שימוש בביודיו מרובה שכבות ביוריטינג תלת מימדי להפצת תאים הומוגניות
Summary
כאן, התחלנו לפתח אסטרטגיה בעלת שכבות מרובה שכבתית עבור ביודיו נוזליים (ג’לטין מתיונין עם צמיגות נמוכה) כדי למנוע שכבות של תאים שעברו כימוס.
Abstract
במהלך תהליך הביוריטינג התלת מימדי המבוסס על שחול, ביודיו נוזלי כמו בצמיגות נמוכה יכול להגן על תאים מפני נזק ממברנה הנגרמת על ידי מתח הטיה ולשפר את ההישרדות של התאים שעברו אנקפסולציה. עם זאת, השימוש המהיר בתא מונחה הכבידה במאגר עלול להוביל להפצת תאים לא הומוגנית במבנים ביולוגיים ולכן לעכב את היישום של ביודיו נוזלי כמו. כאן, פיתחנו הרומן שונה בשכבות שעברו שינוי מרובה לצבעי ביודיו נוזליים (לדוגמא, ג’לטין מתיונין עם צמיגות נמוכה) כדי למנוע שכבות של תאים שעברו כימוס. ממשקים נוזליים מרובים היו מניפולציות בביודיו רב שכבתי כדי לספק שמירה בין פנים. כתוצאה מכך, פעולת שכבות התא החוצה את השכבות הסמוכות במערכת מרובת השכבות הייתה מפגרת במאגר הביודיו. נמצא כי החזקת הפנים היה גבוה בהרבה מאשר משיכה שיתוק של תאים, הוכחת תפקיד קריטי של החזקת הפנים במניעת משקעי תאים וקידום פיזור הומוגנית יותר של תאים בביודיו רב שכבתית.
Introduction
תלת מימדי (3d) ביובריטינג כבר שיטה מבטיחה לייצר העתקים אדריכליים ופונקציונליים מורכבים של רקמות מקוריות בביואבריציה ורפואה רגנרטיבית1,2,3. האסטרטגיות הנפוצות של ביובריטינג, כולל הזרקת דיו, שחול והדפסה סטריאואוליתוגרפיה, יש יתרונות וחסרונות מזוויות שונות4. בין טכניקות אלה, הליך ההבלטה הוא הנפוץ ביותר בשל העלות שלה-יעילות. Bioink משחק תפקיד מרכזי ביציבות התהליך של ביוריטינג שחול. תאים ביודיו האידיאלי לתא לאדן לא צריך רק להיות תואם ביולוגי אלא גם להיות מתאים תכונות מכניות5. ביודיו עם צמיגות נמוכה מוצגים בדרך כלל כמצב של נוזל. אלה ביודיו יכול להיות בקלות ובמהירות הופקד ולהימנע נזק קרום התא הנגרמת על ידי מתח גזירה גבוהה במהלך שחול. עם זאת, במקרים מורכבים המחייבים תקופות הדפסה ארוכות טווח, צמיגות נמוכה מעניקה לעתים קרובות את הפיזור הבלתי נמנע של התאים שעברו אנקפסולציה במאגר bioink, אשר מונע בדרך כלל על ידי כוח הכבידה ומוביל לפיזור התאים הומוגנית בביודיו6,7. כתוצאה מכך, ביודיו עם תא בלתי הומוגנית מפזר הסלים ביופסיה של מבחנה של מבנה רקמות פונקציונלי.
מספר מחקרים שנעשו לאחרונה התמקדות בביודיו דיווחו על הקידום של מפזרים הומוגניים של תאים שעברו אנקפסולציה. שונה מאוד bioink מבוסס על הקשר בשלב כפול שימש ביובריטינג שחול8. פולימר קילוף פלסטיצידיות שונה עם פפטידים וחלבונים במחקר זה. תאים הציגו התפלגות הומוגנית יותר זה קילוף פלסטיצידיות שונה מאשר בשימוש נפוץ קילוף פלסטיצידיות בשל הקבצים המצורפים שסופקו על ידי הפפטידים ואת החלבונים. לחילופין, משתמשים בביודיו מעורבים כדי לפתור את השקעי התאים בביודיו. ביודיו ממוזג המכיל פוליאתילן גליקול (יתד) ו ג’לטין או ג’לטין מתיונין (GelMA) עם חוסן מכני משופר שימש במחקר אחר9. התאים שעברו אנקפסולציה הציגו התפלגות הומוגנית בעיקר בגלל צמיגות של הביודיו הממוזג השתפר. באופן כללי, ישנם מספר גורמים המשפיעים על מפזר התאים שעברו אנקפסולציה בביודיו, כגון צמיגות של הביודיו, חומרת התאים, צפיפות התאים, ומשך תקופת העבודה. בין הגורמים הללו, חומרת התאים ממלאת תפקיד קריטי בקידום משקעי הזרע. הציפה והחיכוך המסופקים על ידי הביודיו הצמיו נחקרו ככוחות העיקריים נגד כוח הכבידה עד כה10.
כאן, פיתחנו אסטרטגיה הרומן לקדם מפזרים הומוגנית של התאים שעברו אנקפסולציה בביודיו על ידי מניפולציה ממשקים נוזליים מרובים במאגר bioink. אלה ממשקים נוזליים שנוצרו על ידי שינוי רב שכבתית של bioink לא יכול רק לספק שמירה בין פנים, אשר מפגרים משקעי התאים, אלא גם לשמור על תאימות ביוולוגית מתאימה התנהגות rheological של bioink. בפועל, אנו שינו פתרון GelMA מימית (5%, w/v) עם המשי פיברוב (SF) בצורה רב שכבתית כדי longitudinally לייצר ארבעה ממשקים, מתן מתחים הפנים ב bioink ממוזג. כתוצאה מכך, הטעינה של כוח הכבידה על התאים היתה היסט על ידי המתח הפנימי שנעשו על ידי אדם, ופיזור הומוגנית כמעט של התאים שעברו כדוריות בביודיו הושג עקב משקעי פחות על פני השכבות הסמוכות של התאים. לא קיים פרוטוקול דומה להאטת הששבש של תאים שעברו אנקפסולציה על-ידי טיפול בשמירה על הפנים בצבעי ביודיו נוזליים שדווחו עד כה. אנחנו מציגים את הפרוטוקול שלנו כאן כדי להדגים. דרך חדשה לפתור משקעי תאים בביוניטינג
Protocol
Representative Results
Discussion
היציבות של המערכת הרב-שכבתית היא נקודת מפתח לביצוע פרוטוקול זה בהצלחה. באופן תיאורטי, הצלחנו לחשב את הדיפוזיה של מולקולות SF בפתרון GelMA המבוסס על המחקר של נאומן13. התגלה כי הפצת החלבונים בתמיסה קשורה למשקל המולקולרי שלהם. המשקל המולקולרי הממוצע (MW) של סרום של שור (bsa) הוא 66.5 kda, ומק?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מאשרים מענקים מקרן סין הלאומית למדעי הטבע (81771971, 81970442, 81703470 ו 81570422), לאומי מפתח R & D תוכנית של סין (2018YFC1005002), המדע והטכנולוגיה הנציבות של עיריית שנגחאי (17JC1400200), שנגחאי העירוני מדע וטכנולוגיה פרויקט מרכזי (גרנט No. 2017SHZDZX01), ועדת החינוך העירוני של שנגחאי (תוכנית חדשנות 2017-01-07-00-07-E00027)
Materials
| 2-Hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone (PI2959) | TCI | M64BK-QD | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES) | Gibco | 15630080 | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Gibco | 10569044 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 10091 | |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | V900863MSDS | |
| Methacrylic anhydride (MA) | Sigma-Aldrich | 276685MSDS | |
| Penicillin–streptomycin antibiotics | Gibco | 15140163 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Gibco | 10010049 | |
| Silk fibroin | Advanced BioMatrix | 5154 |
References
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nature Protocol. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Heinrich, M. A., et al. 3D bioprinting: from benches to translational applications. Small. , 1805510 (2019).
- Daniela, L., et al. Functionalization, preparation and use of cell-laden gelatin methacryloyl-based hydrogels as modular tissue culture platforms. Nature Protocols. 11 (4), 727-746 (2016).
- Pedde, R. D., et al. Emerging biofabrication strategies for engineering complex tissue constructs. Advanced Materials. 29 (19), (2017).
- Holzl, K., Lin, S., Tytgat, L., Van Vlierberghe, S., Gu, L., Ovsianikov, A. Bioink properties before, during and after 3D bioprinting. Biofabrication. 8 (3), 032002 (2016).
- Guillotin, B., Guillemot, F. Cell patterning technologies for organotypic tissue fabrication. Trends in Biotechnology. 29 (4), 183-190 (2011).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32, 773-785 (2014).
- Dubbin, K., Hori, Y., Lewis, K. K., Heilshorn, S. C. Dual-stage crosslinking of a gel-phase bioink improves cell viability and homogeneity for 3D bioprinting. Advanced Healthcare Materials. 5 (19), 2488-2492 (2016).
- Rutz, A. L., Hyland, K. E., Jakus, A. E., Burghardt, W. R., Shah, R. N. A multimaterial bioink method for 3D printing tunable, cell-compatible hydrogels. Advanced Materials. 27 (9), 1607-1614 (2015).
- Chahal, D., Ahmadi, A., Cheung, K. C. Improving piezoelectric cell printing accuracy and reliability through neutral buoyancy of suspensions. Biotechnology and Bioengineering. 109 (11), 2932-2940 (2012).
- Chen, N., et al. Hydrogel bioink with multilayered interfaces improves dispersibility of encapsulated cells in extrusion bioprinting. ACS Applied Materials & Interfaces. 11, 30585-30595 (2019).
- Zhu, K., et al. A general strategy for extrusion bioprinting of bio-macromolecular bioinks through alginate-templated dual-stage crosslinking. Macromolecular Bioscience. 18 (9), 1800127 (2018).
- Nauman, J. V., Campbell, P. G., Lanni, F., Anderson, J. L. Diffusion of insulin-like growth factor-I and ribonuclease through fibrin gels. Biophysical Journal. 92 (12), 4444-4450 (2007).
