Este protocolo descreve um método para a purificação de leukócitos polimorfosnucleares de sangue humano inteiro e dois ensaios distintos que quantificam a citotoxicidade de Staphylococcus aureus contra essas importantes células imunes inatas.
Staphylococcus aureus é capaz de secretar uma ampla gama de leukocinas que visam e interrompem a integridade da membrana dos leukócitos polimorfautornucleares (PMNs ou neutrófilos). Este protocolo descreve tanto a purificação de PMNs humanos quanto a quantificação da citotoxicidade de S. aureus contra PMNs em três seções diferentes. A seção 1 detalha o isolamento de PMNs e soro do sangue humano usando centrífuga de densidade. A Seção 2 testa a citotoxicidade de proteínas extracelulares produzidas por S. aureus contra esses PMNs humanos purificados. A Seção 3 mede a citotoxicidade contra PMNs humanos após a fagocitose de S. aureusvivos. Esses procedimentos medem a interrupção da integridade da membrana plasmática pmn por S. aureus leukocidins usando análise de citometria de fluxo de PMNs tratadas com iodeto propidium, um fluorofe de ligação de DNA que é membrana celular impermeável. Coletivamente, esses métodos têm a vantagem de testar rapidamente a citotoxicidade de S. aureus contra pmns humanos primários e podem ser facilmente adaptados para estudar outros aspectos das interações hospedógenas-patógenos.
Staphylococcus aureus é uma bactéria gram-positiva que causa um amplo espectro de doenças em seres humanos. Este patógeno proeminente produz inúmeros fatores de virulência que contribuem para diferentes aspectos da infecção. Estes incluem moléculas de superfície que permitem que S. aureus adere a diferentes tipos de tecido hospedeiro1,proteínas extracelulares que interferem com a resposta imune hospedeira2,e uma matriz de toxinas secretadas que têm como alvo diferentes tipos de células hospedeiras3. Neste relatório, descrevemos um método que quantifica a citotoxicidade das proteínas extracelulares produzidas por S. aureus contra os leukócitos polimorfóides humanos (PMNs ou neutrófilos), células efetivos primárias da resposta imune inata do hospedeiro.
Pmns são os leukócitos mais abundantes em mamíferos. Estas células imunes circulantes são rapidamente recrutados para o local do insulto do tecido hospedeiro em resposta aos sinais de perigo produzidos por células residentes ou por compostos exclusivos para micróbios invasores. A entrada extracelular dessas moléculas e de contatos diretos com células hospedeiras residentes ativadas durante a extravasation aumentam o estado de ativação de PMNs em um processo conhecido como priming4,5. Pmns preparados que atingiram o tecido angustiado, em seguida, executar importantes respostas imunes inatas destinadas a prevenir o estabelecimento de infecção. Estes incluem a ligação e internalização, ou fagocitose, de microorganismos invasores que desencadeia uma cascata de eventos intracelulares cumulando na destruição do micróbio por uma bateria de potentes compostos antimicrobianos5.
Pmns desempenham um papel essencial proteger os seres humanos de patógenos invasores e são particularmente importantes para prevenir a infecção por S. aureus 4. No entanto, esta bactéria produz uma ampla gama de genes de virulência que impedem diferentes funções de PMN. Estes incluem proteínas extracelulares que bloqueiam o reconhecimento de moléculas de sinalização, impedem a adesão ao tecido hospedeiro, inibem a produção de compostos antimicrobianos e comprometem a integridade da membrana plasmática4. S. aureus orquestra a expressão temporal desses genes de virulência através da entrada coletiva de múltiplos sistemas sensoriais de dois componentes que reconhecem pistas ambientais específicas. O sistema de dois componentes SaeR/S é um grande up-regulador da transcrição do gene de viulência de S. aureus durante a infecção6,7,8,9,10,11. Em particular, este sistema de dois componentes tem se mostrado fundamental para a produção de leukocinas bicomponentes que visam especificamente pmns humanos12.
Este protocolo é dividido em três seções diferentes. A primeira seção descreve a purificação de PMNs do sangue humano usando a centrífuga do gradiente da densidade usando um protocolo que seja adaptado dos métodos estabelecidos por Bøyum13 e por Nauseef14. A segunda e terceira seções detalham duas técnicas diferentes para examinar a citotoxicidade de S. aureus; um intoxica PMNs com proteínas extracelulares produzidas por S. aureus, enquanto o outro examina a capacidade de bactérias vivas para danificar PMNs após a fagocitose. Esses procedimentos usam o iodeto propidium para medir a perda da integridade da membrana plasmática da PMN causada por toxinas formadoras por pelose de S. aureus. O iodeto de propídio é um fluorofofóbico de ligação ao DNA que normalmente é impermeável à membrana celular, mas pode atravessar membranas plasmáticas que foram interrompidas por toxinas de S. aureus. A análise de citometria de fluxo permite que a quantificação rápida de PMNs positivos para iodide propidium meça a citotoxicidade relativa das cepas de S. aureus. S. aureus resistente à meticilina (MRSA) identificado como eletroforese de gel de campo pulsado tipo USA300 e um mutante de deleção isogênica de saeR/S nesta cepa (USA300ΔsaeR/S)têm sido usados como modelos para demonstrar como esses procedimentos podem quantificar a citotoxicidade de S. aureus contra PMNs humanos.
Este protocolo descreve a purificação de PMNs do sangue humano e dois ensaios distintos que usam o iodeto do propídio para quantificar a citotoxicidade de S. aureus de encontro a estas pilhas imunes inatas importantes. O sucesso desses procedimentos dependerá da qualidade das PMNs purificadas e da preparação adequada de S. aureus e proteínas extracelulares produzidas por esse patógeno. Para o isolamento das PMNs, é importante minimizar a ativação da PMN durante e após a purificação usando reagentes livres de contaminação por endotoxinas, tratando as preparações celulares suavemente e mantendo as células na temperatura adequada. Sinais que indicam ativação de PMNs incluem aglomeração de células durante a purificação e quando mais de 5% das células isoladas mancham positivo para iodeto propídio. Devido à vida útil relativamente curta das PMNs, essas células devem ser isoladas do sangue humano e testadas no mesmo dia. Pmns começará a exibir sinais de apoptose espontânea se deixado no gelo por mais de 3 h após a purificação. Como mencionado anteriormente, é muito importante que cada preparação pmn é cuidadosamente avaliada usando análise de citometria de fluxo de dispersão para a frente e lateral, bem como coloração de iodeto propídio para garantir a pureza e integridade das células isoladas.
A expressão de leukocinas bicomponentes por S. aureus é responsável pela maioria da integridade comprometida da membrana plasmática pmn que é observada usando os ensaios descritos neste protocolo. A variação na expressão dessas toxinas e outros peptídeos formadores de poros, como modulinas solúveis fenóis, entre cepas de S. aureus produzirá diferenças na citotoxicidade contra PMNs humanos. Desvios significativos durante o crescimento in vitro entre cepas de S. aureus também influenciarão a expressão de toxinas formadoras de poros e citotoxicidade subsequente. Além disso, a proporção de S. aureus para PMNs em ensaios de fagocitose tem um grande impacto na permeabilidade subsequente da membrana plasmática pmn (Figura 3A)e esses experimentos exigem a colheita consistente de concentrações iguais de cada cepa S. aureus testada em fase de crescimento mid-exponencial usando o OD600 de bactérias subculturas. Dadas essas considerações, é muito importante definir curvas de crescimento para todas as cepas que serão examinadas antes de iniciar ensaios de citotoxicidade. Não recomendamos esses métodos para analisar a citotoxicidade de S. aureus com cepas que apresentam diferenças significativas de crescimento in vitro.
EUA300 é um isolado MRSA virulento que é conhecido por ser altamente citotóxico contra PMNs humanos15 ea perda de SaeR / S nesta estirpe reduz drasticamente a transcrição de inúmeros bi-componente leukocidins que visam PMNs humanos6,12, tornando essas cepas modelos ideais para comparar a citotoxicidade usando os ensaios descritos. No entanto, há uma extensa variação genética entre diferentes isolados de S. aureus e os parâmetros detalhados nesses protocolos podem não resultar em mudanças substanciais na citotoxicidade contra PMNs humanos ao testar outras cepas de S. aureus. Adaptação das condições de crescimento, volumes de supernatantes adicionados, ou proporção de bactérias para PMNs pode ser necessária para o sucesso com estes métodos usando outras cepas de S. aureus.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Bolsas de Saúde nih-1R56AI135039-01A1, 1R21A128295-01, U54GM115371, bem como fundos da Montana State University Agriculture Experiment Station, e uma concessão de equipamentos da Murdock Charitable Trust Trust .
0.9% Sodium Chloride Injection, USP, 500 mL VIAFLEX Plastic Container | Baxter | 2B1323Q | PMN purification |
1.5 mL micro-centrifuge tubes with Snap Caps | VWR | 89000-044 | Used in washing cells |
1.8% Sodium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | S5150 | PMN purification |
12x75mm Culture tubes | VWR | 60818-430 | Used as flow cytometry tubes |
20% (w/w) Dextran | Sigma-Aldrich | D8802 | PMN purification |
3125 Hand Tally Counter | Traceable Products | 3125CC | For counting cells |
50 mL conical centrifuge tubes | VWR | 89039-656 | For dispensing media |
Bacto Tryptic Soy Broth, Soybean-Casein Digest Medium | FischerScientific | 211823 | For growing cell cultures |
BD Disposable Syringes with Luer-Lok Tips, 3 mL | FischerScientific | BD 309657 | For filtering supernatants |
Bright-Line Hemocytometer | Sigma-Aldrich | Z359629 | Cell counting apparatus |
DPBS, 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) with calcium and magnesium | Corning | 21-030-CV | Used in washing cells |
Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 17-1440-02 | PMN purification |
Fisherbrand Sterile Polystyrene Disposable Serological Pipets | FischerScientific | 13-678-11E | For aspirating liquid |
Greiner CELLSTAR 96 well plates | Millipore Sigma | M0687 | Plate for holding experimental samples |
OMICRON Syringe Filters | Omicron Scientific | SFPV13R | For filtering supernatants |
Propidium iodide | ThermoFisher Scientific | P3566 | Membrane impermeable DNA stain |
PYREX Brand 4980 Erlenmeyer Flasks | Cole-Parmer | EW-34503-24 | For growing cell cultures |
RPMI 1640, 1X without L-glutamine, phenol red | Corning | 17-105-CV | Used in resuspending cells |
Sterile Water for Irrigation, USP | Baxter | 2F7113 | PMN purification |
The Pipette Pump | Bel-Art Products | F37898 | For aspirating liquid |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | Membrane integrity positive control |