Denne protokol beskriver en metode til rensning af polymorphonukleare leukocytter fra hele humant blod og to særskilte analyser, der kvantificerer cytotoksicitet af Staphylococcus aureus mod disse vigtige medfødte immunceller.
Staphylococcus aureus er i stand til at udskiller en bred vifte af leukocidiner, der er målrettet og forstyrrer membranens integritet af polymorphonukleare leukocytter (PMNs eller neutrofiler). Denne protokol beskriver både rensning af humane Pmn’er og kvantificering af S. aureus cytotoksicitet mod PMNs i tre forskellige sektioner. Afsnit 1 beskriver isoleringen af PMNs og serum fra humant blod ved hjælp af tæthed centrifugering. Afsnit 2 tester cytotoksiciteten af ekstracellulære proteiner produceret af S. aureus mod disse rensede humane Pmn’er. punkt 3 måler cytotoksiciteten mod humane pmn’er efter fagocytose i live S. aureus. Disse procedurer måler afbrydelse af PMN-plasma membranens integritet med S. aureus leukocidiner ved hjælp af flow cytometri-analyse af pmn’er, der er behandlet med propidium iodide, en DNA-bindende fluoroforet, som er cellemembranen uigennemtrængelig. Kollektivt, disse metoder har den fordel, at hurtigt at teste S. aureus cytotoksicitet mod primære humane PMNs og kan let tilpasses til at studere andre aspekter af vært-patogen interaktioner.
Staphylococcus aureus er en gram positiv bakterie, der forårsager et bredt spektrum af sygdomme hos mennesker. Denne fremtrædende patogen producerer talrige virulensfaktorer, der bidrager til forskellige aspekter af infektion. Disse omfatter overflade molekyler, der tillader S. aureus at overholde forskellige typer af Host tissue1, ekstracellulære proteiner, der forstyrrer værten immunrespons2, og en vifte af udskilt toksiner, der er målrettet forskellige typer af værtsceller3. I denne rapport beskriver vi en metode, der kvantificerer cytotoksiciteten af ekstracellulære proteiner produceret af S. aureus mod humane polymorphonukleære leukocytter (PMNs eller neutrofiler), primære Effector celler i værts medfødte immunrespons.
PMNs er de mest rigelige leukocytter i pattedyr. Disse cirkulerende immunceller er hurtigt rekrutteret til stedet for vært væv fornærmelse som reaktion på faresignaler produceret af residente celler eller af forbindelser, der er unikke til at invadere mikrober. Det ekstracellulære input fra disse molekyler og fra direkte kontakt med aktiverede residente værtsceller under ekstravasation øger PMNs aktiveringstilstand i en proces, der kaldes priming4,5. Primede PMNs, der har nået nødlidende væv derefter udføre vigtige medfødte immunrespons designet til at forhindre etablering af infektion. Disse omfatter binding og internalisering, eller fagocytose, af invaderende mikroorganismer, der udløser en kaskade af intracellulære hændelser kumulering i mikrobe ødelæggelse af et batteri af potente antimikrobielle forbindelser5.
PMNs spiller en vigtig rolle for at beskytte mennesker mod at invadere patogener og er særligt vigtige for forebyggelse af S. aureus -infektion4. Men denne bakterie producerer en bred vifte af virulens gener, der hæmmer forskellige PMN funktioner. Disse omfatter ekstracellulære proteiner, der blokerer genkendelse af signalering molekyler, forhindre vedhæftning til vært væv, hæmme produktionen af antimikrobielle forbindelser, og kompromittere plasma membran integritet4. S. aureus orkestreer det tidsmæssige udtryk for disse virulens gener gennem den kollektive input fra flere to-komponent sensoriske systemer, der genkender specifikke miljømæssige signaler. Saer/S to-komponentsystem er en større op-regulator af S. aureus virulens gen transskription under infektion6,7,8,9,10,11. Dette system med to komponenter har især vist sig at være afgørende for produktionen af bikomponent-leukocidiner, der specifikt er rettet mod humane Pmn’er12.
Denne protokol er opdelt i tre forskellige sektioner. Det første afsnit beskriver rensning af PMNs fra humant blod ved hjælp af tæthed gradient centrifugering ved hjælp af en protokol, der er blevet tilpasset fra metoder, der er fastsat af Bøyum13 og Nauseef14. Det andet og tredje afsnit detaljeret to forskellige teknikker til at undersøge S. aureus cytotoksicitet; en beruset PMNs med ekstracellulære proteiner produceret af S. aureus mens den anden undersøger muligheden for levende bakterier til at beskadige PMNs efter fagocytose. Disse procedurer bruger propidium kaliumiodid til at måle tabet af PMN-plasma membran integritet forårsaget af S. aureus pore dannende toksiner. Propidium kaliumiodid er en DNA-bindende fluoroforet, der normalt er celle membran uigennemtrængelig, men kan krydse plasma membraner, der er blevet forstyrret af S. aureus toksiner. Flow cytometri analyse giver mulighed for hurtig kvantificering af propidium iodide-positive Pmn’er til måling af den relative cytotoksicitet af S. aureus stammer. Methicillin-resistent S. aureus (MRSA) identificeret som pulsed-felt gel elektroforese type USA300 og en isogene sletnings mutant af saer/s i denne stamme (USA300Δsaer/s) er blevet anvendt som modeller til at påvise, hvordan disse procedurer kan kvantificere cytotoksicitet af S. aureus mod humane pmn’er.
Denne protokol beskriver rensningen af Pmn’er fra humant blod og to særskilte analyser, der anvender propidium Iodid til kvantificering af S. aureus cytotoksicitet mod disse vigtige medfødte immunceller. Succesen med disse procedurer vil afhænge af kvaliteten af rensede Pmn’er og den passende forberedelse af S. aureus og ekstracellulære proteiner, der produceres af dette patogen. Til isolering af PMNs er det vigtigt at minimere PMN-aktivering under og efter rensning ved hjælp af reagenser, der er fri for endotoksin kontaminering, behandling af celle præparater forsigtigt og opbevaring af celler ved den rette temperatur. Tegn, der indikerer aktivering af PMNs omfatter sammenklumpning af celler under rensning og når mere end 5% af isolerede celler pletter positiv for propidium iodide. På grund af PMNs relativt korte levetid skal disse celler isoleres fra humant blod og testes samme dag. PMNs vil begynde at udvise tegn på spontan apoptose hvis venstre på is i mere end 3 h efter rensning. Som tidligere nævnt er det meget vigtigt, at hvert PMN-præparat evalueres omhyggeligt ved hjælp af flow cytometri-analyse af frem-og side spredning samt propidium-kaliumiodid-farvning for at sikre de isolerede celleres renhed og integritet.
Ekspression af bikomponent leukocidiner af S. aureus er ansvarlig for størstedelen af kompromitteret PMN-plasma membran integritet, som observeres ved hjælp af de analyser, der er beskrevet i denne protokol. Variation i ekspression af disse toksiner og andre pore dannende peptider, såsom phenol-opløselige modulins, mellem stammer af S. aureus vil producere forskelle i cytotoksicitet mod humane PMNs. signifikante afvigelser under in vitro vækst mellem s. aureus stammer vil også påvirke ekspression af pore dannende toksiner og efterfølgende cytotoksicitet. Desuden har forholdet mellem S. aureus og PMNs i fagocytose analyser en stor indvirkning på den efterfølgende PMN-plasma membran permeabilitet (figur 3a), og disse eksperimenter kræver en konsekvent høst af lige store koncentrationer af hver S. aureus -stamme, der testes i midten af eksponentiel vækstfase ved hjælp af OD600 af under dyrkede bakterier. I betragtning af disse overvejelser, er det meget vigtigt at definere vækstkurver for alle stammer, der vil blive undersøgt før påbegyndelse cytotoksicitet assays. Vi anbefaler ikke disse metoder til at analysere S. aureus cytotoksicitet med stammer, der udviser betydelige vækstforskelle in vitro.
USA300 er en virulente MRSA isolat, der er kendt for at være meget cytotoksisk mod humane PMNs15 og tabet af saer/S i denne stamme dramatisk reducerer transkriptionen af talrige bi-komponent leukocidiner, der er målrettet humane PMNs6,12, hvilket gør disse stammer ideelle modeller for at sammenligne cytotoksicitet ved hjælp af de beskrevne analyser. Der er imidlertid omfattende genetisk variation mellem forskellige s. aureus -isolater, og parametrene i disse protokoller må ikke resultere i væsentlige ændringer i cytotoksicitet mod humane pmn’er ved afprøvning af andre s. aureus -stammer. Skræddersy vækstbetingelser, mængder af supernatanter tilsat, eller forholdet mellem bakterier til PMNs kan være nødvendig for succes med disse metoder ved hjælp af andre stammer af S. aureus.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af den amerikanske National Institutes of Health tilskud NIH-1R56AI135039-01A1, 1R21A128295-01, U54GM115371 samt midler fra Montana State University Agriculture eksperiment Station, og et udstyr tilskud fra Murdock velgørende Trust .
0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container | Baxter | 2B1323Q | PMN purification |
1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps | VWR | 89000-044 | Used in washing cells |
1.8% Sodium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | S5150 | PMN purification |
12x75mm Culture tubes | VWR | 60818-430 | Used as flow cytometry tubes |
20% (w/w) Dextran | Sigma-Aldrich | D8802 | PMN purification |
3125 Hand Tally Counter | Traceable Products | 3125CC | For counting cells |
50 mL conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | For dispensing media |
Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium | FischerScientific | 211823 | For growing cell cultures |
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL | FischerScientific | BD 309657 | For filtering supernatants |
Bright-Line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Cell counting apparatus |
DPBS, 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | Used in washing cells |
Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | PMN purification |
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets | FischerScientific | 13-678-11E | For aspirating liquid |
Greiner CELLSTAR 96 well plates | Millipore Sigma | M0687 | Plate for holding experimental samples |
OMICRON Syringe Filters | Omicron Scientific | SFPV13R | For filtering supernatants |
Propidium iodide | ThermoFisher Scientific | P3566 | Membrane impermeable DNA stain |
PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks | Cole-Parmer | EW-34503-24 | For growing cell cultures |
RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red | Corning | 17-105-CV | Used in resuspending cells |
Sterile Water for Irrigation, USP | Baxter | 2F7113 | PMN purification |
The Pipette Pump | Bel-Art Products | F37898 | For aspirating liquid |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Membrane integrity positive control |