Her leverer vi protokoller til at udføre tre simple skade-induceret axon degeneration (axon død) analyser i Drosophila melanogaster at evaluere morfologiske og funktionelle bevarelse af afhuggede axoner og deres synapser.
Axon degeneration er en fælles funktion i neurodegenerative sygdomme, og når nervesystemet er udfordret af mekaniske eller kemiske kræfter. Men vores forståelse af de molekylære mekanismer, der ligger til grund for axondegeneration, er fortsat begrænset. Skade-induceret axon degeneration tjener som en simpel model til at studere, hvordan afhuggede axoner udføre deres egen demontering (axon død). I løbet af de seneste år er en evolutionært bevaret axon død signalering kaskade blevet identificeret fra fluer til pattedyr, som er nødvendig for den separerede axon at degenerere efter skade. Omvendt, svækket axon død signalering resulterer i morfologiske og funktionelle bevarelse af afhuggede axoner og deres synapser. Her præsenterer vi tre enkle og nyligt udviklede protokoller, der giver mulighed for observation af axonal morfologi, eller axonal og synaptisk funktion af afhuggede axoner, der er blevet afskåret fra den neuronale cellekroppen, i frugtfluen Drosophila. Morfologi kan observeres i vingen, hvor en delvis skade resulterer i axon død side om side af uskadte kontrol axoner inden for samme nerve bundt. Alternativt kan axonal morfologi også observeres i hjernen, hvor hele nervebundtet gennemgår øksedød udløst af antennal ablation. Funktionel bevarelse af afhuggede axoner og deres synapser kan vurderes ved en simpel optogenetisk tilgang kombineret med en post-synaptisk grooming adfærd. Vi præsenterer eksempler ved hjælp af en highwire tab-of-funktion mutation og ved over-ekstyrer dnmnat, begge i stand til at forsinke axon død i uger til måneder. Det er vigtigt, at disse protokoller kan bruges ud over skade; de letter karakteriseringen af neuronal vedligeholdelse faktorer, axonal transport, og axonal mitokondrier.
Den morfologiske integritet af neuroner er afgørende for vedvarende nervesystem funktion gennem hele livet. Langt størstedelen af det neuronale volumen tages af axoner1,2; således livslang vedligeholdelse af særligt lange axoner er en stor biologisk og bioenergisk udfordring for nervesystemet. Der er identificeret flere aksonale og glial-ydre støttemekanismer, der sikrer livslang aksonal overlevelse. Deres svækkelse resulterer i axon degeneration3, som er et fælles træk ved nervesystemet bliver udfordret i sygdom, og ved mekaniske eller kemiske kræfter4,5. De underliggende molekylære mekanismer for axondegeneration er dog stadig dårligt forstået i enhver sammenhæng, hvilket gør udviklingen af effektive behandlinger til at blokere axon tab udfordrende. Udviklingen af effektive behandlinger mod disse neurologiske tilstande er vigtig, da de skaber en enorm byrde i vores samfund6.
Skade-induceret axon degeneration tjener som en simpel model til at undersøge, hvordan afhuggede axoner udføre deres egen demontering. Opdaget af og opkaldt efter Augustus Waller i 1850, Wallerian degeneration (WD) er en paraply betegnelse, der omfatter to forskellige, molekylært adskillelige processer7. For det første, efter axonal skade, axoner adskilt fra deres celle organer aktivt udføre deres egen selvdestruktion (axon død) gennem en evolutionært bevaret axon død signalering kaskade inden for en dag efter skade8. For det andet, omkringliggende glia og specialiserede fagocytter engagere og rydde den resulterende axonal vragrester inden for tre til fem dage. Dæmpningen af axon dødssignalering resulterer i afhuggede axoner , der forbliver konserveret i uge9,10,11,12, mens dæmpningen af glial opgulfment kulminerer i axonal vragrester , der varer i ugevis in vivo13,14,15.
Forskning i fluer, mus, rotter og zebrafisk afslørede flere evolutionært bevarede og væsentlige mediatorer af axon død signalering8. Axon død mutanter indeholder afhuggede axoner og synapser, der undlader at gennemgå axon død; de forbliver morfologisk og funktionelt bevaret i ugevis, i mangel af cellekroppenstøtte9,10,12,13,16,17,18,19,20,21,22,23. Opdagelsen og karakteriseringen af disse mæglere førte til definitionen af en molekylær vej, der udfører axon død. Vigtigere er det, axon død signalering aktiveres ikke kun, når axon er skåret, knust eller strakt24,25; Det synes også at være en bidragyder i forskellige dyremodeller af neurologiske tilstande (f.eks. hvor axoner degenererer på en skadesuafhængig måde4, men med en række gavnlige resultater4,8). Derfor, forstå, hvordan axon død udfører axon degeneration efter skade kan tilbyde indsigt ud over en simpel skade model; Det kunne også være mål for terapeutisk intervention.
Frugtfluen Drosophila melanogaster (Drosophila) har vist sig at være et uvurderligt system til axon død signalering. Forskning i fluen afslørede fire væsentlige evolutionært bevarede axon død gener: highwire (hiw)11,14, dnmnat12,26, dsarm10 og axundead (axed)12. Ændringen af disse mediatorer – tab-of-funktion mutationer af hiw, dsarm og øksede,og over-udtryk for dnmnat – potent blokerer axon død for levetiden af fluen. Mens afhuggede vilde type axoner gennemgå axon død inden for 1 dag, afhuggede axoner og deres synapser mangler hiw, dsarm eller økse forbliver ikke kun morfologisk, men også funktionelt bevaret i uger. Om funktionel konservering også kan opnås gennem høje niveauer af dnmnat, der skal bestemmes.
Her vil vi præsentere tre enkle og nyligt udviklede protokoller til at studere axon død (f.eks morfologi og funktion af afhuggede axoner og deres synapser over tid) i mangel af celle krop støtte. Vi viser, hvordan svækket axon død resulterer i afhuggede axoner, som er morfologisk bevaret med en hiw tab-of-funktion mutation (hiw▲N), og hvordan svækket axon død resulterer i afhuggede axoner og synapser, der forbliver funktionelt bevaret i mindst 7 dage med over-udtryk for dnmnat (dnmnatOE). Disse protokoller giver mulighed for observation af individuelle axonale og synaptiske morfologi enten i det centrale eller perifere nervesystem (CNS og PNS, henholdsvis)13,14, mens den funktionelle bevarelse af afhuggede axoner og deres synapser i CNS kan visualiseres ved brug af en simpel optogenetisk opsætning kombineret med grooming som en adfærdsmæssig udlæsning12.
De protokoller, der er beskrevet her, giver mulighed for en robust og reproducerbar observation af morfologi samt funktionen af axoner og deres synapser adskilt fra deres cellelegemer i Drosophila. Vingeanalysen gør det lettere at observatione axondød side om side af uskadte kontrolaksoner i PNS14, mens antennal-analysen gør det lettere at observatione hele nervebundter af GFP-mærkede axoner og deres synapser for at vurdere både morfologi og funktion i hjernen (CNS)12. Der er kritiske skridt og visse fordele for hver tilgang til at studere morfologi, der skal tages i betragtning, når designe eksperimenter.
For at observere axon morfologi i PNS i vingen, kan eksperimenter let udføres, på grund af gennemsigtigheden af vingen: det gør det muligt at omgå dissektion og immunhistokemi. Men på grund af den manglende fiksering skal vingerne afbildes umiddelbart efter montering14. I øjeblikket anvendes der ofte to forskellige Gal4-drivere, enten ok371Gal4 eller dpr1Gal4, og begge referencer tilbyder forskellige tilgange til kvantificering af degeneration14,26. Sparse mærkning af et par neuroner anbefales, ved hjælp af “Mosaic Analyse med en repressible Cell Marker (MARCM)”14,31, som opløsningen af axonal morfologi er uden fortilfælde. I modsætning hertil er observation af synapser ikke muligt i vinger, de er placeret i ventrale nerveledning inde i brystkassen af fluerne. Desuden kan yderligere axonale markører ikke visualiseres ved immunhistokemi: den voksagtige kutikel gør det umuligt for diffusion af fiksatorer og antistoffer i det underliggende væv.
For at observere axon og synapse morfologi i CNS, hjerne dissektioner skal udføres. De giver den fordel at visualisere yderligere axonale og synaptiske markører ved hjælp af immunhistokemi, og synapser kan observeres sammen med axoner i samme synsfelt10,13. En stor samling af karakteriseret olfaktoriske receptor neuron (ORN) Gal4 drivere er let tilgængelige32, og ofte, OR22aGal4 er føreren af valg. For antenneablation er cellekroppe af OR22a neuroner anbragt i 3rd segmentet (Figur 2B). Der anvendes en fluorescensintensitetsbaseret kvantificering til kvantificering af degenerationen af enten axoner eller synapser13. Omvendt, eksperimenter er tidskrævende på grund af hjernendissektion og antistof farvning.
At visualisere axonal og synaptisk funktion efter axotomy, optogenetics bruges til at udløse antennal grooming: det tjener som en udlæsning for funktionel bevarelse af afhuggede axoner og deres synapser12. Plejekredsløbet og de tilhørende sensoriske, inter- og motorneurongal4-førere er blevet grundigt beskrevet29,,30. GMR60E02Gal4 etiketter en delmængde af Johnston’s orgel (JO) sensoriske neuroner, som er nødvendige og tilstrækkelige til grooming29,30. For antenneablation er cellekroppe af JO neuroner anbragt i detandet antennesegment (Figur 2B). En optogenetisk opsætning kan let bygges fra bunden, eller en eksisterende opsætning justeret. Det er vigtigt, at eksperimenter skal udføres i et mørkt rum, og flyver således visualiseret med en infrarød (IR) LED spotlight. Når du bruger CsChrimson som en kanal, er det afgørende at forsyne maden med alle trans-retinale og en rød LED spotlight for at aktivere JO neuroner29. Alternativt kan blå lysfølsomme kanaler og et blåt LED-spotlight eller TrpA1-kanalen og -temperaturen bruges til neuronal aktivering29,33. Kvantificeringen af grooming adfærd er allerede blevet beskrevet12,29.
Når disse analyser anvendes til specifikt at studere axon død, er det vigtigt at bemærke, at fænotypen af morfologisk eller funktionel konservering bør være robust over tid. Der er tilfælde, hvor axon død fører til en konsekvent endnu mindre udtalt fænotype i morfologisk konservering34,35, og om en sådan fænotype udmønter sig i funktionel konservering er endnu ikke fastlagt.
Axon død fænotyper er også blevet observeret i neuroner under udviklingen af Drosophila larver, hvor nerver blev knust i stedet for såret11,23. Her fokuserede vi specifikt på voksne Drosophila neuroner, som afsluttede udviklingen. I denne sammenhæng kan brugen af RNA-interferens36eller vævsspecifik CRISPR/Cas937 let implementeres. Vigtigere er det, kan ovennævnte teknikker anvendes i en axon død uafhængig sammenhæng: de letter karakterisering af neuronal vedligeholdelse faktorer38, axonal transport39, aldersafhængige axonal mitokondrier ændringer40, og morfologi af axonal mitokondrier41.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke hele Neukomm lab for bidrag. Dette arbejde blev støttet af en swiss National Science Foundation (SNSF) adjunktpris (tilskud 176855), Den Internationale Fond for Forskning i Paraplegi (IRP, tilskud P180), SNSF Spark (tilskud 190919) og af støtte fra Universitetet i Lausanne og Institut for Grundlæggende Neurovidenskab (État de Vaud) til LJN.
Tweezers (high precision, ultra fine) | EMS | 78520-5 | Antennal ablation |
MicroPoint Scissors (5-mm cutting edge) | EMS | 72933-04 | Wing injury |
1.5 mL microcentrifuge tube | Eppendorf | 30120086.0000 | |
35mm tissue culture dish | Sarstedt | 83.3900 | |
Cover Slips, Thickness 1 | Thermo Scientific™ | BB02400600A113MNT0 | |
Superfrost Microscope Slides | Thermo Scientific™ | AA00008032E00MNT10 | |
High-Sensitivity USB 2.0 CMOS Camera, 1280 x 1024, Global Shutter | Thorlabs | DCC1240M | Camera setup |
SM1 Retaining Ring for Ø1" Lens Tubes and Mounts | Thorlabs | SM1RR | |
25mm 1/1.2" C mount Lens | Tamron | M112FM25 | |
Adapter with External M27 x 0.5 Threads and Internal SM1 Threads | Thorlabs | SM1A36 | |
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
Ø25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 700 nm | Thorlabs | FELH0700 | |
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
SM1 Lens Tube Without External Threads, 1" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M10 | |
850 nm, 900 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA | Thorlabs | M850L3 | IR LED spotlight |
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
SM1 Lens Tube Without External Threads, 2" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M20 | |
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
Ø25.0 mm Premium Longpass Filter, Cut-On Wavelength: 850 nm | Thorlabs | FELH0850 | |
SM1 Retaining Ring for Ø1" Lens Tubes and Mounts | Thorlabs | SM1RR | |
660 nm, 940 mW (Min) Mounted LED, 1200 mA | Thorlabs | M660L4 | Red LED spotlight |
Aspheric Condenser Lens, Ø25 mm, f=20.1 mm, NA=0.60, ARC: 650-1050 nm | Thorlabs | ACL2520U-B | |
SM1 (1.035"-40) Coupler, External Threads, 0.5" Long | Thorlabs | SM1T2 | |
SM1 Lens Tube Without External Threads, 2" Long, Two Retaining Rings Included | Thorlabs | SM1M20 | |
15 V, 2.4 A Power Supply Unit with 3.5 mm Jack Connector for One K- or T-Cube | Thorlabs | KPS101 | LED control |
T-Cube LED Driver, 1200 mA Max Drive Current | Thorlabs | LEDD1B | |
150 mm x 300 mm x 12.7 mm Aluminum Breadboard, M6 Double-Density Taps | Thorlabs | MB1530/M | Mount base |
Ø12.7 mm Universal Post Holder, Spring-Loaded Locking Thumbscrew, L = 75 mm | Thorlabs | UPH75/M | Mount, 3x (IR LED, red LED, cam) |
Ø1.20" Slip Ring for SM1 Lens Tubes and C-Mount Extension Tubes, M4 Tap | Thorlabs | SM1RC/M | |
Ø12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 150 mm | Thorlabs | TR150/M | |
Ø12.7 mm Optical Post, SS, M4 Setscrew, M6 Tap, L = 40 mm | Thorlabs | TR40/M | |
Right-Angle Clamp for Ø1/2" Posts, 5 mm Hex | Thorlabs | RA90/M | |
M6 x 1.0 Stainless Steel Cap Screw, 16 mm Long, Pack of 25 | Thorlabs | SH6MS16 | screws for mount onto base |
USB-6001 14-Bit 20 kS/s Multifunction I/O and NI-DAQmx | National Instruments | 782604-01 | Red LED spotlight controller |
20k Ohm 1 Gang Linear Panel Mount Potentiometer | TT Electronics/BI | P230-2EC22BR20K | fintuner for indicator |
IR (860nm) emitter, 100 mA radial | Osram | 475-1365-ND | Red light indicator |
cable | – | – | Misc |
All-trans retinal | Sigma | R2625 | |
Ethanol absolute | Vwr | 20821.296 | |
Halocarbon Oil 27 | Sigma | H8773 | |
Mowiol | Merk | 81381 | |
Paraformaldehyde | Sigma | F8775 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | P5493 | |
Sylgard 184 silicone elastomer base | Dow Corning Corp | 4019862 | |
Sylgard 184 silicone elastomer curing agent | Dow Corning Corp | 4019862 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Chicken anti-GFP antibodies | Rockland | 600-901-215 | Antibodies |
Goat Dylight anti-Chicken | Abcam | ab96947 | |
FM7a, B | BDSC | RRID:BDSC_785 | X chromosome |
FRT19A[hs-neo] | BDSC | RRID:BDSC_1709 | |
hiw[ΔN] | BDSC | RRID:BDSC_51637 | |
hs-FLP[12] | BDSC | RRID:BDSC_1929 | |
tub-Gal80[LL1] | BDSC | RRID:BDSC_5132 | |
w[1118] | BDSC | RRID:BDSC_3605 | |
20xUAS-IVS-CsChrimson::mVenus | BDSC | RRID:BDSC_55135 | 2nd chromosome |
5xUAS-Gal4[12B] | Kyoto | RRID:Kyoto_108492 | |
5xUAS-HA::dnmnat | BDSC | RRID:BDSC_39702 | |
5xUAS-mCD8::GFP[LL5] | BDSC | RRID:BDSC_5134 | |
ase-FLP[2d] | Freeman laboratory | Neukomm et al., 2014 (PNAS) | |
CyO | BDSC | RRID:BDSC_2555 | |
dpr1-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_25083 | |
OR22a-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_9952 | |
ey-FLP[6] | BDSC | RRID:BDSC_5577 | 3rd chromosome |
GMR60E02-Gal4 | BDSC | RRID:BDSC_39250 | |
TM3,Sb,e | BDSC | RRID:BDSC_3644 |