量化金黄色葡萄球菌对人多态核白细胞的细胞毒性

Summary

该协议描述了从全人类血液中纯化多态核白细胞的方法，以及两种独特的测定方法，用于量化金黄色葡萄球菌对这些重要的先天免疫细胞的细胞毒性。

Abstract

金黄色葡萄球菌能够分泌广泛的白细胞，靶向和破坏多态核白细胞（PMN或中性粒细胞）的膜完整性。该协议描述了人类PMN的纯化和对PMN的S.氨细胞毒性的定量。第 1 节详细介绍了使用密度离心从人血中分离 PMN 和血清。第2节测试由A.aureus产生的细胞外蛋白质对这些纯化的人类PMN的细胞毒性。 第3节测量活S.Aureus的噬菌体后对人体PMN的细胞毒性。这些程序使用用碘化钠（一种DNA结合的荧光素）处理的PMN的流式细胞测定分析，测量S.aureus白细胞素对PMN血浆膜完整性的破坏，这是一种细胞膜不渗透的DNA结合荧光素。总之，这些方法具有快速测试对原发性人PMN的A.氨细胞毒性的优点，并可以很容易地适应研究宿主-病原体相互作用的其他方面。

Introduction

金黄色葡萄球菌是一种引起人类广泛疾病的革兰氏阳性细菌。这种突出的病原体产生许多毒性因素，导致感染的不同方面。这些包括表面分子，使S.aureus粘附到不同类型的宿主组织^1，细胞外蛋白质干扰宿主免疫反应^2，和一系列分泌的毒素，针对不同类型的宿主细胞^3。在本报告中，我们描述了一种将Aureus产生的细胞外蛋白对人多态核白细胞（PMN或中性粒细胞）的细胞外毒性量化的方法，这种细胞毒性是宿主先天免疫反应的主要效应细胞。

PMN是哺乳动物中最丰富的白细胞。这些循环免疫细胞被迅速招募到宿主组织侮辱的部位，以回应宿主细胞或入侵微生物特有的化合物产生的危险信号。在外溢过程中，从这些分子和与活化的宿主细胞直接接触的细胞外输入增加了PMN的激活状态，这个过程称为启动^4，5。到达不良组织的引性PMN然后执行重要的先天免疫反应，以防止感染的建立。这些包括结合和内化，或方位体化，入侵微生物，触发细胞内事件累积的微生物破坏由一组强效抗菌化合物^5。

PMN在保护人类免受病原体入侵方面发挥着至关重要的作用，对于预防金黄色葡萄球菌感染尤为重要^。然而，这种细菌产生广泛的毒性基因，阻碍不同的PMN功能。这些蛋白质包括细胞外蛋白质，阻止信号分子的识别，防止附着组织粘附，抑制抗菌化合物的产生，并损害血浆膜的完整性^4。Aureus通过来自多个双组分感觉系统的集体输入来协调这些毒力基因的时间表达，这些系统能够识别特定的环境线索。SaeR/S双组分系统是感染^{6、7、8、9、10、11}期间S.aureus毒力基因转录的主要上调节器。特别是，这种双组分系统已被证明对生产特别针对人类PMN¹²的双组分白细胞素至关重要。

该协议分为三个不同的部分。第一部分使用根据Böyum¹³和Nauseef¹⁴建立的方法改编的协议，使用密度梯度离心法从人类血液中纯化PMN。第二节和第三节详细介绍了两种不同的技术来检查S.aureus细胞毒性;一种用S.aureus产生的细胞外蛋白质使PMN中毒，而另一种则检查活细菌在噬菌体后损害PMN的能力。这些程序使用碘化钠测量由S.aureus孔隙形成毒素引起的PMN血浆膜完整性损失。碘化钠是一种DNA结合的荧光素，通常细胞膜不透水，但可以穿过被S.aureus毒素破坏的血浆膜。流式细胞学分析允许碘化阳性PMN的快速定量，以测量S.aureus菌株的相对细胞毒性。甲氧西林抗黄体素（MRSA）被确定为脉冲场凝胶电泳类型USA300和同源删除突变的saeR/S在该菌株（USA300+saeR/S）已被用作模型，以证明这些程序可以量化S.aureus对人体PMN的细胞毒性。

Protocol

健康献血者从肝素静脉血收集根据蒙大拿州立大学人体学科机构审查委员会批准的协议。所有捐助者均表示同意参加本研究。

1. 人类多态核白细胞的纯化和人血清的分离

注：所有试剂均应使用市售内毒素检测试剂盒定期检查内毒素是否存在，并应含有<25.0 pg/mL内毒素，以防止PMN产生不必要的启动。

1. 携带 50 mL 的 3% dextran-0.9% NaCl （w/v），35 mL 的 0.9% NaCl （w/v），20 mL 的 1.8% NaCl （w/v），12 mL 的 1.077 g/mL 密度梯度溶液，以及 20 mL 的注水或灌溉级水到室温。
2. 为了分离人血清，在15 mL玻璃管中37°C下孵育4 mL新鲜抽取的人体血液，无需抗凝血剂30分钟。孵育后，在室温下以2，000~3，000 μg为10分钟。将上血清层转移到新鲜的15 mL圆锥形离心管中，并放在冰上。
3. 将25 mL的新鲜提取的肝素化（1000单位/mL）全人血与25 mL的室温3%dextran-0.9%NaCl（1：1比例）结合在两个复制50 mL锥形离心管（每管50 mL总体积）。通过轻轻摇动每个 50 mL 锥形管进行混合，然后在室温下站立 30 分钟。
4. 在室温下孵育后，会出现两个独立的层。将每个 dextran-血混合物的顶层转移到新的 50 mL 锥形管中，并在室温下以 450 x g离心 10 分钟，且无制动器。
5. 小心吸出上生子并丢弃，而不会干扰细胞颗粒。在室温为0.9%NaCl的2 mL中轻轻重新悬浮每个细胞颗粒，将重新悬浮的颗粒组合在一个50 mL锥形管中，然后加入剩余的0.9%NaCl（最终体积为35 mL）。
6. 使用手移液器在细胞悬浮液下方小心地将10 mL的室温1.077 g/mL密度梯度溶液覆盖。在室温下，在低或无制动器下以 450 x g旋转 30 分钟。轻轻吸出上清液，而不会干扰细胞颗粒。上清液将含有外周血单核细胞，可以收集如前^所述14。
7. 通过在室温水中20 mL中重新悬浮细胞颗粒来使红血球赖尔。轻轻混合通过摇动管30s。红血球的流化将伴随着浊度的明显下降。
8. 立即加入20 mL的1.8%NaCl（在室温[RT]）和离心机样品在450 μg在室温10分钟。
   注： 在红细胞裂洛后，尽量减少PMN单独留在水中的时间，以最大限度地提高PMN产量并防止PMN裂化和/或激活，这一点很重要。
9. 小心吸出上清液，而不会干扰细胞颗粒。轻轻将细胞颗粒重新悬浮在 2 mL 的 RT RPMI 1640 介质中，并放置在冰上。
10. 使用血细胞计对细胞进行计数。用冰冷的RPMI将纯化PMN以1 x10⁷细胞/mL的浓度重新悬浮，并保持在冰上。
11. 将 100 μL 的纯化 PMN（1 x 10⁶细胞）与 300 μL 的冰冷 Dulbeco 的磷酸盐缓冲盐水 （DPBS） 结合在两个复制的流式细胞测定管中，含有 1 μL 的碘化钠染色。为了对血浆膜损伤进行正控制，将40μL的0.5%Triton X-100溶液加入流式细胞测定管中，并彻底混合。
12. 使用流式细胞测量测量纯化细胞的正向散射、侧散射和碘化钠染色（激励/排放最大值为535/617 nm）的纯化细胞（图1）。
    注：正向和侧散射分析将识别淋巴细胞和单核细胞的不需要种群。碘化钠只会染色具有受损血浆膜和纯化PMN的细胞，这些PMN具有明显的碘化钠阳性细胞群，不应使用。对于这些研究，纯化PMN仅在其包括>98%的纯化细胞和<5%染色阳性碘化钠时才使用。
13. 通过涂覆用于此测定的 100 μL 的 20% 分离的人类血清（已用 DPBS 稀释）的单个孔，为 PMN 细胞毒性测定准备 96 孔板。
    注：直接在塑料或玻璃上电镀PMN会导致细胞激活。确保至少包括一个仅接收介质的负控制井和接收 0.05% Triton X-100 的正控制井。
14. 在37°C下孵育板30分钟。孵育后，用冰冷的DPBS清洗涂膜孔两次，以去除任何多余的血清。轻轻按上下颠倒的盘子，取出任何残留的 DPBS 并放置在冰上。
15. 在每个涂层井（1 x 10⁶ PMN/井）中，以1 x 10⁷细胞/mL轻轻添加100 μL纯化的人体PMN。通过在冰上孵育板至少5分钟，让PMN在井中沉淀，保持板的水平，使每个井中的细胞均匀分布，并留在冰上，以避免PMN的意外激活。

2. 对人多态核白细胞的S.aureus细胞外蛋白的细胞毒性测定

1. 培养性 S. aureus在锥体大豆汤 （TSB） 中使用 37°C 的摇动培养箱过夜。对于这些研究，在单独的 150 mL Erlenmeyer 烧瓶中，20 mL TSB 接种了S. aureus菌株 USA300 或 USA300+saeR/S的冷冻培养物，生长约 14 小时，在 250 rpm 下摇动。
2. 亚培养S. aureus通过使用新鲜介质对隔夜细菌培养进行 1：100 稀释。在37°C下孵育，摇动，直到细菌达到早期静止生长阶段。
   注：对于这些实验，在150 mL Erlenmeyer 烧瓶中接种200 μL 隔夜培养的 USA300 或 USA300°saeR/S的 20 mL 试青大豆汤，并在 37°C 下孵育，在 250 rpm 下摇动 5 小时。
3. 当细菌达到早期固定生长阶段时，将1 mL的亚培养的S.氨胶转移到1.5 mL微离心管中，并在室温下以5000 μ g离心5分钟。
4. 离心后，将上清液转移到3mL注射器中。将超生物通过 0.22 μm 过滤器，进入冰上新的 1.5 mL 微离心管。
5. 使用用于培养S. aureus的冰冷的介质对超生物进行连续稀释。
   注：对于所示的实验，来自美国300和USA300+saeR/S的超生物连续进行了四次1/2对数稀释与冰冷的TSB。
6. 从步骤 1.15 起，将仅将上清样品或介质轻轻添加到 96 孔板上含有 PMN 的 96 孔板的单个孔中（用于负和正控制）。对于这些实验，将10μL的USA300或USA300°saeR/S上清样品添加到每个井中。轻轻的岩板在井中分配上生物，并在37°C下孵育。
7. 在所需时间，从培养箱中取出盘子，放在冰上。将 40 μL 的 0.5% Triton X-100 添加到正控制井中。
8. 轻轻地将样品上下移移到每口孔中，以完全拉出所有附着在板上的PMN，然后将样品转移到冰面上流式细胞测定管，其中含有300 μL的冰冷DPBS，含有1μL的碘化钠。
9. 使用流动细胞测定测量碘化钠阳性PMN的比例（图2A）。当与DNA结合时，碘化钠在535/617nm处有激发/发射。

3. 在噬菌体后，对人多态核白细胞的Aureus细胞毒性测定

注：生长曲线由600nm（OD_600）的光学密度和细菌浓度所定义，在开始此测定之前，必须根据经验确定要测试的S.aureus菌株。这些实验的成功要求使用亚培养细菌的OD₆₀₀在指数中生长阶段测试的每种A.aureus菌株的浓度一致。

1. 如步骤 2.1.1 和 2.1.2 中所述，开始一夜之间培养S. aureus菌株和亚培养细菌。
2. 在达到中指数增长时，通过将培养细菌的 1 mL 转移到 1.5 mL 微离心管并在室温下在 5，000 μ g下离心 5 分钟，收获亚培养的 S. aureus。
   注：在我们的生长条件下，USA300和USA300+saeR/S在大约135分钟的孵育⁶后达到中指数增长阶段。
3. 离心后通过吸气上清液、在 DPBS 的 1 mL 中重新悬浮颗粒细菌、将样品涡旋 30 s 和在室温下在 5，000 μ g下离心 5 分钟来洗涤S. aureus。
4. 将用DPBS稀释的1mL的20%人血清中重新悬浮细菌颗粒，并在37°C下用搅拌孵育15分钟。将S.aureus重新悬浮在1mL中。
5. 在室温下，在5，000 x g下将离心菌化5分钟。在离心后通过吸气上清液，将颗粒细菌重新悬浮在1 mL DPBS中，然后涡旋样品，直到细菌颗粒完全破碎，再加30秒，洗净了Aureus。在室温下，在5，000~g下离心细菌5分钟。
6. 在1mL RPMI中重新悬浮成蛋白酶菌株，涡旋样品，直到细菌颗粒完全破碎，然后再将细菌放在冰上30s。
7. 用冰冷的RPMI稀释蛋白酶菌株至所需浓度。涡旋30s，并放置在冰上。
8. 通过在胰胶大豆琼脂上电镀1：10连续稀释细菌，确认蛋白石S.金黄色葡萄球菌的浓度。
   注：由于此测定中使用的细菌浓度差异会对随后的PMN血浆膜渗透性产生重大影响（图3A），因此，每个实验的菌株浓度确定，并且菌株之间具有等效性，这一点非常重要。
9. 从步骤 1.14 开始，在 96 孔板上的 PMN 中，将每个S. 铝菌株或 RPMI（用于正负控制）的 100 μL/孔轻轻添加。轻轻地摇动石板，在井中分配S. 金黄色葡萄球。
10. 在^4°C15下，在500 μ g下离心板8分钟，同步方位细胞化。离心后在37°C下孵育板（T = 0）。
11. 在所需时间，从培养箱中取出板并放置在冰上。将 40 μL 的 0.5% Triton X-100 添加到正控制井中。
12. 轻轻地将样品上下移移到每个孔中，以完全拉出所有附着在板上的PMN，然后将样品转移到含有200 μL的冰冷DPBS的冰上，用1μL的碘化钠流动细胞学管。
13. 使用流式细胞测定法分析碘化钠染色的样品，如步骤 2.9 中所述。

Representative Results

我们已经演示了如何使用上述程序来相对量化S.aureus对人体PMN的细胞毒性，使用MRSA PFGE型USA300和在先前研究⁶中生成的该菌株（USA300+saeR/S）中saeR/S的异源删除突变。使用本协议第1节所述程序分离的PMN被染色了碘化钠，并使用流式细胞学进行了检查。前部和侧散射图用于说明单核细胞或淋巴细胞对纯化PMN的污染（图1A，B），PMN完整性是使用碘化钠染色确定的（图1C）。所述的人类PMN纯化方法可以持续产生0.5 x 10⁷至10⁸ PMN，纯度>98%，碘化钠负。

USA300 和 USA300+saeR/S产生的细胞外蛋白的细胞毒性根据纯化 PMN（图 2）进行了测试，遵循本协议第 2 节所述的程序。这些实验表明，在用USA300产生的细胞外蛋白中毒30分钟后，纯化PMN的碘化染色的浓度依赖性增加（图2B）。先前的研究已经表明，SaeR/S双组分系统对于表达许多针对人类PMN^{6、10、11、16}的双组分白细胞素非常重要。与之前的这些发现一致，在接触USA300+saeR/S产生的细胞外蛋白（图2B）后，很少检测到碘化钠阳性PMN。进一步的实验表明，在USA300细胞外蛋白中毒后，被源化PMN的比例稳步上升，这些蛋白质在大约30分钟后趋于稳定（图2C）。在接触USA300+saeR/S产生的细胞外蛋白质后，在所有时间点上都注意到人类PMN的最小解酶。这些结果说明了这种测定对细胞外S.aureus蛋白对人体PMN的细胞毒性的相对定量的效用。

我们测试了USA300和USA300+saeR/S，使用S.aureus细胞毒性测定法，对本议定书第3节（图3）中描述的人类PMN进行检测。在USA300的吞噬后90分钟观察到碘化钠阳性PMN比例的浓度依赖性增加（图3A）。在USA300+saeR/S（图3A）之后，碘化钠阳性的PMN比例显著下降，支持了其他结果表明SaeR/S双组分系统对S.aureus对人体PMN的细胞毒性（图2）7、11）的重要性。如前文所述，如图3A所示，在噬菌体后，金黄色浓度的差异对PMN莱沙有显著影响。对上述每个实验中使用的USA300和USA300_saeR/S接种液的列举表明，这些菌株之间的细胞毒性对比不是由于所用细菌浓度的差异（图3B）。这些发现表明，在噬菌体后，对人体PMN的S.氨细胞毒性测定可用于评估不同Aureus菌株损害人类PMN血浆膜完整性的能力。

图1：纯化PMN的流式细胞测定分析。代表性流细胞学点图的纯化的人类PMN和（B） PMN被故意污染的外周血单核细胞.（C） 代表性流式细胞直方图，显示碘化钠染色量最小（<1%）纯化PMN（阴影灰色）与用0.05%Triton X-100（阴影红色）处理的PMN相比。请点击此处查看此图的较大版本。

图2：用S.aureus产生的细胞外蛋白对PMN的流式细胞学分析。（A） 在培养30分钟后，用介质控制（阴影蓝色），过滤的USA300上清液，最终浓度为1：110（阴影灰色），或0.05%Triton X-100（阴影红色），代表流量细胞学直方图。（B） 不同浓度为USA300或USA300+saeR/S超生剂孵育30分钟后碘化钠阳性PMN的比例。（C） 与 USA300 或 USA300°saeR/S上清液孵育后，碘化钠阳性 PMN 的比例，最终浓度为 1：110。数据以平均值 = SEM 形式呈现，至少 3 个单独的实验，由 ± p = 0.05 和 ± p = 0.005，由双尾 t 检验确定。请点击此处查看此图的较大版本。

图3：在S.金尿毒症的噬菌体后PMN的流式细胞学分析。（A） 碘化钠阳性PMN的比例在US300或USA300或USA300®saeR/S. （B）用于小组A所示实验的实验的蛋白酶浓度后90分钟，以平均= SEM的形式呈现，由两尾t-测试确定。请点击此处查看此图的较大版本。

Discussion

该协议描述了从人体血液中纯化PMN和两种截然不同的测定，使用碘化钠来量化S.aureus对这些重要的先天免疫细胞的细胞毒性。这些程序的成功将取决于纯化PMN的质量以及这种病原体产生的S.氨基和细胞外蛋白质的适当制备。为了分离PMN，重要的是在纯化期间和之后使用不含内毒素污染的试剂，温和地处理细胞制剂，并将细胞保持在适当的温度，从而尽量减少PMN的活化。指示PMN激活的符号包括细胞在纯化期间和超过5%的分离细胞染色阳性碘化钠时聚集。由于PMN的寿命相对较短，这些细胞必须从人体血液中分离出来，并在同一天进行测试。PMN在纯化后留在冰上超过3小时，将开始表现出自发凋亡的迹象。如前所述，使用向前和侧面散射的流式细胞测定分析以及碘化钠染色，确保分离细胞的纯度和完整性，对每种PMN制剂进行仔细评估是非常重要的。

S. aureus表达的双组分白细胞球菌负责使用本协议中所述的测定观察到的大多数受损的PMN血浆膜完整性。这些毒素和其他孔隙形成肽（如苯酚可溶性多聚素）在S.氨基苯株之间的表达变化，会产生细胞毒性对人体PMN的差异。 此外，在方细胞测定中，S.氨球与PMN的比例对随后的PMN血浆膜渗透性有重大影响（图3A），这些实验要求使用亚培养细菌的OD₆₀₀在中指数生长阶段测试的每种A.aureus菌株的浓度一致。考虑到这些考虑，在开始细胞毒性测定之前，定义所有将检查的菌株的生长曲线是非常重要的。我们不推荐这些方法来分析在体外表现出显著生长差异的菌株的S.aureus细胞毒性。

USA300 是一种致命的MRSA分离物，已知对人类 PMN¹⁵具有高细胞毒性，该菌株中的 SaeR/S 的丢失大大减少了针对人类 PMN^6、12的众多双组分白细胞素的转录，使这些菌株成为使用所述测定方法比较细胞毒性的理想模型。然而，不同的A.aureus分离物之间存在广泛的遗传变异，在测试其他Aureus菌株时，这些协议中详述的参数可能不会导致细胞毒性对人类PMN的实质性变化。定制生长条件，添加的超生物量，或细菌与PMN的比例可能需要使用这些方法使用其他菌株的S.aureus的成功。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container	Baxter	2B1323Q	PMN purification
1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps	VWR	89000-044	Used in washing cells
1.8% Sodium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	S5150	PMN purification
12x75mm Culture tubes	VWR	60818-430	Used as flow cytometry tubes
20% (w/w) Dextran	Sigma-Aldrich	D8802	PMN purification
3125 Hand Tally Counter	Traceable Products	3125CC	For counting cells
50 mL conical centrifuge tubes	VWR	89039-656	For dispensing media
Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium	FischerScientific	211823	For growing cell cultures
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL	FischerScientific	BD 309657	For filtering supernatants
Bright-Line Hemocytometer	Sigma-Aldrich	Z359629	Cell counting apparatus
DPBS, 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium	Corning	21-030-CV	Used in washing cells
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	17-1440-02	PMN purification
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets	FischerScientific	13-678-11E	For aspirating liquid
Greiner CELLSTAR 96 well plates	Millipore Sigma	M0687	Plate for holding experimental samples
OMICRON Syringe Filters	Omicron Scientific	SFPV13R	For filtering supernatants
Propidium iodide	ThermoFisher Scientific	P3566	Membrane impermeable DNA stain
PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks	Cole-Parmer	EW-34503-24	For growing cell cultures
RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red	Corning	17-105-CV	Used in resuspending cells
Sterile Water for Irrigation, USP	Baxter	2F7113	PMN purification
The Pipette Pump	Bel-Art Products	F37898	For aspirating liquid
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	Membrane integrity positive control