस ऑरियस उग्रता जीन प्रतिलेखन का एक प्रमुख अप-रेगुलेटर है । विशेष रूप से, इस दो घटक प्रणाली को द्वि-घटक ल्यूकोसाइडिन के उत्पादन के लिए महत्वपूर्ण दिखाया गया है जो विशेष रूप से मानव पीएमएनएस12को लक्षित करते हैं ।

यह प्रोटोकॉल तीन अलग-अलग वर्गों में टूटा हुआ है। पहला खंड एक प्रोटोकॉल का उपयोग करके घनत्व ढाल केंद्रीकरण का उपयोग करके मानव रक्त से पीएमएन की शुद्धि का वर्णन करता है जिसे बोयम13 और नौसीफ14द्वारा स्थापित तरीकों से अनुकूलित किया गया है । दूसरा और तीसरा वर्ग एस ऑरियस साइटोटॉक्सिकिटी की जांच करने के लिए दो अलग-अलग तकनीकों का विस्तार करता है; एक एस ऑरियस द्वारा उत्पादित एक्स्ट्रासेलुलर प्रोटीन के साथ पीएमएन को नशे में धुत करता है जबकि दूसरा फेगोसाइटोसिस के बाद पीएमएनएस को नुकसान पहुंचाने के लिए जीवित बैक्टीरिया की क्षमता की जांच करता है । ये प्रक्रियाएं एस ऑरियस पोर बनाने वाले विषाक्त पदार्थों के कारण पीएमएन प्लाज्मा झिल्ली अखंडता के नुकसान को मापने के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड का उपयोग करती हैं। प्रोपिडियम आयोडाइड एक डीएनए-बाध्यकारी फ्लोरोफोर है जो सामान्य रूप से कोशिका झिल्ली अभेद्य है लेकिन प्लाज्मा झिल्ली को पार कर सकता है जो एस ऑरियस विषाक्त पदार्थों द्वारा बाधित किया गया है। फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण प्रोपिडियम आयोडाइड-पॉजिटिव पीएमएनएस के तेजी से मात्राकरण को एस ऑरियस उपभेदों के सापेक्ष साइटोटॉक्सिकिटी को मापने की अनुमति देता है। मैथिकिलिन प्रतिरोधी एस ऑरियस (एमआरएसए) की पहचान स्पंदित-फील्ड जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस प्रकार USA300 और इस तनाव में saeR/S के एक आइसोजेनिक विलोपन उत्परिवर्ती (USA3001ss/S) मॉडल के रूप में किया गया है ताकि यह प्रदर्शित किया जा सके कि ये प्रक्रियाएं मानव पीएमएनएस के खिलाफ स्यारस की साइटोटॉक्सिकिटी को कैसे निर्धारित कर सकती हैं ।

Protocol

मोंटाना स्टेट यूनिवर्सिटी में मानव विषयों के लिए संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित प्रोटोकॉल के अनुसार स्वस्थ दानदाताओं से हेपरिनीकृत शिरारक्त एकत्र किया गया था । सभी दानदाताओं ने इस अध्ययन में भाग लेने के लिए लिखित सहमति प्रदान की ।

1. मानव बहुरूपपरमाणु ल्यूकोसाइट्स की शुद्धि और मानव सीरम का अलगाव

नोट: सभी अभिकर्ताओं को नियमित रूप से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंडोटॉक्सिन डिटेक्शन किट का उपयोग करके एंडोटॉक्सिन की उपस्थिति के लिए जांच की जानी चाहिए और पीएमएन के अवांछित प्राइमिंग को रोकने के लिए <25.0 pg/mL एंडोटॉक्सिन शामिल होना चाहिए ।

  1. 3% dextran के 50 mL लाओ-0.9% NaCl (w/v), 0.9% NaCl (w/v), 1.8% NaCl (w/v), 1.077 ग्राम/mL घनत्व ढाल समाधान के 12 mL के 35 मिलीग्राम, और इंजेक्शन के 20 mL-या सिंचाई ग्रेड पानी के कमरे के तापमान के लिए ।
  2. मानव सीरम को अलग करने के लिए, 30 मीटर के लिए 15 मीटर ग्लास ट्यूब में 37 डिग्री सेल्सियस पर एंटी-कॉम्गुलैंट के बिना ताजे-बद्ध मानव रक्त का 4 मीटर इनक्यूबेट। ऊष्मायन के बाद, कमरे के तापमान पर 10 न्यूनतम के लिए 2,000-3,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र नमूना। ऊपरी सीरम परत को एक ताजा 15 mL शंकुअप ट्यूब में स्थानांतरित करें और बर्फ पर रखें।
  3. ताजा खींचा हेपरिनाइज्ड (१००० यूनिट/mL) कमरे के तापमान के 25 मिलीग्राम के साथ पूरे मानव रक्त के 25 मिलीग्राम गठबंधन 3% dextran-०.९% NaCl (1:1 अनुपात) दो दोहराने में ५० mL शंकुदरी ट्यूब (५० mL कुल मात्रा प्रति ट्यूब) । धीरे से प्रत्येक ५० मीटर शंकुई ट्यूब कमाल से मिश्रण है और फिर 30 min के लिए कमरे के तापमान पर खड़े हो जाओ ।
  4. कमरे के तापमान पर ऊष्मायन के बाद, दो अलग-अलग परतें दिखाई देंगी। प्रत्येक dextran-रक्त मिश्रण की शीर्ष परत को नए 50 मीटर शंकुट्यूब में स्थानांतरित करें और कम या कोई ब्रेक के साथ कमरे के तापमान पर 10 न्यूनतम के लिए 450 x ग्राम पर अपकेंद्री रखें।
  5. सावधानी से दोनों supernatants aspirate और सेल छर्रों परेशान किए बिना त्यागना। कमरे के तापमान 0.9% NaCl के 2 mL में प्रत्येक सेल गोली को धीरे से फिर से निलंबित करें, एक 50 मीटर शंकुई ट्यूब में पुनर्निलंबित छर्रों को जोड़ें, फिर शेष 0.9% एनसीएल (35 मीटर की अंतिम मात्रा) जोड़ें।
  6. ध्यान से एक हाथ पिपेट का उपयोग कर सेल निलंबन के नीचे १.०७७ ग्राम/mL घनत्व ढाल समाधान के कमरे के तापमान के 10 mL अंडरले । कम या कोई ब्रेक के साथ कमरे के तापमान पर 30 न्यूनतम के लिए 450 x ग्राम पर स्पिन करें। सेल पैलेट को परेशान किए बिना सुपरनेटेंट को धीरे से एस्पिरेट कर लें। अधिनेतामें परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाएं होंगी जिन्हें पहलेवर्णित 14के रूप में एकत्र किया जा सकता है ।
  7. कमरे के तापमान पानी के 20 mL में सेल गोली को फिर से निलंबित करके लाल रक्त कोशिकाओं को Lyse। 30 एस के लिए ट्यूब कमाल से धीरे मिलाएं। लाल रक्त कोशिकाओं की लिसिस टर्बिडिटी में एक अलग कमी के साथ होगी।
  8. कमरे के तापमान पर 10 न्यूनतम के लिए 450 × ग्राम पर 1.8% नैल (कमरे के तापमान [आरटी]) का 20 मीटर और अपकेंद्रित्र नमूना जोड़ें।
    नोट: पीएमएन की उपज को अधिकतम करने और पीएमएन लिसिस और/या सक्रियण को रोकने के लिए लाल रक्त कोशिका लिसिस के बाद अकेले पानी में पीएमएनएस के समय को कम करना महत्वपूर्ण है ।
  9. सावधानी से सेल गोली परेशान किए बिना अधिनायक को एस्पिरेट करें। धीरे से आरटी RPMI १६४० मध्यम और बर्फ पर जगह के 2 mL में सेल गोली फिर से निलंबित ।
  10. हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। बर्फ-ठंडी आरपीएमआई के साथ 1 x 107 कोशिकाओं/mL की एकाग्रता पर शुद्ध पीएमएन को फिर से निलंबित करें और बर्फ पर रखें ।
  11. शुद्ध पीएमएन (1 x 106 कोशिकाओं) के 100 माइक्रोन को मिलाकर 300 माइक्रोन के साथ बर्फ-ठंडा डल्बेकको के फॉस्फेट-बफर्ड लवण (डीपीबीएस) के साथ दो दोहराने वाले प्रवाह साइटोमेट्री ट्यूबों में प्रोपिडियम आयोडाइड दाग के 1 μL होते हैं। प्लाज्मा झिल्ली क्षति के लिए सकारात्मक नियंत्रण के लिए, प्रवाह साइटोमेट्री ट्यूबों में से एक में 0.5% ट्राइटन एक्स-100 समाधान के 40 माइक्रोन जोड़ें और अच्छी तरह से मिलाएं।
  12. शुद्ध कोशिकाओं के आगे के तितर-बितर, साइड स्कैटरिंग और प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला (535/617 एनएम पर उत्तेजना/उत्सर्जन मैक्सिमा) को मापने के लिए प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करें(चित्रा 1)।
    नोट: फॉरवर्ड और साइड स्कैटर विश्लेषण लिम्फोसाइट्स और मोनोसाइट्स की अवांछित आबादी की पहचान करेगा। प्रोपिडियम आयोडाइड केवल एक समझौता प्लाज्मा झिल्ली और शुद्ध पीएमएनएस के साथ कोशिकाओं को दाग देगा जिन्होंने प्रोपिडियम आयोडाइड सकारात्मक कोशिकाओं की आबादी का उच्चारण किया है। इन अध्ययनों के लिए, शुद्ध पीएमएन का उपयोग केवल तभी किया गया था जब वे शुद्ध कोशिकाओं के 98% और एंड एलटी; 5% प्रोपिडियम आयोडाइड के लिए सकारात्मक थे।
  13. डीपीबीएस के साथ पतला किए गए 20% अलग मानव सीरम के 100 माइक्रोन के साथ इस परख में उपयोग किए जाने वाले व्यक्तिगत कुओं को कोटिंग करके पीएमएन साइटोटॉक्सिकिटी परख के लिए 96-अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें।
    नोट: प्लास्टिक या ग्लास पर सीधे पीएमएनएस चढ़ाना कोशिकाओं की सक्रियता का कारण बनेगा। कम से कम एक नकारात्मक नियंत्रण को अच्छी तरह से शामिल करना सुनिश्चित करें जो केवल मीडिया और कम से कम एक सकारात्मक नियंत्रण अच्छी तरह से प्राप्त करेगा जो 0.05% ट्राइटन एक्स-100 प्राप्त करेगा।
  14. प्लेट को 30 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट कर लें। ऊष्मायन के बाद, किसी भी अतिरिक्त सीरम को हटाने के लिए कोटेड कुओं को बर्फ-ठंडे डीपीबीएस से दो बार धोएं। किसी भी अवशिष्ट डीपीबीएस को हटाने और बर्फ पर रखने के लिए प्लेट को उल्टा टैप करें।
  15. धीरे से प्रत्येक लेपित अच्छी तरह से (1 x 106 PMNs/well) के लिए 1 x 107 कोशिकाओं/mL पर शुद्ध मानव पीएमएन के १०० μL जोड़ें । पीएमएनएस को कम से कम 5 मिन के लिए बर्फ पर प्लेट इनक्यूबेटकरके द्वारा कुओं में बसने की अनुमति दें। प्लेट का स्तर प्रत्येक कुएं में कोशिकाओं के वितरण की अनुमति देने के लिए रखें और पीएमएनएस की अवांछित सक्रियता से बचने के लिए बर्फ पर छोड़ दें।

2. मानव बहुरूपपरमाणु ल्यूकोसाइट्स के खिलाफ एस ऑरियस एक्सट्रासेलुलर प्रोटीन की साइटोटॉक्सिकिटी परख

  1. संस्कृति एस ऑरियस रात भर ट्रिप्टिक सोया शोरबा (टीएसबी) में 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक मिलाते हुए इनक्यूबेटर का उपयोग कर। इन अध्ययनों के लिए, अलग 150 मीटर Erlenmeyer flasks में टीएसबी के 20 mL एस ऑरियस उपभेदों USA300 या USA3001saeR/S की जमे हुए संस्कृतियों के साथ टीका लगाया गया था और लगभग 14 घंटे के लिए 250 आरपीएम पर मिलाते हुए के साथ हो गया.
  2. ताजा मीडिया के साथ रातोंरात जीवाणु संस्कृति के 1:100 कमजोर पड़ने का प्रदर्शन करके उपसंस्कृति एस ऑरियस। जब तक बैक्टीरिया जल्दी स्थिर विकास चरण तक पहुंचने के लिए मिलाते हुए के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    नोट: इन प्रयोगों के लिए, 150 मीटर में ट्रिप्टिक सोया शोरबा के 20 मिलील Erlenmeyer flasks रातोंरात सुसंस्कृत USA300 या USA3001s/Sके 200 μL के साथ टीका लगाया गया था और 5 घंटे के लिए 250 आरपीएम पर मिलाते हुए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटेड।
  3. जब बैक्टीरिया शुरुआती स्थिर विकास चरण में पहुंच गए हैं, तो उपसंस्कृत एस ऑरियस के 1 मिलील को कमरे के तापमान पर 5 मिन के लिए 1.5 मिलीग्राम माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब और सेंट्रलाइज 5,000 × ग्राम पर स्थानांतरित करें।
  4. केंद्रीकरण के बाद, सुपरनेटेंट को 3 मिलीआर सिरिंज में स्थानांतरित करें। 0.22 माइक्रोन फिल्टर के माध्यम से और बर्फ पर एक नया 1.5 mL माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में सुपरनेट्स पास करें।
  5. एस ऑरियससंस्कृति के लिए इस्तेमाल किया बर्फ ठंड मीडिया के साथ supernatants के धारावाहिक कमजोर प्रदर्शन ।
    नोट: दिखाए गए प्रयोगों के लिए, USA300 औरUSA3001s/S से supernatants बर्फ ठंड टीएसबी के साथ लगातार चार 1/2 लॉग कमजोर किया गया ।
  6. धीरे से ९६ के व्यक्तिगत कुओं में अकेले (नकारात्मक और सकारात्मक नियंत्रण के लिए) सुपरनेटेंट नमूने या मीडिया जोड़ें-अच्छी तरह से १.१५ कदम से बर्फ पर पीएमएन युक्त थाली । इन प्रयोगों के लिए प्रत्येक कुएं में USA300 या USA3000ss/S सुपरनेटेंटनमूनों के 10 माइक्रोन जोड़े गए थे । कुओं में सुपरनेटेंट्स वितरित करने के लिए धीरे-धीरे रॉक प्लेट और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
  7. वांछित समय में, इनक्यूबेटर से प्लेट निकालें और बर्फ पर रखें। सकारात्मक नियंत्रण में 0.5% ट्राइटन एक्स-100 के 40 माइक्रोन जोड़ें अच्छी तरह से।
  8. धीरे से नमूनों को प्रत्येक कुएं में पूरी तरह से प्लेट का पालन करने के लिए ऊपर और नीचे पिपेट करें, फिर नमूनों को बर्फ पर साइटोमेट्री ट्यूब प्रवाहित करने के लिए स्थानांतरित करें जिसमें 1 माइक्रोन ऑफ प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ बर्फ-ठंडे डीपीबीएस का 300 माइक्रोन हो।
  9. फ्लो साइटोमेट्री(चित्रा 2ए)का उपयोग करके प्रोपिडियम आयोडाइड-पॉजिटिव पीएमएनएस के अनुपात को मापें। जब डीएनए के लिए बाध्य, प्रोपिडियम iodide 535/617 एनएम पर उत्तेजना/उत्सर्जन किया है ।

3. फागोसाइटोसिस के बाद मानव बहुरूपपरमाणु ल्यूकोसाइट्स के खिलाफ एस ऑरियस साइटोटॉक्सिकिटी परख

नोट: 600 एनएम (ओडी600)पर ऑप्टिकल घनत्व द्वारा परिभाषित विकास घटता और बैक्टीरिया की एकाग्रता इस परख शुरू करने से पहले परीक्षण किए जाने वाले एस ऑरियस उपभेदों के लिए अनुभवजन्य रूप से निर्धारित की जानी चाहिए। इन प्रयोगों की सफलता के लिए उप-संस्कारी बैक्टीरिया के ओडी600 का उपयोग करके मध्य-घातीय विकास चरण में परीक्षण किए गए प्रत्येक एस ऑरियस तनाव की समान सांद्रता की लगातार फसल की आवश्यकता होती है।

  1. चरण 2.1.1 और 2.1.2 में वर्णित एस ऑरियस उपभेदों और उपसंस्कृति बैक्टीरिया की रातोंरात संस्कृतियों को शुरू करें।
  2. हार्वेस्ट उपसंस्कृत एस ऑरियस जब यह सुसंस्कृत बैक्टीरिया के 1 mL को 1.5 मिलीग्राम माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करके मध्य घातीय विकास तक पहुंच गया है और कमरे के तापमान पर 5 मिन के लिए 5,000 × ग्राम पर अपकेंद्री है।
    नोट: हमारी विकास स्थितियों के तहत, USA300 और USA3000ssaeR/S ऊष्मायन6के लगभग १३५ मिन के बाद मध्य घातीय विकास चरण तक पहुंच गया ।
  3. अधिनायक को एस्पिरेशन के बाद धोएं, डीपीबीएस के 1 मिलील में पेलेइड बैक्टीरिया को फिर से निलंबित करना, 30 एस के लिए नमूना भंवर, और कमरे के तापमान पर 5 मिन के लिए 5,000 × ग्राम पर अपकेंद्री।
  4. 20% मानव सीरम के 1 mL में बैक्टीरियल गोली को फिर से निलंबित करके और 15 मिन के लिए आंदोलन के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटिंग करके ऑप्सोनेज़ एस ऑरियस।
  5. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए 5,000 x ग्राम पर अपकेंद्रित्र ऑप्सोनाइज्ड बैक्टीरिया। सुपरनेटेंट को एस्पिरेशन के बाद एस ऑरियस धोएं, 1 एमएमएल डीपीबीएस में पेलेच बैक्टीरिया को फिर से निलंबित करें, फिर बैक्टीरियल पेलेट पूरी तरह से अलग होने तक नमूना भंवर और अतिरिक्त 30 सेकंड। कमरे के तापमान पर 5 मिन के लिए 5,000 × ग्राम पर अपकेंद्रित्र बैक्टीरिया।
  6. 1 mL RPMI में opsonized एस ऑरियस उपभेदों को फिर से निलंबित करें, बैक्टीरियल गोली पूरी तरह से अलग होने तक नमूना भंवर, और फिर बर्फ पर एक अतिरिक्त 30 एस प्लेस बैक्टीरिया के लिए।
  7. बर्फ-ठंडी आरपीएमआई के साथ वांछित एकाग्रता के लिए पतला ऑप्सानाइज्ड एस ऑरियस उपभेदों। 30 एस के लिए भंवर और बर्फ पर जगह है ।
  8. ट्रिप्टिक सोया एगर पर बैक्टीरिया के 1:10 धारावाहिक कमजोरहोने चढ़ाना द्वारा opsonized एस ऑरियस की एकाग्रता की पुष्टि करें।
    नोट: क्योंकि इस परख में इस्तेमाल बैक्टीरिया की एकाग्रता में अंतर बाद पीएमएन प्लाज्मा झिल्ली परगम्यता(चित्रा 3ए)पर एक बड़ा प्रभाव हो सकता है, यह बहुत महत्वपूर्ण है कि परीक्षण किए गए प्रत्येक तनाव की एकाग्रता हर प्रयोग के लिए निर्धारित की जाती है और उपभेदों के बीच बराबर है।
  9. चरण १.१४ से बर्फ पर ९६-अच्छी तरह से प्लेट में पीएमएनएस में प्रत्येक एस ऑरियस स्ट्रेन या आरपीएमआई (सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के लिए) के १०० μL/अच्छी तरह से जोड़ें । कुओं में एस ऑरियस वितरित करने के लिए धीरे रॉक प्लेट।
  10. 4 डिग्री सेल्सियस15पर 8 मिन के लिए 500 × ग्राम पर प्लेट को केंद्रित करके phagocytosis सिंक्रोनाइज़ करें। अपन्तिफुगेशन (टी = 0) के तुरंत बाद 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट प्लेट।
  11. वांछित समय में, इनक्यूबेटर से प्लेट निकालें और बर्फ पर रखें। सकारात्मक नियंत्रण में 0.5% ट्राइटन एक्स-100 के 40 माइक्रोन जोड़ें अच्छी तरह से।
  12. धीरे से नमूनों को ऊपर और नीचे प्रत्येक कुएं में पूरी तरह से प्लेट का पालन करने के लिए, तो नमूनों को स्थानांतरित करने के लिए बर्फ के २०० μL युक्त बर्फ पर साइटोमेट्री ट्यूबों प्रवाह-प्रोपिडियम iodide के 1 μL के साथ ।
  13. प्रोपिडियम आयोडाइड के लिए नमूनों का विश्लेषण प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके 2.9 चरण में वर्णित है।

Representative Results

हमने यह प्रदशत किया है कि पिछलेअध्ययनोंमें उत्पन्न इस तनाव में एसएईआर/एस (USA30001s/S) द्वारा मानव पीएमएनएस के खिलाफ एस ऑरियस की साइटोटॉक्सिकिसिटीको अपेक्षाकृत निर्धारित करने के लिए ऊपर वर्णित प्रक्रियाओं का उपयोग कैसे किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल की धारा 1 में वर्णित प्रक्रियाओं का उपयोग करके अलग-थलग पीएमएनएस को प्रोपिडियम आयोडाइड से दाग दिया गया और प्रवाह साइटोमेट्री का उपयोग करके जांच की गई। आगे और साइड स्कैटर भूखंडों का उपयोग मोनोसाइट्स या लिम्फोसाइट्स(चित्र ा 1ए, बी)और पीएमएन अखंडता द्वारा शुद्ध पीएमएन के संदूषण को समझाने के लिए किया गया था, जो प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला(चित्रा 1सी)का उपयोग करके निर्धारित किया गया था। मानव पीएमएन शुद्धिकरण की वर्णित विधि लगातार 0.5 x 107 से 1 x 108 पीएमएनएस प्राप्त कर सकती है जो और 98% शुद्ध हैं और और हैं >95% प्रोपिडियम आयोडाइड नकारात्मक।

USA300 और USA3001saeR/S द्वारा उत्पादित बाह्य प्रोटीन की साइटोटॉक्सिकिसिटी का परीक्षण इस प्रोटोकॉल की धारा 2 में वर्णित प्रक्रियाओं के बाद शुद्ध पीएमएनएस(चित्रा 2)के खिलाफ किया गया था । ये प्रयोग USA300(चित्रा 2बी)द्वारा उत्पादित अतिरिक्त प्रोटीन के साथ नशे के 30 न्यूनतम के बाद शुद्ध पीएमएनएस के प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला में एकाग्रता पर निर्भर वृद्धि को प्रदर्शित करते हैं। पिछले अध्ययनों से पता चला है कि SaeR/S दो घटक प्रणाली मानव पीएमएनएस6,10,11,16को लक्षित करने वाले कई द्वि-घटक ल्यूकोसाइडिन की अभिव्यक्ति के लिए महत्वपूर्ण है । इन पिछले निष्कर्षों के साथ अनुकूल, बहुत कम प्रोपिडियम आयोडाइड-सकारात्मक पीएमएनएस USA3000AsaeR/S (चित्रा 2बी)द्वारा उत्पादित एक्स्ट्रासेलुलर प्रोटीन के संपर्क के बाद पता चला । इसके अलावा प्रयोगों ने USA300 एक्स्ट्रासेलुलर प्रोटीन द्वारा नशे के बाद lysed पीएमएनएस के अनुपात में लगातार वृद्धि का प्रदर्शन किया जो लगभग 30 मिन(चित्रा 2सी)के बाद पठार ी था । USA3000SAR/S द्वारा उत्पादित एक्स्ट्रासेलुलर प्रोटीन के संपर्क मेंआने के बाद मानव पीएमएनएस की न्यूनतम लिसिस को सभी समय पर नोट किया गया था । ये परिणाम मानव पीएमएनएस के खिलाफ एक्स्टोसेलर एस ऑरियस प्रोटीन द्वारा साइटोटॉक्सिकिसिटी के सापेक्ष मात्रा के लिए इस परख की उपयोगिता को दर्शाते हैं।

हमने इस प्रोटोकॉल की धारा 3(चित्रा 3)में वर्णित फैगोसाइटोसिस के बाद मानव पीएमएनएस के खिलाफ एस ऑरियस साइटोटॉक्सिकिपरी परख का उपयोग करके USA300 और USA3000ss/S का परीक्षण किया। प्रोपिडियम आयोडाइड सकारात्मक पीएमएनएस के अनुपात में एकाग्रता पर निर्भर वृद्धि USA300(चित्रा 3ए)के फागोसाइटोसिस के बाद 90 न्यूनतम देखी गई थी। पीएमएनएस के अनुपात में एक महत्वपूर्ण कमी देखी गई जो USA3001S/S(चित्रा 3ए)के फागोसाइटोसिस के बाद प्रोपिडियम आयोडाइड सकारात्मक थे, अन्य परिणामों का समर्थन करते हैं जो संकेत देते हैं कि SaeR/S दो घटक प्रणाली मानव पीएमएनएस के खिलाफ एस ऑरियस की साइटोटॉक्सिकिसिटी के लिए महत्वपूर्ण है(चित्रा 2)7,11। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है और चित्रा 3में प्रदर्शित किया गया है, एस ऑरियस एकाग्रता में अंतर का phagocytosis के बाद पीएमएन lysis पर एक स्पष्ट प्रभाव पड़ता है। इन प्रयोगों में से प्रत्येक में इस्तेमाल USA300 और USA3001saeR/S inoculum की गणना से पता चला कि इन उपभेदों के बीच साइटोटॉक्सिकिटी में इसके विपरीत इस्तेमाल बैक्टीरिया की एकाग्रता में अंतर के कारण नहीं था(चित्रा 3बी)। इन निष्कर्षों से पता चलता है कि कैसे phagocytosis के बाद मानव पीएमएनएस के खिलाफ एस ऑरियस साइटोटॉक्सिकिपरी परख का उपयोग मानव पीएमएन प्लाज्मा झिल्ली अखंडता से समझौता करने के लिए विभिन्न एस ऑरियस उपभेदों की क्षमता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है।

Figure 1
चित्रा 1: शुद्ध पीएमएनएस का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण। प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री डॉट भूखंड(ए)शुद्ध मानव पीएमएनएस और(बी)पीएमएनएस जो जानबूझकर परिधीय रक्त मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं से दूषित हो गए हैं। (ग)प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री हिस्टोग्राम न्यूनतम प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला (<1%) 0.05% ट्राइटन एक्स-100 (छायांकित लाल) के साथ इलाज पीएमएनएस की तुलना में शुद्ध पीएमएनएस (छायांकित ग्रे) की। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: एस ऑरियसद्वारा उत्पादित एक्स्ट्रासेलुलर प्रोटीन के साथ नशे में पीएमएनएस का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण। (क)मीडिया नियंत्रण (छायांकित नीला) के साथ ऊष्मायन के 30 मिन के बाद प्रोपिडियम आयोडाइड के साथ दाग ित पीएमएनएस के प्रतिनिधि प्रवाह साइटोमेट्री हिस्टोग्राम, 1:110 (छायांकित ग्रे), या ०.०५% ट्राइटन एक्स-१०० (छायांकित लाल) की अंतिम एकाग्रता पर USA300 supernatant फ़िल्टर । (ख)USA300 या USA300,saeR/S supernatants की विभिन्न सांद्रता के साथ ऊष्मायन के 30 min के बाद प्रोपिडियम आयोडाइड सकारात्मक पीएमएनएस का अनुपात । (ग)यूएसए 300 या USA300 के साथ ऊष्मायन के बाद समय के साथ प्रोपिडियम आयोडाइड सकारात्मक पीएमएनएस का अनुपात 1:110 की अंतिम एकाग्रता परsaeR/S supernatant । डेटा को दो पूंछ वाले टी-टेस्ट द्वारा निर्धारित * पी * 0.05 और ** पी के साथ कम से कम 3 अलग-अलग प्रयोगों के मतलब ± एसईएम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: एस ऑरियसके फागोसाइटोसिस के बाद पीएमएनएस का फ्लो साइटोमेट्री विश्लेषण। (क)प्रोपिडियम आयोडाइड सकारात्मक पीएमएनएस 90 मिन का अनुपात USA300 या USA300 की विभिन्न सांद्रता के phagocytosis के बाद ,saeR/S. (B)पैनल ए में दिखाए गए प्रयोगों के लिए इस्तेमाल ऑपोनाइज्ड एस ऑरियस उपभेदों की एकाग्रता के रूप में प्रस्तुत किया जाता है * p =0.01 के साथ 4 अलग प्रयोगों के मतलब ± SEM के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं * p कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Discussion

यह प्रोटोकॉल मानव रक्त से पीएमएन की शुद्धि और दो अलग-अलग परखों का वर्णन करता है जो इन महत्वपूर्ण जन्मजात प्रतिरक्षा कोशिकाओं के खिलाफ एस ऑरियस की साइटोटॉक्सिकिसिटी की मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड का उपयोग करते हैं। इन प्रक्रियाओं की सफलता शुद्ध पीएमएनएस की गुणवत्ता और इस रोगजनक द्वारा उत्पादित एस ऑरियस और बाह्य प्रोटीन की उचित तैयारी पर निर्भर करेगी। पीएमएनएस के अलगाव के लिए, एंडोटॉक्सिन संदूषण से मुक्त अभिकर्मकों का उपयोग करके, कोशिका तैयारियों का धीरे-धीरे इलाज करके और कोशिकाओं को उचित तापमान पर रखकर शुद्धिकरण के दौरान और बाद में पीएमएन सक्रियण को कम करना महत्वपूर्ण है। पीएमएन की सक्रियता का संकेत देने वाले संकेतों में शुद्धिकरण के दौरान कोशिकाओं का झुरमुट शामिल है और जब 5% से अधिक अलग कोशिकाएं प्रोपिडियम आयोडाइड के लिए सकारात्मक दाग देती हैं। पीएमएन के अपेक्षाकृत कम जीवन काल के कारण, इन कोशिकाओं को मानव रक्त से अलग किया जाना चाहिए और उसी दिन परीक्षण किया जाना चाहिए। पीएमएनएस शुद्धि के बाद 3 घंटे से अधिक समय तक बर्फ पर छोड़ दिया जाए तो सहज एपोप्टोसिस के लक्षण प्रदर्शित करना शुरू कर देंगे। जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, यह बहुत महत्वपूर्ण है कि हर पीएमएन तैयारी का सावधानीपूर्वक मूल्यांकन किया जाता है, जो आगे और साइड स्कैटर के प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के साथ-साथ अलग कोशिकाओं की शुद्धता और अखंडता सुनिश्चित करने के लिए प्रोपिडियम आयोडाइड धुंधला है।

एस ऑरियस द्वारा द्वि-घटक ल्यूकोसाइडिन की अभिव्यक्ति इस प्रोटोकॉल में वर्णित परख ों का उपयोग करके देखी जाने वाली समझौता पीएमएन प्लाज्मा झिल्ली अखंडता के बहुमत के लिए जिम्मेदार है। इन विषाक्त पदार्थों और अन्य पोर बनाने वाले पेप्टाइड्स की अभिव्यक्ति में भिन्नता, जैसे कि फिनॉल-घुलनशील मॉड्यूलिन, एस ऑरियस के उपभेदों के बीच मानव पीएमएनएस के खिलाफ साइटोटॉक्सिकिटी में अंतर पैदा करेगा। एस ऑरियस उपभेदों के बीच इन विट्रो विकास के दौरान महत्वपूर्ण विचलन भी पोर बनाने वाले विषाक्त पदार्थों और बाद में साइटोटॉक्सिकिटी की अभिव्यक्ति को प्रभावित करेगा। इसके अलावा, phagocytosis परख में पीएमएनएस के लिए एस ऑरियस के अनुपात बाद में PMN प्लाज्मा झिल्ली सामर्यता(चित्रा 3ए)पर एक बड़ा प्रभाव पड़ता है और इन प्रयोगों के मध्य घातीय विकास चरण में परीक्षण प्रत्येक एस ऑरियस तनाव के समान सांद्रता की लगातार फसल की आवश्यकता है उपसंस्कृति बैक्टीरिया के ओडी६०० का उपयोग कर । इन बातों को देखते हुए, सभी उपभेदों के लिए विकास घटता को परिभाषित करना बहुत महत्वपूर्ण है, जिनकी साइटोटॉक्सिकिटी परख शुरू करने से पहले जांच की जाएगी। हम इन तरीकों का विश्लेषण करने के लिए इन तरीकों की सिफारिश नहीं करते हैं जो विट्रो में महत्वपूर्ण विकास अंतर प्रदर्शित करने वाले उपभेदों के साथ एस ऑरियस साइटोटॉक्सिकिसिटी का विश्लेषण करते हैं।

USA300 एक उग्र MRSA अलग है कि मानव पीएमएनएस15 के खिलाफ अत्यधिक साइटोटॉक्सिक होने के लिए जाना जाता है और इस तनाव में SaeR/S के नुकसान नाटकीय रूप से कई द्वि-घटक ल्यूकोसाइडिन ्स के प्रतिलेखन को कम कर देता है जो मानव पीएमएन6,12को लक्षित करते हैं, जिससे इन उपभेदों को वर्णित साइटोटॉक्सकी की तुलना करने के लिए आदर्श मॉडल बनाते हैं। हालांकि, विभिन्न एस ऑरियस अलग-अलग के बीच व्यापक आनुवंशिक भिन्नता है और इन प्रोटोकॉलों में विस्तृत मापदंडों के परिणामस्वरूप अन्य एस ऑरियस उपभेदों का परीक्षण करते समय मानव पीएमएनएस के खिलाफ साइटोटॉक्सिकिटी में पर्याप्त परिवर्तन नहीं हो सकते हैं। विकास की स्थिति को सिलाई करना, सुपरनेटेंट की मात्रा, या पीएमएनएस में बैक्टीरिया का अनुपात एस ऑरियसके अन्य उपभेदों का उपयोग करके इन तरीकों के साथ सफलता के लिए आवश्यक हो सकता है।

Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम को अमेरिका के स्वास्थ्य अनुदान एनआईएच के राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया था-1R56AI 135039-01A1, 1R21A128295-01, U54GM115371 के साथ ही मोंटाना राज्य विश्वविद्यालय कृषि प्रयोग स्टेशन से धन, और मुर्डॉक चैरिटेबल ट्रस्ट से एक उपकरण अनुदान .

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container Baxter 2B1323Q PMN purification
1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps VWR 89000-044 Used in washing cells
1.8% Sodium Chloride Solution Sigma-Aldrich S5150 PMN purification
12x75mm Culture tubes VWR 60818-430 Used as flow cytometry tubes
20% (w/w) Dextran Sigma-Aldrich D8802 PMN purification
3125 Hand Tally Counter Traceable Products 3125CC For counting cells
50 mL conical centrifuge tubes VWR 89039-656 For dispensing media
Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium FischerScientific 211823 For growing cell cultures
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL FischerScientific BD 309657 For filtering supernatants
Bright-Line Hemocytometer Sigma-Aldrich Z359629 Cell counting apparatus
DPBS, 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium Corning 21-030-CV Used in washing cells
Ficoll-Paque PLUS GE Healthcare 17-1440-02 PMN purification
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets FischerScientific 13-678-11E For aspirating liquid
Greiner CELLSTAR 96 well plates Millipore Sigma M0687 Plate for holding experimental samples
OMICRON Syringe Filters Omicron Scientific SFPV13R For filtering supernatants
Propidium iodide ThermoFisher Scientific P3566 Membrane impermeable DNA stain
PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks Cole-Parmer EW-34503-24 For growing cell cultures
RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red Corning 17-105-CV Used in resuspending cells
Sterile Water for Irrigation, USP Baxter 2F7113 PMN purification
The Pipette Pump Bel-Art Products F37898 For aspirating liquid
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Membrane integrity positive control

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References

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Erratum

Formal Correction: Erratum: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes
Posted by JoVE Editors on 06/10/2021. Citeable Link.

An erratum was issued for: Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes. The title was updated.

The title was updated from:

Quantifying the Cytotoxicity of Staphyloccus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

to:

Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes

मानव बहुरूपपरमाणु ल्यूकोसाइट्स के खिलाफ <em>स्टेफिलोकस ऑरियस</em> की साइटोटॉक्सिकिटी का आकलन
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Dankoff, J. G., Pallister, K. B., Guerra, F. E., Parks, A. J., Gorham, K., Mastandrea, S., Voyich, J. M., Nygaard, T. K. Quantifying the Cytotoxicity of Staphylococcus aureus Against Human Polymorphonuclear Leukocytes. J. Vis. Exp. (155), e60681, doi:10.3791/60681 (2020).More

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